Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), 3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. 6 mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları 1. Başlangıçta Naal ve ark. 1 tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir.

Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan 7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu 2 etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon 12280 = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.

Introduction

Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser 13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku 15 bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler 15 olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları 15 başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları.

Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve 17 için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI 17 toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre 18 içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri "çapraz bağlama" O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu 15 neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı 20'ye önce adımlar atlar hücre zarı 19 üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum 20 sinyal.

Degranülasyon histamin 6 yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, 1 dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri 21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta 21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu "Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. 1 tarafından geliştirilen ve bize 2 tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil 3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir.

Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları 23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS'nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz 25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM 24 kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda 27-29 ve nehir ve akarsu 30 saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. 27 TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri 31-37 emilir. Queckenberg ve ark. 37 mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk.

TCS insan alerjik deri hastalığı 7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma 38 bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri 2 için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. 2 TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. 39 ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi.

Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu 40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, 2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler 51 yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. 52 ve diğerleri 53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu 2 sonike göstermiştir. % 0.24 'den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation 54,55-örnekler toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri.

Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. 51 yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler 50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir.

Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS 2 çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı ile 280 nm 58 de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var.

Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm tampon tarifleri protokol metnin sonunda bir tabloya dahil unutmayın.

1. GÜN:

1. Hücrelerinin Hazırlanması

  1. Kenar etkileri önlemek için düzen üzerinde test örnekleri merkezleme, 96 plaka kurulum düzeni dışarı planlayın. Ayırma her biri üç adet TCS konsantrasyonu test edilen (antijen ya da iyonoforun ± degranülasyonu uyarıcı), hem de standart hatası spontan salım için (Resim degranülasyonu uyarıcı), maksimum salım (% 0.2 Triton X-100 [TX] deterjan lizis), yanı sıra için çoğaltır kuyu arka plan örnekleri (hiçbir hücre içerecek olan) için ayrılmıştır. Her çoğaltmak deneysel gün için, TCS örnek konsantrasyonlarının yeni bir randomize düzen seçin.
  2. 37 ° C su banyosunda sıcak RBL medya (tarifi tabloda yer) ve tripsin.
  3. Iyi iyileşmek genel belirtileri için T-25 balonuna RBL hücreleri (2-4 son kabulünden bu yana gün ve çözülmüş bu yana 3-4 ay veya daha kısa) kontrol edininci: Uygun medya renk ile gösterilir pH ve bulutluluk eksikliği. Balonun kirlenme ücretsiz olduğunu ve hücreler, düzgün birleşik sağlıklı görünen ve daha çok bağlı olduğunu onaylamak için bir ışık mikroskobu altında şişesi yerleştirin. Hücreleri mycoplasma kirlenme yaklaşık her altı haftada 22 kontrol edilmelidir unutmayın.
Tedavi Triplicates
Uyarılmış, 0 mcM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Uyarılmış, 0.001 mcM TCS F6, G6, H6
Uyarılmış, 0.1 mcM TCS A4, B4, C4-
Uyarılmış, 1 mcM TCS A6, B6, C6
Uyarılmış, 5 mcM TCS F5, G5, H5
Uyarılmış, 10 mcM TCS A3, B3, C3-
Uyarılmış, 15 mcM TCS A5, B5, C5
Uyarılmış, 20 mcM TCS G7 F7, H7
Uyarılmış, artı yüksek [TCS] F3, G3, H3
Spontan, yok TCS (alay içerir) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, E10 D12, E11, E12
Hayır Hücreler, Arka Plan, artı yüksek [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

Şekil 1
Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

  1. Steril doku kültürü (TC) kaput içine RBL hücre şişesi alın. Hücreler, bot eklibalonun tom. TC başlık altında Çalışma ve standart steril tekniği kullanarak, steril pipet ile şişesi tüm ortamları çıkarın, hücrelerin balonun altına bağlı kalır. Daha sonra, 2 ml tripsin ile teçhiz durulayın, sonra bu yıkama atın.
  2. Balonun alt kapağı tam olarak 2 ml tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca ° C inkübatör hücrelerin şişenin alt ayırmak için izin vermek için 37 içine koyun.
  3. 5 dakika sonra, hücreler gevşetmek için açık bir avuç içi ile şişenin yan çarptı. Hemen, şişeyi kapalı hücreler yıkamak için 18 ml RBL medya ekleyebilir ve tripsin gidermek için. Hemen balonun dışında hücre-medya-tripsin karışımı almak ve yeni, steril 50 ml tüp (bu tüp içinde toplam hacmi şimdi 20 ml) transfer.
  4. Yavaşça ama iyice karıştırıldıktan sonra, bu tüpten hücre süspansiyonu 50 ul kaldırmak ve sayılacak bir örnek bir 1.5 ml steril mikrosantrifüj tüp, transfer. Bu örnek almak, hem de 50 mi0, masa üstü için TC kaput hücre-medya-tripsin karışımı dışarı içeren tüp.
  5. 500 xg 8 dakika santrifüj 50 ml tüp (uygun bir denge ile) Spin, bu güç pelet hücreleri etkili.
  6. Sıkma sırasında, iplik önce izole edilmiştir numunedeki hücrelerin sayısı. Bunu yapmak için, ilk 1.5 ml tüp hücrelerin 50 ul tripan mavi boya 50 ul ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın aşağı 5x kadar pipet ve. Hemen, cam hematositometre bu karışımı 10 ul transferi ve üretici talimatları izleyerek ızgara alanda hücreleri saymak. Makul istatistiksel sonuçlar için en az 100 hücreleri saymak.
  7. Geri TC kaputu, santrifüj edildi hücrelerinden süpernatant kaldırmak.
  8. Hücre Tüp kap ve hücreler gevşetmek için tüpün alt pelet hafifçe vurun.
  9. Hücre Sayısı göre 0.5 x 10 6 hücre / ml bir yoğunluğa vermek üzere tripsinize edilmiş hücre ortam ekleyin. Kaplama işlemi sırasında askıya hücreleri tutmak için iyi ama yavaşça karıştırın. Bir Pipetman kullanarak, plaka şablonu sayfasını uygulayarak, bir 96-plaka (düz, siyah alt) içinde / iyi 100 ul hücreleri koydu. Hücreler üç oyuğun her resim grubu sonra sistematik hata ve karışmaması için oyuklara ilave edilir nasıl Rastgele eklenir. Arka plan örnekleri için etiketli kuyulara hücreleri koymak emin olun.
  10. Bir kez tüm hücreleri devredilmiştir, plaka üzerine plaka kapak yerleştirin ve gece boyunca (37 ° C /% 5 CO 2) inkübatör transfer. Standart steril teknik takip temizleyin.

2. GÜN:

2. Triklosan hazırlanması

  1. Etiketli bir 500 ml Erlenmeyer şişesi içine dereceli bir silindir, ölçü 250 ml Tyrodes Tampon (tarifi tabloda verilen) kullanarak "TCS-tampon." Bar karıştırın ekleyin. TCS ile kullanım için belirlenen bar, termometre karıştırın, cam kullanın.
  2. Ayrıca bu zamanda, ölçü 250ayrı bir 500 ml Erlenmeyer şişesi içine ml Tyrodes, etiketli "kontrol tampon." Kullanım cam, bar, TCS için belirlenmiş DEĞİLDİR termometre karıştırın. Bar karıştırın ekleyin.
  3. TCS granül 0.0022 g tartılır ve "ASR-tampon" balon (250 ml Tyrodes Tampon içeren) transfer. Verimli Erlenmeyer şişesi için granül transfer etmek için, tüm TCS devredilmiştir emin, tekne tartmak yıkayın ölçülen 250 ml Tyrodes 10 ml kullanın.
  4. Yer "TCS-tampon" bir arada ocak / manyetik heyecan plaka üzerine şişesi ve bir idare edilebilir yüksek hızda karıştırmaya ayarlayın. Bir kez de karışık, bu TCS hisse senedi nominal 30 mcM (gerçek konsantrasyon ısıtma sonra hesaplanacaktır) olacaktır. (Kimyasal bir davlumbaz tüm karıştırma yapın.)
    1. Ayrıca şu anda, ikinci bir arada ocak / manyetik heyecan plaka üzerine "kontrol tampon" şişesi (yok TCS içeren) yerleştirin, ve benzer bir hızda karıştırın ayarlayın.
  5. Daha sonra kullanmak için lamba ısınmak için UV / Vis Lamba açın.
  6. Sürekli karıştırarak 50 ° C "TCS-tampon" çözüm ısıtın. Kurulduğunda 90 dakika için sıcaklık, zaman. 90 dakika boyunca, genellikle 50 ° C sıcaklık ve uygun bir karıştırma hızı izlemeye devam eder.
    1. Aynı zamanda, C sürekli karıştırma ile 50 "kontrol tamponu" çözeltisi (düz Tyrodes tamponu 250 ml olan) ısıtın. 50 ulaştıktan sonra süre, sıcaklık (50 ° C 'de tutarak) ve karıştırma izlenir ikisi boyunca ° C, 90 dakika boyunca zamana bağlıdır.
  7. 90 dakika sonunda, sıcak tabak ve masa üstü transfer kapalı Erlenmeyer şişeleri de alabilir.
  8. Boş makine ısıtmalı "ASR-tampon" çözüm 1 ml taramadan önce ısıtılmış "kontrol tampon" çözüm 1 ml üzerinde, bir UV / Vis spektrofotometre üzerinde dalgaboyu tarama işlevini kullanma. Bir, spektrumun şeklini kontrol280 nm d kayıt Absorbans değeri. Konsantrasyonunu belirlemek için, Beer-Lambert denklemi kullanarak (A 280 = ε 280 ℓ c) ε kullanılarak 4200 280 L / mol / cm 12 ve 1 cm ℓ.
  9. TCS konsantrasyonunun saptanmasından sonra, ekleme 0.249 g sığır (BSA), "TCS-tampon" çözeltinin geri kalan 249 ml ve iyice karıştırın serum albümini.
    1. Aynı zamanda, "kontrol tampon" çözüm geri kalan 249 ml 0,249 g BSA ekleyin ve iyice karıştırın.

2. GÜN:

3. RBL-2H3 hücreleri kullanarak antijen uyarımlı Degranülasyon Deneyi

  1. Başlamadan önce, kullanılan tüm tamponların pH kontrol ve bulutlu açık ve değil emin olun: Bu Tyrodes tampon, sodyum asetat tamponu ve glisin karbonat tamponu (tarifleri tabloda yer) içerir.
  2. 37 ° C su banyosunda sıcak RBL medya ve tripsin.
  3. BT (1 mg / ml yapmak0; uğratılmış Tyrodes tamponu BSA): 0.05 g BSA + 50 mi uğratılmış Tyrodes tamponu (x2). 37 ° C su banyosu içine koyun.
  4. Yap% 0.2 Triton X-100: BT 3.136 ml + 64 ul% 10 Triton X-100 (Triton X-100,% 0.2 son konsantrasyon). Tersine çevirerek iyice karıştırın, ancak girdap yok. 37 ° C su banyosu içine koyun.
  5. . TCS ve ısıtmalı Tyrodes tampon (adım "2," yukarıda) Not hazırlık başlar: "ASR-tampon" ve "kontrol tampon" çözümleri 50 ° C ve için karıştırın ulaşana kadar bir sonraki adıma (IgE maruz kalma) başlamayın 90 dakika ısı / karıştırma zaman ilk 70 dk.
  6. Her iki çözüm de 70 dakika boyunca 50 ° C'de karıştırıldı, bir kez (her çukura 100 ul /) duyarlı olması örnek kuyu RBL ortam içinde 0.1 ug / ml fare anti-DNP IgE (Sigma) oluşturur. 4 de saklandığında IgE stok 30 günden eski olmamalıdır ° C; hisse senedi ne kadar eski kayıt. Karıştırmak için Flick, ama girdap değil IgE yapmak.
  7. Bir TC Kaputun altında,50 ml'lik bir tüp içinde 6 ml RBL medyaya 0.6 ul IgE stok (stok 1 mg / ml 'dir) ekleyin. Ikinci bir 50 ml tüp içinde, sadece basit RBL ortam (nonsensitized örnekler için amaçlanan) 6 ml eklenir.
  8. Lavaboya 96-plaka (Gün 1 hazır olduğunu) tüm medya dökümü ve TC başlık altında plaka getirmek.
  9. Rastgele 100 ul medya / (48 kuyu toplam) teşvik edilmelidir kuyulara IgE karışımı ekleyin. Bu karışım "TX," ve "arka plan" örnekleri, "spontan" için tasarlanmamıştır.
  10. Rasgele sadece spontan "TX," "," ve "arka plan" kuyulara 100 ul düz RBL medya ekleyin.
  11. Plaka üzerinde plaka kapağı yerleştirin ve sonra 1 saat 2/37 ° C inkübatör% 5 CO içine plaka taşıyın.
  12. 3,24-1 saat İnkübasyon sırasında, adımları 3.13 izleyin.
  13. Masa üstü, antijen dilüsyonları hazırlamak. 1.6 mg / ml stok DNP-BSA + 850 ul & # 0.53 ul ekleyin160; BT 1 ug / ml 'lik bir antijen konsantrasyonu alır. Vortex ve karıştırmak için bu stok ters.
  14. Bir kez "TCS-tampon" ve "kontrol tampon" ısıtılmış ve sonra 50 90 dakika karıştırılır ° C, (adım 2.6 gidin - 2.8.1) TCS protokolü için hazırlık geri kalanı ile devam. Her iki çözüm de BSA içinde eritildi, sonra, aşağıda devam ediyor.
  15. ± Ag, ± TCS ile, pozlama tamponlar hazırlanmaya başlayacak. İlk olarak, "TCS-tampon" çözeltisi (önceden 90 dakika boyunca ısıtıldı ve oda sıcaklığında karıştırıldı edilmiş olan), yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml transfer 249 ml örnek. Bu 50 ml bir örnek 20 ul çıkarın ve 0.0004 mg / ml DNP-BSA nihai bir antijen konsantrasyonu için daha önce hazırlanan 1 ug / ml antijen 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters.
    1. Etiket bu "Tüp 1, Yüksek TCS / + Ag + / BT." Bu seyreltmeler ve en yüksek maruz kalma TCS konsantrasyon için kullanılır.
    2. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml tüp 50 ml aktarın. Bu yeni bir 50-ml bir örnek 20 ul çıkarın ve 0.0004 mg / ml DNP-BSA nihai bir antijen konsantrasyonu için daha önce hazırlanan 1 ug / ml antijen 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters.
      1. Etiket bu "Metro 2, No TCS / + Ag + / BT". TCS seyreltme ve 0 mcM TCS konsantrasyon maruz kalma için kullanılır.
    3. Şimdi "TCS-tampon" çözüm 50 ml almak ve başka bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş. Bu yeni 50-ml kısım 20 ul çıkarın ve düz BT 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters. Resim antijen eklenir.
      1. Bu "Metro 3, Yüksek TCS / No Ag / + BT." Bu arka plan için kullanılır. Etiket
    4. Başka bir 50 ml tüp "kontrol tamponu" 50 ml aktarın. Bu ne 20 ul çıkarın w 50-ml kısım ve düz BT 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters. (Yok Ag eklenir.)
      1. Bu "Metro 4, No TCS / Hayır Ag / + BT." Bu arka plan ve spontan örnekleri için kullanılır. Etiket
    BSA TCS Antijen
    Tüp 1 Onay işareti Yüksek [] Onay işareti
    Tüp 2 Onay işareti NO Onay işareti
    Tüp 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" "15px /> Yüksek [] NO
    Tüp 4 Onay işareti NO NO
    1. Hesaplayın ve "TCS-tampon" stok konsantrasyonu belirlendikten sonra seyreltme için hacimleri kaydedin. Her bir seyreltme konsantrasyonu için toplam hacmi 1 ml olmalıdır ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde hazırlanmalıdır. Kalibre P2 ve P1000 Pipetman kullanın.
    Konsantrasyon Yüksek Triklosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
    (Yukarıda Tüp 1)
    BT 0,0004 mg / ml Ag Isıtmalı
    (Yukarıda Tüp 2)
    20 mcM
    10 mcM
    5 mcM
    1 mcM
    0.1 mcM
    0.001 mcM
    0 mcM (plaka üst) ----------------------- 500 ul artı bir 500 ul
    0 mcM (plaka alt) ----------------------- 500 ul artı bir 500 ul
    1. 1-saat IgE kuluçka sonra, kuluçka plaka almak ve lavabo içine tüm medya atmak. (Not: Test kimyasallar tüketici ürünü TCS daha zehirli olduğu bilinen ise, tehlikeli atık bertaraf gerekli olabilir.)
    2. Bir Combitip kullanarak, rastgele BSA uğratılmış Tyrodes tamponu (200 ile 96 oyuklu plaka yıkama hücreleriiyi / ul). Ekli hücre rahatsız etmemek için, daha çok doğrudan bitişik hücreler üzerine daha kuyu dökülen yıkama tamponu ile bırakın. Işlem bir kez daha tekrarlayın.
    3. Uygulama, girdap için tedavi hazırlamak ve sağ plaka ek önce seyreltme ters çevirmek için.
    4. Levhanın üst bölümü ile başlayarak: Rasgele karşılık gelen oyuklara 200 ul antijen solüsyonların her (ASR doğru konsantrasyonda) triplicates ekleyin. Plaka altına devam edin. Plaka üzerindeki tüm "alay" için "kontrol tampon" çözüm artı Ag (yukarıda "Metro 2") ekleyin.
    5. Karşılık gelen kuyulara uygun çözümler 200 ul ekleyin:
      1. % 0.2 Triton X-100, "TX" ile-belirlenmiş bir kuyu 200 ul ekleyin.
      2. Daha sonra, "Arkaplan (BkgD)-Yüksek TCS" plaka üzerinde etiketli 3 kuyulara Tüp 3 200 ul ekleyin.
      3. Son olarak, 200 ulTüp 4 ila 6 kuyu "Spontan." etiketli
    6. 37 ° C /% 5 CO2 içinde 1 saat boyunca inkübe plakası.
    7. 1 saat inkübasyon sırasında: buz iki kova (inkübatör "eski" plaka için bir ve yeni plaka için) alın. Çözülme 4-methylumbelliferyl-N-asetil-beta-D-glucosaminide oda sıcaklığında (4-MU) için bu hassas hafif olduğu için folyo tutarak 40 dakika, için.
      1. Bir kez 4-MU stok çözülmüş olduğu, 4-MU çalışma çözüm oluşturan: 150 ul stok + soğuk asetat tampon 14.85 ml (tabloda verilen reçete); girdap ve ters. Folyo ile sarılmış bir 50 ml santrifüj tüpüne, ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
      2. Combitip kullanarak, rastgele bir YENİ Grenier siyah 96-plaka (buz kovası # 2) her bir kuyunun en alt içine 100 ul soğuk 4-MU çalışma çözeltisi ekleyin. Rastgele Triton X-100 kuyu içinde, rastgele plakasının alt içinde, plakanın üst içinde rasgele çalışma çözeltisi ekleyerek, ilk başlangıçve son olarak rastgele arka kuyu içinde.
      3. Sonraki adım için P200 ipuçları yeni bir kutu almak.
    8. 1 saatlik inkübasyon sonunda, için iyi dolaşma, aşağı (yavaşça, kabarcıkları tanıtan değil) 4-5x buz kovası içerisinde 1., pipet süpernatant kadar ve üzerine inkübatör hücre plaka koymak karıştırma iyi ama karıştırma sırasında hücreleri dokunmadan değil . Sistematik, substrat (örneklerin aynı sipariş, orijinal olarak planlanmış) ile yeni plaka her iyi ve yerden 25 ul örnek almak. Zaman yeni kuyuda kabarcıkları tanıtan olmadan, iyice örnek karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve.
    9. 37 ° C /% 5 CO2 30 dakika süreyle inkübe edin.
    10. 30 dakika inkübasyondan sonra, rastgele 325 ul toplam kuyu doldurmak için de başına soğuk glisin-karbonat tampon 200 ul (Combitip kullanarak) ekleyin. (Triton X-100 yayılma önlemek için, Triton X-100 örnek için bu ek son olun). (Temiz P10 pipet ile körü okuma plaka önce kabarcıkları olup olmadığını kontrol edinte ucu) herhangi bir kabarcıklar pop.
    11. Floresan plaka okuyucu (Bölüm 4 gidin) olarak plaka çalıştırın.

    2. GÜN:

    4. Floresan Plaka Okuyucu Talimatları ve Veri Analizi

    1. Gen5 programı ve açık deneme bölümü açın.
    2. Plaka okuyucu ve eklemek plaka (sol üst köşede A1) açın.
    3. Protokol Ok Prosedür Ok Özel okuma ayarlamak için okuyun. Her kuyudan ham floresan veri toplamak amacıyla örnekleri hakkında bir şey, çoğaltır, vb eklemeyin.
    4. En iyi% 50: Altında ", Normal Hızlı" "," ", floresan" "Kazanç 40," "Uyarma 360/40," "Emisyon 460/40," Optik konumu Endpoint seçin "oku". Optik Top ofset: 7mm. Hayır sallamak, gecikmesiz, kinetik, iyi herhangi bir monitör, sıcaklık: inkübatör kapalı.
    5. Düz siyah alt, (Grenier 96-, Düz Tabanlı) plaka 96-seçin.
    6. Plaka düzeni ile anlaşma: Protokol Ok plaka düzeni. Tekrarlar, seyreltme, vb gösteren olmadan örnekleri kurun
    7. Plaka Ok okuyun.
    8. Dosyaya Kaydet: Excel'e veri dosyası ihraç edecek "Excel" düğmesini tıklatın. Plaka düzeni için ve matris için yapın. Bilgisayarda ve bir USB sürücü üzerinde dosya kaydedin.
    9. Excel'de, Triton X-100 kuyu dahil olmak üzere her örnekten ortalama arka plan okuma, çıkarma.
    10. Ortalama Triton X-100 değeri ile her değer (zaten arka plan çıkarılır vardı olan) bölünmesiyle göre% degranülasyonunun hesaplayın, ve sonra bir yüzde yapmak için 100 ile çarpın.
    11. Ortalama tüm triplicates ve standart sapma hesaplamak. Olarak excel grafik veri değerleri ± standart sapma. Istatistiksel test için, GraphPad tarafından Prism yazılımı şimdi hareket.

    2. GÜN:

    5. RBL-2H3 Hücreler kullanarak İyonofor Uyarılmış Degranülasyon Testi

    1. "Hücrelerin hazırlanması" için protokol (Bölüm 1, Gün 1) ve "triklosan hazırlanması" (Bölüm 2, 2. Gün) izleyin, yukarıda talimat verdi. Iyonofor uyarılması için plaka düzeni örnek aşağıda gösterilmiştir.
    Tedavi Triplicates
    Uyarılmış, 0 mcM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
    Uyarılmış, 0.001 mcM TCS F6, G6, H6
    Uyarılmış, 0.01 mcM TCS F3, G3, H3
    Uyarılmış, 0.1 mcM TCS A4, B4, C4-
    Uyarılmış, 1 mcM TCS A6, B6, C6
    Uyarılmış, 5 mcM [TCS F5, G5, H5
    Uyarılmış, 10 mcM TCS A3, B3, C3-
    Uyarılmış, 15 mcM TCS A5, B5, C5
    Uyarılmış, 20 mcM TCS G7 F7, H7
    DMSO, hiçbir TCS ile, Spontan (alay içerir) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
    TX-100 DMSO ile, herhangi bir TCS D10, D11, E10 D12, E11, E12
    Hiçbir hücre arka plân, DMSO ile, ayrıca yüksek [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    Şekil 1 Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

    1. Başlamadan önce, kullanılan tüm tamponların pH kontrol, ve Parçalı değildir emin olun. Tyrodes, sodyum asetat tamponu ve glisin karbonat tamponu (tarifler tabloda verilmektedir).
    2. 50 ml tyrodes tampon için 0.05 g BSA ekleyerek ve iyice karıştırın için vorteks BT biri 50 ml konik tüp hazırlayın. 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
    3. % 10 Triton X-100-4,704 mi BT 96 ul ekleyerek% 0.0032, DMSO (nihai kalsiyum iyonofor araç konsantrasyonu) ile% 0.2 Triton X-100 olun. İyice karıştırın. Daha sonra, bu çözüm 0,155 ul almak ve atın. Şimdi% 100 DMSO 0,155 ul geri ekleyin.
    4. Iyonofor şişenin içine taze,% 100 DMSO içinde 400 ul ekleyerek ve karıştırmak için, vorteks tozundan A23187 iyonofor bir 5 mM stok (2.5 mg / ml) hazırlayın. Sonra çözelti içinde,1.5-ml konik tüp, kayıt içeriği ve bugünün tarihini ve son kullanma (hazırlık itibaren 3 ay -20 ° C'de depolandığında) transfer.
      1. Alternatif olarak, buz üzerinde bugün dondurulmuş stok kullanıyorsanız, çözülme ve 5 mM A23187 iyonofor iyi karışık ve net olduğunu kontrol edin. Vortex, fiske ve kullanmadan önce bu hisse ters. # Bu A23187 hazırlanması ve Lot Kayıt tarihi.
    5. Bir kez "TCS-tampon" ve "kontrol tampon" ısıtılır ve 90 dakika karıştırılır edilmiş, TCS protokolü (adım 2.6-2.8.1 gidin) için hazırlık geri kalanı devam. BSA hem çözümler iyice karıştırılır sonra, kalan protokol adımlarla devam edin.
    6. "ASR-tampon" çözüm 249 ml örnek, yeni bir 50 ml konik tüp 50 ml aktarın. 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve 5 mM iyonofor stokunun 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Nihai iyonofor konsantrasyonu 1, 80 nM. A23187 bu konsantrasyon stok gücüne bağlı olarak değişir ve unutmayın bir A23187 iyonofor doz tepkisi RBL-2H3 bir sitotoksik olmayan olarak tanımlanmıştır yaklaşık% 20 maksimum salım, bir degranülasyonu düzeyde ortaya çıkarır A23187 'lik bir konsantrasyon tespit etmek önerilir sitotoksisite deneyi ile hücreler (2).
      1. Etiket bu "Metro 1, Yüksek TCS / + İyonofor / + BT." Seyreltme ve yüksek TCS konsantrasyon maruz kalma için kullanılır.
    7. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve 5 mM iyonofor stokta 1.8 ul geri ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Nihai iyonofor konsantrasyonu 180 nM'dir.
      1. Etiket bu "Metro 2, No TCS / + İyonofor / + BT." Bu seyreltme ve 0 mcM TCS konsantrasyonları için kullanılır.
    8. R 249 ml örnek 20; TCS-tampon "çözelti, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. Yeni 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve% 100 DMSO 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters, hiçbir iyonofor eklenir.
      1. Etiket bu "Metro 3, Yüksek TCS / No İyonofor / + BT / + DMSO", arka plan için kullanılır.
    9. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. Yeni 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve% 100 DMSO 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Resim İyonofor eklenir.
      1. Etiket bu "Metro 4, TCS / No İyonofor / + BT / + DMSO Hayır"; kendiliğinden serbest örnekleri için kullanılır.
    BSA TCS İyonofor Eklendi% 100 DMSO
    Tüp 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Yüksek [] Onay işareti NO
    Tüp 2 Onay işareti NO Onay işareti NO
    Tüp 3 Onay işareti Yüksek [] NO Onay işareti
    Tüp 4 Onay işareti NO NO eck işareti "fo: içerik-width =" "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" "15px /> .1
    1. Hesaplayın ve "TCS-tampon" stok konsantrasyonu belirlendikten sonra seyreltme için hacimleri kaydedin. Kalibre P2 ve P1000 Pipetman kullanın. Her bir seyreltme konsantrasyonu için toplam hacmi 1 ml olmalıdır ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde hazırlanmalıdır:
    <td>
    Konsantrasyon Yüksek Triklosan + Tyrodes + BSA +180 nM A23187 (yukarıdan Tüp 1) BT +180 nM A23187 (yukarıdan Tüp 2) Isıtmalı
    20 mcM
    15 mcM
    10 mcM
    5 mcM
    1 mcM
    0.1 mcM
    0.001 mcM
    0 mcM (plaka üst) ---------------------------------- 500 ul artı bir 500 ul
    0 mcM (plaka alt) ---------------------------------- 500 ul artı bir 500 ul
    1. Kuluçka dün kaplama hücreleri, ve lavabo içine medya boş alın. Bir Combitip kullanarak, rastgele BT (200 ul / çukur) ile 96 oyuklu plaka yıkama hücreleri. Yıkama ikinci kez tekrarlayın.
    2. Uygulama, girdap için tedavi hazırlamak ve sağ plaka ek önce seyreltme ters çevirmek için. Plakanın üst kısmında başlayarak: Rasgele correspo 200 ul triplicates TCS doğru konsantrasyonu her ekleyiniyi nding. Plaka altına devam edin. Plaka üzerindeki tüm "alay" için "kontrol tampon" çözüm artı A23187 (yukarıda "Metro 2") ekleyin.
    3. Karşılık gelen kuyulara uygun çözümler 200 ul ekleyin:
      1. % 0.2 Triton X-100, "TX" ile-belirlenmiş bir kuyu 200 ul ekleyin.
      2. Daha sonra, "Arkaplan (BkgD)-Yüksek TCS" plaka üzerinde etiketli 3 kuyulara Tüp 3 200 ul ekleyin.
      3. Son olarak, etiketli Tüp 4 ila altı kuyu 200 ul ekleyin "Spontan."
    4. 37 ° C /% 5 CO2 içinde 1 saat boyunca inkübe plakası.
    5. 1 saat inkübasyon sırasında: buz iki kova (inkübatör "eski" plaka için bir ve yeni plaka için) alın. Çözülme 4-methylumbelliferyl-N-asetil-beta-D-glucosaminide oda sıcaklığında (4-MU) için bu hassas hafif olduğu için folyo tutarak 40 dakika, için.
      1. Bir kez 4-MU stok çözülmüş olduğu, 4-MU çalışma soluti oluşturantarih: 150 ul stok + soğuk asetat tampon 14.85 ml (tabloda verilen reçete); girdap ve ters. Folyo ile sarılmış bir 50 ml santrifüj tüpüne, ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
      2. Combitip kullanarak, rastgele bir YENİ Grenier siyah 96-plaka (buz kovası # 2) her bir kuyunun en alt içine 100 ul soğuk 4-MU çalışma çözeltisi ekleyin: üst içinde rastgele çalışma çözüm ekleyerek ilk başlangıç rastgele rastgele Triton X-100 kuyu içindeki plakanın alt, içinde ve son olarak rasgele arka kuyu içinde levha, s.
      3. Sonraki adım için P200 ipuçları yeni bir kutu almak.
    6. 1 saatlik inkübasyon sonunda, karıştırma iyi ama hücreleri dokunmadan karıştırma süre için de dolaşma, aşağı (yavaşça, kabarcıkları tanıtan değil) 4-5x buz kovası içerisinde 1., pipet süpernatant kadar ve üzerinde inkübatör hücre plaka koymak . Sistematik, sa alt tabaka (aynı sipariş ile yeni plaka her iyi ve yerden 25 ul örnek almakmples, orijinal olarak) planlanmış. Zaman yeni kuyuda kabarcıkları tanıtan olmadan, iyice örnek karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve.
    7. 37 ° C /% 5 CO2 30 dakika süreyle inkübe edin.
    8. 30 dakika inkübasyondan sonra, rastgele 325 ul toplam (Triton X-100, yayılma önlemek için, son Triton X-100, örnekler bu ek yapmak) kuyu doldurmak için göz başına 200 ul soğuk glisin-karbonat tamponu (Combitip kullanarak) ekleyin. Okuma plaka önce kabarcıklar (herhangi bir kabarcıklar pop temiz P10 pipet ile körü) olup olmadığını kontrol edin.
    9. (Bölüm 4 tüm adımları izleyin) floresan plaka okuyucu plaka çalıştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

50 kadar ısıtıldığında ° C de 90 dakika boyunca, ASR UV Vis absorbans spektrumu Şekil 1 'de gösterilen, 280 nm'de bir zirve ile yaklaşık 260 ve 300 nm arasında güçlü, hafif bir eğri, üretir. 280 nm Molar soğurma katsayısı yayınlanan 4,200 L / mol / cm 12 olduğu için UV-VIS spektrofotometresi, bu nedenle, konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilecek önemli bir araçtır. Biz TCS 50 ° C ısıtma (veriler gösterilmemiştir) ardından, tüm degranülasyonunun deney zaman dilimi içinde çözüm dışarı düşmemesi bulduk.

Sulu tampon doğrudan TCS çözmek için bu ısıtma yöntemi kullandıktan sonra, biz Naal ve ark optimize bir floresan bazlı analiz kullanarak mast hücre degranülasyonu üzerinde TCS etkisi incelenmiştir. 1. Bu testte direk serbest β-heksozaminidaz düzeyini kaydeder bir florojenik substrat, orijinal ürünün tespit ederek bir saatlik bir inkübasyondan sonra, hücreler. DNP-BS tarafından degranüle için teşvik olsunA antijeni (Şekil 2) veya kalsiyum iyonofor A23187 (Şekil 3), bir açık TCS β-heksozaminidaz serbest bırakılması önemli bir doz-yanıt inhibisyonu (yani degranülasyonunun) neden olduğunu görebilirsiniz.

Şekil 2, 1 "TCS-Tamponu" içindeki saat veya "kontrol tamponu," inkübe edildi ve 0.0004 mg / ml 'lik bir DNP-BSA antijen dozuna maruz bırakıldı IgE duyarlı RBL hücreleri için elde edilen sonuçları temsil eder. DNP-BSA Bu konsantrasyon ± 0.1 (± standart sapma) TCS yokluğunda 22,5 ortalama% mutlak degranülasyonunun yanıt ortaya çıkardı. Degranülasyonunun istatistiksel olarak anlamlı inhibe degranülasyonuna seviyeleri 0 mcM TCS kontrolü seviyelerinin ± 0.05 (ortalama ± SD) 0.79 kat edildi 5 mcM, başladı. TCS konsantrasyonu arttıkça, TCS daha büyük bir nemlendirme etkisi güçlü bir doz-yanıt ilişkileri gösteren yoktur. TCS, 20 mcM, Almost tamamen spontan degranülasyonunun (hiçbir antijen mevcut olduğu) kabaca eşit seviyelere, degranülasyon yanıt geçerliğini kaldırır. Genel olarak, bu şekilde organik çözücülerin kullanımı olmaksızın konsantrasyona doğrulanmış TCS nedeniyle çok değerli antijen uyarılan mast hücre degranülasyonunu güçlü inhibisyonu gösterir.

Şekil 3'te, kalsiyum iyonofor A23187 TCS-RBL indüklenen mast hücrelerinde degranülasyonun nemlendirme mekanizmasını araştırmak için bir yol olarak kullanılmıştır. Bu FcεRI çapraz bağlanma ve Kalsiyum girişi yukarı diğer sinyal olayları atlar, ama yine de degranülasyon neden olur, çünkü A23187 alternatif bir uyarıcı olarak kullanılır. RBL mast hücrelerinin "1 TCS-Tamponu" içindeki saat veya 180 nM'lik bir kalsiyum iyonofor dozunu ihtiva eden "kontrol tamponu," için kuluçkalanmıştır. TCS yokluğunda, A23187 bu konsantrasyon 25.1 ortalama% mutlak degranülasyonunun yanıtı ortaya çıkardı ± 4.7 (± standart sapma). Degranülasyonu inhibisyonu olduda 1 mcM bulundu TCS (0.63 ± 0.11 [ortalama ± SD]). TCS konsantrasyonu arttıkça, bu nedenle inhibisyon şiddeti yapar: 5 mcM, 0.21 kat ± 0 mcM TCS kontrolü seviyeleri 0.04, 10 mcM, 0.09 ± 0.05 ve az 20 mcM, 15 mcM, 0.077 ± 0.006 olarak , 0.09 ± 0.02 (ortalama ± SD). Aslında, 5 uM ve TCS daha yüksek konsantrasyonları, A23187-neden olduğu degranülasyon düzeyleri kendiliğinden kontrol seviyesi (ki burada herhangi bir A23187 tüm mevcut olan) civarında olduğu bulunmuştur. Genel olarak, Şekil 3, Şekil 2 ile kombine olarak, TCS hedef moleküler olayları kalsiyum girişini muhtemel alt olduğunu gösterir.

Şekil 1
Şekil 1:. Temsilcisi TCS UV-Vis absorbans spektrumu TCS sağlam bir bezelye vardırKolay 280 belirlenmesi, hem de uğratılmış Tyrodes tamponu içinde çözülmüş TCS gerçek konsantrasyonu belirlemek için 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı kullanma olanağı sağlayan verecek şekilde 280 nm, k. Sarı çizgi 280 nm'de pik gösterir. Bu örnekte, 280 nm'de absorbans değeri 28,28 mcM bir TCS konsantrasyon belirtir, 0,11876 olan. Daha büyük resim için tıklayınız .

Şekil 2,
Şekil 2:. 0.0004 mg / ml DNP-BSA antijen ve TCS (0-20 mcM) maruz IgE-duyarlı RBL mast hücrelerinin bir temsilcisi degranülasyonunun yanıt bir spontan sürüm değeri (hiçbir antijen mevcut) referans için gösterilmiştir. Ortalama değerleri temsil7, üç kopya numuneler standart sapma. Görüldüğü gibi, veri kontrolü (0 mcM TCS) normalize edildi ve önemli farklılıklar bir Tukey post hoc testi (karşılaştırmalar 0.001 mcM TCS ortalama yanıt yapılan) ardından tek yönlü ANOVA ile Prism yazılım belirlenmiştir. Önemi temsil edilir *** p <0.001. Daha büyük resim için tıklayınız .

Şekil 3,
Şekil 3:. TCS (0-20 uM) varlığında 180 nM A23187 kalsiyum iyonofor ile uyarılmış RBL mast hücrelerinin degranülasyonu temsili bir tepki spontan salım numune (iyonofor Mevcut) referans olarak tasvir edilmiştir. Değerler üç nüsha örneklerin ortalama ± standart sapma temsil eder. Presente gibid, veri kontrolü (0 mcM TCS) normalize edilir ve önemli farklılıklar bir Tukey post hoc testi (karşılaştırmalar 0.001 mcM TCS ortalama yanıt yapılan) ardından tek yönlü ANOVA ile Prism yazılım belirlenmiştir. Önemi *** p <0.001 ile temsil edilir; ** p <0.01. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2004 yılında, Naal ve ark. 1 degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. 1 denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz 59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onların bir mikro okuyucu kullanarak daha yüksek verimlilik yöntemi ve örnek bir flüorometre bir-at-a-zaman okuma edildiği önceki yöntemi arasında kurulan doğrudan uyum. Özetle, Naal ve ark. 1 büyük yanı sıra iş akışı için çeşitli değişiklikler dahil ederek, bir yüksek verimli mikro platforma uyarlayarak hız, güç, basitlik, ve testin güvenilirliği geliştirilmiş. Burada, daha fazla özellikle, burada, çeşitli test kimyasal bir çalışma için bu testte adapte olması, Her yerde ilaç TCS. Video ayrıntıları bu çok yararlı testin adımları. Ayrıca, biz de sulu tampon TCS uygulama organik-solvent içermeyen yöntemi geliştirdik ve biz TCS konsantrasyon doğrulamak için basit, düşük maliyetli prosedürünü göstermektedir. Bu yöntemler triklosan toksikoloji görünüşte büyüyen bir alan yardımcı olmalıdır. Hem de diğer kimyasal test etmek için bu degranülasyonunun testi kullanılarak bu tartışmada, biz detay bazı noktalar.

TCS organik çözücülerin yardımı olmadan bir sulu tampon halinde direkt olarak hazırlandı, konsantrasyon UV-VIS spektrofotometresi (Şekil 1) ile doğrulanır ve sonra TCS (<30 uM) etkisini (Şekiller 2 ve 3), mast hücre degranülasyonu üzerinde incelendi , degranülasyona için β-heksozaminidaz, bir vekil marker varlığını tespit etmek için bir floresan mikro testi kullanarak. Biz TCS önemli β-hexosa serbest bırakılması kırmak mümkün olduğunu buldukdoğrudan bir sulu tampon halinde burada tarif düşük bir etanol konsantrasyonunun (% 0.24 hacim / hacim) 2 ya da, içinde eritildiğinde RBL mast hücrelerinden minidase. Organik bir çözücü ile, yukarıda adı geçen, aslında TCS,% 0.24 etanol içinde eritildi Yaptığımız çalışmalar (hacim / hacim) kıyasla antijen kaynaklı degranülasyonu nemlendirme daha belirgin olarak bkz. Örneğin, burada bizim TCS 0.24% etanol içinde çözülmüş 10 mcM için bildirilen ~% 25 azalma (0.76 kat daha büyüktür antijen kaynaklı degranülasyonunun bir>% 50 azalma (0.46 kat ± 0.07), göstermiştir ± 0.02) 2. Aynı şekilde, biz 5 mcM tarafından, TCS kendiliğinden serbest seviyelere degranülasyonunun engeller, A23187-uyarılmış hücreleri için belirlenen, bu etki daha önceki, etanol-kullanarak, çalışma 2 10 mcM TCS kadar ortaya değildi. Bu farklılığın iki nedeni vardır: Ya bir 0.24% etanol araç 2 aktif mast cel inhibe TCS yeteneğini azaltırBiz kullanıyorlardı l degranülasyonuna veya TCS (konsantrasyonları önceki çalışmada 2 UV-Vis spektrofotometre tarafından doğrulanmadı bu yana) beklenenden daha az konsantre oldu. Mast hücre degranülasyonunu TCS'nin inhibisyonu için moleküler hedef ile ilgili olarak, muhtemelen kalsiyum girişini 2'nin sinyal transdüksiyon dizisinde alt yerde meydana gelmektedir. Biz erken sinyal olaylar atlamak için bir degranülasyonunun uyarıcı olarak İyonofor A23187 kalsiyum kullanılır, ve TCS en inhibitör etki degranülasyonunun yolunda TCS inhibisyonu için hedef olası kalsiyum akını yukarı yer olmadığını belirten, devam etti. Daha önce, bu hücrelerin membran ruffling aynı zamanda ortak bir yol hedefi 2 olasılığı öne süren, TCS tedaviye bağlı bastırılır olduğunu göstermiştir.

Önceki çalışmalar TCS 280 nm maksimum tepe olan ve bir molar soğurma katsayısı bu wavelen az 4200 L / mol / cm olarak değerlendirildi ve absorbans spektrumu buldukgth 12 (pKa altındaki pH değerlerinde). Bu TCS ısıtma ısıl bozulma 57 yol açmaz olduğu gösterilmiştir ve ° C, bir organik çözücü, 56 yardımı olmadan 50 ısıtıldıktan Başka bir çalışmada suda çözünen TCS başarı göstermiştir. Herhangi bir yeni kimyasal testi kullanıldığında, sulu tampon içinde çözünebilirliği, tabii ki, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Ayrıca, TCS ısıtırken, spektral bir okuma şekli 40-90 dakika (veriler gösterilmemiştir) ısıtılır olup etkilenmez, bulduk: daha uzun bir süre boyunca ısıtıldığı zaman bu TCS bozulmasının olmadığını da göstermektedir zaman. Bununla birlikte, bu TCS çözünme 40 dakika daha 90 dakika de daha fazladır. Ayrıca TCS degranülasyonunun deneme (veri gösterilmemiştir) süresince çözüm dışarı düşmemesi doğruladı.

Bu çalışmada kullanılan DNP-BSA antijeni ve İyonofor kalsiyum konsantrasyonları, antijen ve iyonofor doz yanıt deneyleri temelinde seçildiD Örnek Şekiller 2 ve 3 için orta düzeyde degranülasyonu ortaya çıkarmak için seçildi. Bir antijen dozu tepkisi tahlilinde bir örnek, önceki çalışma 2 Şekil 1A 'da görülebilir. Deneme kullanılmak üzere antijen veya iyonofor konsantrasyonu belirlerken, bu RBL-2H3 hücreleri bazen değişken işlev yana uyarıcı doz yanıt deneyleri, en az her iki ayda genellikle, periyodik olarak yapılması gereken farkında olmak önemlidir. İstenen degranülasyonu yüzdesini verir konsantrasyonu hücre yaşına ve antijen / iyonofor hazırlanması bağlı olarak değişebilir. Biz inorganik arsenit 22 ile gördüğümüz gibi Ayrıca, mutlak degranülasyonunun yüzdeleri (kullanılan antijen seviyeleri) doz-yanıt birkaç farklı antijen / iyonofor konsantrasyonlarda yapılmalıdır böylece zehiri, RBL degranülasyonunun üzerindeki zehiri etkileri düzeylerini etkileyebilir. Bu son conce dikkate almak da önemlidirDMSO aracı arasında ntration degranülasyonu DMSO 62 etkilenir, çünkü Ca iyonofor ile degranülasyon uyararak zaman. Bu protokolde kullanılan DMSO konsantrasyonu degranülasyonu, arka plan okuma, ya da% 0.2 Triton X-100, 2 değerleri etkilemez bulduk.

Çok değerli antijen DNP-BSA ve kalsiyum iyonofor A23187 ek olarak, RBL-2H3 uyarımı çeşitli başka yöntemler de bulunmaktadır. Bu yöntemlerden bir tanesi kersetin 63 ile birlikte 48/80 bileşik maruziyeti üzerinden uyarılmasıdır. Daha önce TCS maruz 2 ile birlikte test olarak başka bir anti-IgE IgG, IgE-bağlı reseptör çapraz olan. Diğer birçok stimülasyon yöntemleri var, ve bu yöntemlerin her mast hücre degranülasyonu farklı bir mekanik yönü giderir. Bu plaka okuyucu tahlilinde daha da yardımcı genişleterek, bu alternatif uyarıcıları, birçok kullanım için adapte edilebilir.

Bu protokol degranülasyonu Che geniş bir yelpazede ile kullanılmak için bir potansiyele sahiptirmicals. Bu testi kullanılarak herhangi bir test kimyasal bir çalışmada, kontrol aşağıdaki için çalıştırılmalıdır: arka plan üzerinde test kimyasal (yok hücreleri) okuma (1) etkisi; spontan degranülasyonu üzerindeki kimyasal (2) etkisi (yok IgE ile hücreleri , herhangi bir antijen, herhangi bir iyonofor); parçalanmış hücreleri arasında Triton X-100 değerleri (antijensiz, herhangi bir iyonofor) üzerinde kimyasal (3) etkisi. Bu testler kolayca plaka düzeni içine çalışmış olabilir. Daha önce, TCS bu üç parametre 2 hiçbiri etkiler bulundu. Buna ek olarak, test, test kimyasalı olarak Ek Palmer ve ark bir ek veri bölümünün S1 Şekil tarif edilen bir hücre içermeyen hazırlanmasında β-heksosaminidaz enzim / substrat reaksiyonu kendisi ile müdahale etmediğini belirlemek için çalıştırılması gerekir. 2 Biz TCS bölünebiliyordu β-heksozaminidaz yeteneği florojenik substrat, 4-MU 2 ile karışmaz bulundu. Kullanılan herhangi bir çözücü etkileri de göz önüne alınmalıdırBütün bu deneylerde kontrol. Örneğin, DMSO, iyonofor için kullanılan çözücü madde, Triton X-100 numunesinden floresan seviyeleri (veriler gösterilmemiştir) üzerinde herhangi bir etkiye sahip olduğunu doğruladı. Biz de endokrin Topu bisfenol içermeyen bu çalışmada kullanılan tüm plastik seçilen unutmayın bir, ne yazık ki, olsa da, şu anda piyasadaki tüm plastik muhtemelen potansiyel veri 64 yıkmak olabilir aktivite bozan bazı endokrin, içeriyor.

Sorun giderme gerekli olması durumunda, bu protokolün birkaç potansiyel yönleri gözden geçirilmelidir. (2) her iki uyarıcı ve / veya test kimyasal bir doz-yanıt gözlemlenmemiştir dir; Örneğin, (1) spontan salım seviyesi (lizis değerleri ~% 7 'den büyük) çok yüksek olabilir ya da (3) çözelti içinde TCS konsantrasyon (daha düşük 20 uM) çok düşüktür. İlk durumda, yüksek seviyede kendiliğinden çok uzun ya da Mycoplasma ile kirlenmiş olan kültür içinde olan hücrelerin bir göstergesi olabilir ve bu nedenle, 2-20 hafta arasında kültür olmuştur RBL-2H3 hücreleri ile bu deneyler deneyin ve düzenli mikoplazma için test edin. Uyarıcı bir doz tepkisi gözlenmiştir değilse, çözünmüş uyarıcı konsantrasyonu çok düşük olabilir, ve hisse senetleri uygun hale getirilmesi gerekir. Bir örnek olarak, kalsiyum iyonofor tipik olarak dikkat gerektiren ve çok daha vorteks, DMSO ile yeniden yapılandırılan bir ince film olarak sağlanır. Ayrıca, farklı bir çok sayıda yeni iyonofor stok yeri-için-çok varyasyon sadece nedeniyle farklı bir gücü olabilir, bu nedenle, bir degranülasyonunun doz yanıt her yeni satın iyonofor stok ile tavsiye edilir. Bu belirli bir testi kimyasal ile etkisinin belirgin bir eksikliği bu kimyasal bir etkiye neden için daha uzun bir kuluçka dönemi gerektirebilir bir göstergesi olabileceğini de dikkati çekiyor. Eğer çözelti içinde yüksek bir verim elde TCS değildir, sıcaklık kalmıştır kontrol sabit (50 ± 5 ° C) tampon içine çözünen granüller ise. TO termometre şişenin alt, çözeltinin sıcaklığı arasında yüksek bir tahmin neden olacaktır bir konumda temas asla. Ayrıca, sıcaklık ilk 50 ° C ulaşmıştır kadar orada sürekli şiddetli karıştırma ve 90 dakika geri sayım başladı olmadığından emin olun

Sorun Giderme Tablo.

Sorun

Potansiyel Nedeni

Çözüm

TCS stok <20 mcM olduğu belirlenir

Çözeltinin üniform olmayan ısıtma

Termometre bu çözüm askıya alınır ve balonun alt dokunmadan kalmayacak şekilde durduğundan emin olun.

Karıştırma yeterince güçlü değildir

Çözüm balonun atlamak için neden olmadan güçlü olduğunu karıştırarak bir seviyeye ulaşmak için heyecan-plaka üzerinde manyetik karıştırma artırın. Uygun büyüklükte bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılır emin olun.

Spektrofotometre ile ilgili sorunlar

UV lamba uygun ısınma (genellikle 10 dakika) için izin veya ampul gerekiyorsa değiştirin.

Spontan degranülasyonu yüksekti (> ~% 7) çok yüksek

Hücreler kültür çok fazla zaman nedeniyle anormal genetik mutasyonlar elde etmiş

Yeni bir cep çözülme ile deneyler yapın.

Hücreler nedeniyle mekanik kesme ölüyor

Tampon veya tedavi yapışık hücrelere eklerken, mikro yanlarına dikkatli bir şekilde bu miktarlar ekleyerek, hücrelerin rahatsız etmemek için dikkatli olun. Combitip kullanarak uygulama.

IgE / DNP-BSA kendiliğinden serbest seviyeleri üzerinde beta-heksozaminidaz salınması neden olmaz

IgE 30 günden daha eski ya da çözülme dondurmak tabi olmuştur

IgE yeni, doğru bir şekilde saklandığı kısım kullanın.

DNP-BSA düzgün karışık olmamıştır

Dikkatle konik tüp ve t DNP-BSA küçük hacimli eklemek için emin oluniyice o girdap.

A23187 iyonofor kendiliğinden serbest seviyeleri üzerinde beta-heksozaminidaz salınması neden olmaz

A23187 stok düzgün yeniden edilmemiştir

Ürün ", ince film" olarak gelir ve bakım ve çok vorteks ile yeniden gerekir. Transferi depolama için yeni bir 1.5 ml tüp stok yeniden.

A23187 stok doğru bir şekilde saklandığı olmamıştır

Stoklar ışık duyarlıdır. Bir kez sulandırılmış, Parafilm üst ve mağaza -20 ° C'de folyo sarılı Bir hisse senedinin depolama ile ilgili bir soru varsa, atmak ve yeni bir hisse senedi ile testler başlar.

A23187 iyonofor 180 nM ortaya çıkarmak değilBir önceki deneyde bulunan gibi göreli degranülasyonu yanıt aynı seviyede,

A23187 iyonofor Lot-to-çok varyasyon

Iyonofor her yeni sürü için bir doz-yanıt deney yapın. Ayrıca, aynı partiden stokları nedeniyle sulandırma sürecinde potansiyel değişkenlik, test edilmesi önerilir.

Toksiloji / farmakoloji deneyde olduğu gibi, deney kimyasal test edilen konsantrasyonlarda açıkça toksik olmamalıdır. Bu yöntemler kullanılarak tavsiye apoptoz ve nekroz, ya tek tek ya da kombine (örneğin Clonogenic tahlilleri gibi) yanı sıra, plazma zarı (örneğin, laktat dehidrogenaz sızıntı gibi) genel hasar Her iki test için test edin. TCS, bu çalışmada gösterilen konsantrasyonlarda, RBL-2H3 hücreleri 2 sitotoksik değildir. Iyonofor çalışmalarla endişe özel bir not olduğunu iyonofor artı iyonofor araç(Muhtemelen DMSO), artı testi kimyasal, artı kullanılan herhangi bir organik çözücüler, Palmer ve ark yapılır dikkatle, kontrol edilmesi gereken bir potansiyel sitotoksik demlemek, olabilir. 2

Bir organik çözücü kullanmadan ASR solüsyonları hazırlamak için protokol çözücü eserler, su toksikoloji özellikle önemli bir göz arasında bir müdahale olmadan, bu yerde kimyasalın daha toksikolojik test etmek için yararlı olacaktır. Bu yöntemler aynı zamanda TCS konsantrasyonu doğrulanmasına olanak Bu TCS gibi kimyasallar, mast hücre degranülasyonu üzerinde sahip olduğu etkileri çözümü ve miktar olarak. Bu protokol, kimyasallar 55 kesintiye şüpheli endokrin olarak mast hücre degranülasyonu üzerinde kimyasal, geniş bir yelpazede etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir, ve potansiyel olarak yüksek verimli görüntüleme için ölçeklendirilebilir. Ayrıca, diğer bir mast hücre tipleri gelecekteki çalışmalarında Bu deneyde kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

LMW ve RHK Biyomedikal Bilim ve Mühendislik (GSBSE) bir sources en Enstitüsü tarafından desteklenir; RHK de Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu tarafından desteklenmiştir. Ek finansman Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIH P20-GM103423), Maine Tarım ve Orman Experiment Station (Grant sayısı ME08004-10, Jag), Tide Merkezi (NSF Grant # 1.008.498) Rising Maine ADVANCE Üniversitesi tarafından sağlandı ve phrma temel (Jag) den Farmakoloji / Toksikoloji bir Araştırma Başlatan Grant. Biz Dr teşekkür ederim. Antijen ve hücreler David Holowka ve Barbara Baird. Biz Hina Hashmi, Alejandro Velez ve ekipman ve emirleri ile yardım için Andrew Abovian minnettarız. Bu Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu yayın sayısı 3311 olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

BioTek

Module S

Hematocytometer

Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

Range: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle

Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861 (1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937 (2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67, (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

Comments

1 Comment

  1. May I have the video clip for my research project, since I am doing experiments on human basophilic leukemia cells

    Reply
    Posted by: Liu W.
    December 10, 2013 - 4:37 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics