Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Biology
 

Summary

Ein Protokoll beschrieben, das Illumina Infinium Assays verwendet, um groß angelegte Genotypisierung. Diese Assays zuverlässig Millionen SNPs Genotyp über Hunderte von einzelnen DNA-Proben in drei Tagen. Einmal erzeugt, können diese Genotypen verwendet werden, um für Vereine mit einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen oder Phänotypen zu überprüfen.

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Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, P. M. Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications. J. Vis. Exp. (81), e50683, doi:10.3791/50683 (2013).

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Abstract

Genotypisierung Varianten des menschlichen Genoms hat sich als ein wirksames Verfahren, um genetische Assoziationen Phänotypen identifizieren. Die Verteilung der Varianten innerhalb der Familien oder Populationen kann die Identifizierung der genetischen Faktoren der Erkrankung zu erleichtern. Panel der Genotypisierung BeadChips Illumina ermöglicht Ermittler zu Tausenden oder Millionen von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) Genotyp oder an andere genomische Varianten, wie Kopienzahl, über eine große Anzahl von DNA-Proben zu analysieren. Diese SNPs können über das gesamte Genom verteilt oder in bestimmten Regionen, um potenzielle Entdeckungen zu maximieren richtet sein. Die Infinium-Assay wurde optimiert, um hochwertige, schnell genaue Ergebnisse liefern. Bei richtiger Konfiguration können ein Techniker von einigen hundert bis zu über tausend DNA-Proben pro Woche zu verarbeiten, abhängig von der Art der Anordnung. Dieser Test führt den Benutzer durch jeden Schritt, ausgehend von genomischer DNA und endend mit dem Scannen des Arrays. Mit Anstand Reagents werden Proben verstärkt, fragmentiert, gefällt, resuspendiert, auf dem Chip, um eine einzelne Base, gebeizt erweitert hybridisiert und entweder auf einem iScan oder Hallo Scan hochauflösende optische Abbildungssystem gescannt. Eine Nacht Schritt erforderlich, um die DNA zu amplifizieren. Die DNA wird denaturiert und isotherm durch Amplifikation des gesamten Genoms amplifiziert, daher ist kein PCR erforderlich. Proben werden über Nacht in einem zweiten Schritt auf die Arrays hybridisiert. Am dritten Tag werden die Proben nun gescannt und analysiert werden. Amplifizierte DNA kann in großen Mengen gelagert werden, so dass Perlenanordnungen jeden Tag der Woche verarbeitet werden, wodurch der Durchsatz maximiert wird.

Introduction

Typing Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) ist eine wichtige Methode zur Identifizierung mit der Krankheit assoziiert Risikovarianten. Historisch ist der Umfang der Genotypisierungsanalysen durch die verfügbare Technologie begrenzt. Gelelektrophorese-basierte Genotypisierung Methoden werden in Abtast-und SNP-Durchsatz begrenzt ist [1]. Die Entwicklung dieser Tests können oft arbeitsintensiv sein, die sich auf dem Make-up und Struktur der Region die Variante für die Optimierung Umgebung [1]. TaqMan-Assays Genotypisierung von Life Technologies entwickelt wurde, kann eine große Anzahl von Proben schnell und mit minimalen Beteiligung Techniker laufen [2], aber SNP-Multiplex Einschränkungen weiterhin die Gesamtzahl der Genotypen auf deutlich unter eine Million pro Tag [3,4 begrenzen ]. Sequenoms Iplex Plattform kann auch viele Proben laufen auf einmal, aber, da weniger als hundert SNPs können zusammen gemultiplext werden, ist vergleichsweise geringen Gesamtdurchsatz [5]. Beckman Coulter SNP-Stream-Technologiekönnte theoretisch produzieren mehr als drei Millionen Genotypen pro Tag, aber diese Technik Grenzen Projektbereich zu einem Maximum von nur achtundvierzig SNPs pro Reaktion [4,6]. Während die Goldengate-Test kann fast zweihundert DNA-Proben jeden Tag auf Hunderten oder Tausenden von SNPs pro Probe zu verarbeiten, ist der Preis pro Genotyp nicht wettbewerbsfähig mit erweiterten, ultra-Hochdurchsatz-Techniken bei der Eingabe über dreitausend SNPs auf einmal [4,7 ]. Um mehrere Millionen Genotypen pro Tag verarbeiten, die für große Genom-weite Assoziationsstudien erforderlich Skala, Array-Hybridisierungstests haben sich die kostengünstigste Option auf dem Markt.

Affymetrix-Linie von Hybridisierungsarrays und Illumina-Linie von Infinium-basierte Arrays ermöglichen potenziell Hunderte von Proben auf Hunderttausende oder Millionen von SNPs parallel [4,8] eingegeben werden. Diese SNPs können über das gesamte Genom verstreut werden, in Regionen, von Interessen, wie Ex lokalisiertomes oder den Vorlieben des Benutzers angepasst. Diese Arrays haben den Vorteil, nicht nur in der Lage, eine Million SNPs pro Probe genau Genotyp auf einmal, aber auch Kopienzahl Variation zu messen, potenziell Enthüllung Chromosomenanomalien. Infinium ausgerichtet OMNI BeadChip Arrays haben derzeit die Möglichkeit, Genotyp bis zu fast fünf Millionen Marker pro Probe, darunter eine halbe Million individuelle Loci, auf bis zu fast hundert Proben pro Tag.

Da die meisten Krankheiten haben eine genetische Komponente, können diese Großversuche entscheidend bei der Suche nach Genen, die mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Hochdurchsatz-Genotypisierung ermöglicht eine effiziente Genotyp Generation in der Probe setzt groß genug, um genetische Assoziation zeugend erkennen zu niedrigeren kleinere Allel-Frequenzen. [9,10,11] Whole Genome Genotypisierung Projekte verwendet werden, um Regionen mit statistisch signifikanten Fall-Kontroll-Allel Frequenz oder Kopienzahl Unterschiede zu lokalisieren. Nach Angaben der Nationalen Menschen Genome Research Institute, führte genomweite Assoziationsstudien, um 1490 getrennte Publikationen zwischen dem 25. November 2008 und dem 25. Januar 2013, die sich aus der Entdeckung von 8.283 SNPs mit einem p-Wert von weniger als 1 x 10 -5 (siehe http:// www.genome.gov/gwastudies/). Diese Studien, die Bedingungen von Höhe zu Hodenkrebs, profitierte von der breiten Ansatz durch eine genomweite Analyse ergab erforscht. In Fällen wie diesen, kann ganze Regionen von Interesse entgangen war der Umfang der Typisierung war zu restriktiv. So kann zum Großverband analysiert, ist eine genomweite Genotypisierung Technik die Technik der Wahl.

Verschiedene Versionen des Infinium Assay vorhanden ist, jeweils für die Verwendung mit bestimmten Typen von Arrays bestimmt. Die InfiniumUltra Assay, in der Tiefe unten diskutiert wird, ist angemessen für viele 12 - oder 24-Sample-Array-Chips. Diese oft Genotyp über hunderttausend SNPs pro DNA-Probe und konzentrieren sich auf targeted Regionen, wie auf exome oder benutzerdefinierte Panels. Andere Assay-Versionen können für andere Chiptypen, wie z. B. die Gesamtgenom-Genotypisierung Arrays erforderlich. Da jedoch alle Infinium Assays haben eine gemeinsame Grundlage und unterscheiden sich hauptsächlich nur von den Reagenz-Name, der Reagenzienmengen, oder die genaue Färbereagenz Verfahren, Techniken, die auf einem Test-Version perfektioniert kann oft universell einsetzbar. Andere Felder wie Methylierung Arrays könnte eine nahezu identische Protokoll verwenden, wie gut. Es muss nur genommen die Version des für die Chip-Typ im Einsatz erforderlich Assay werden. Einige Arten, wie beispielsweise diejenigen Messung der Genexpression Ebene könnten die Verwendung eines nonInfinium Protokoll.

Die Proben müssen in Chargen verarbeitet werden. Zum Beispiel mit dem InfiniumUltra Assay enthalten Prähybridisierung Reagenzröhrchen genug Volumen zu 96 Proben laufen, und die Rohre können nicht wieder eingefroren werden. Daher müssen Proben in Chargen von 96 Proben zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden. Die Proben werden auf den Tannen verstärkt werdent Tag. Nach ca. 1 h Rohbau, müssen die Proben in einem Umluftofen für 20-24 Stunden erhitzt werden. Am folgenden Tag wird fast 4 h ausgegeben werden Fragmentierungs, Ausfällen und Resuspendieren der Proben, an welchem ​​Punkt können die Proben entweder für zukünftige Verwendung eingefroren oder auf dem Chip hybridisiert werden. Lädt Chips dauert fast 2 Stunden, nach dem die Proben über Nacht für 16-24 h hybridisiert werden. Am dritten Tag erfolgt die Färbung und Verlängerungsschritt ~ 4 Stunden. Eine weitere Stunde ausgegeben werden Wasch-, Beschichten und Trocknen der Späne. Schließlich werden die Matrizen gescannt, die 15-60 min / Chip dauern kann, abhängig von der Art verwendet.

Standard-Labor Sicherheit und Sauberkeit Vorsichtsmaßnahmen gelten. Obwohl die Amplifikation nicht PCR-basierten, sind separate Arbeitsstationen für Vor-und postamplification Verfahren notwendig, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Die Identifikationsnummer eines jeden Kit gelieferten Reagenzien im Einsatz muss auf einer Tracking-Blatt angemeldet sein. Reagents sollten unmittelbar vor Gebrauch mehrmals vor der Abgabe aufgetaut und umgekehrt werden. Die getippt werden müssen DNA hochwertige genomische DNA (260/280 Absorptionsverhältnis von 1,6 bis 2,0, 260/230 Absorptionsverhältnis von unter 3,0), nach Standardmethoden isoliert und mit einem Fluorometer quantifiziert werden. Abbau von DNA ist oft ein Faktor in geringer Qualität Assay-Ergebnisse. Typischerweise wird 200 ng DNA benötigt wird, obwohl dieser Betrag kann für einige Chiptypen variieren. Ein Tecan Flüssigkeitshandhabungsroboter kann viele Schritte des Protokolls zu automatisieren und menschliche Fehler zu minimieren als Faktor.

Protocol

Day One

1. Vorbereitung

  1. Geben Sie 200 ng DNA in eine Deep-Well, 96-Probenplatte. Mindestens 96 Proben (Voll Platten) plattiert werden müssen, um sicherzustellen, dass keine Reagens vergeudet. Beschriften Sie die Platte mit einem Barcode-Aufkleber von der Packung enthalten und es Zentrifuge.
  2. Um das Volumen zu normalisieren, lassen Sie die Proben in einer Schublade oder Dunstabzug über Nacht, um die Flüssigkeit zu verdampfen. Die Platte locker mit einem Deckel oder Papiertuch, um Staub zu halten.

2. Verstärkung

WARNUNG: Proben sollten nicht unterziehen, es sei denn Verstärkung 4 Stunden zur Verfügung stehen am folgenden Tag für die Fragmentierung, Niederschlag, und Resuspension Schritte sein.

  1. Entfernen der Firma bereitgestellten Karton oder Packung von Rohren mit "Pre" aus dem -20 ° C Gefrierschrank (ein Rohr aus MA1, MA2 und MSM ausreichend ist für jeden Satz von 96 Proben). Stellen Rohre MA2 und MSM auf der Bank zu tauen. Schalten Sie richtig kalibriertBackofen und auf 37 ° C eingestellt
  2. Mit einem Reagenz-Becken und ein 10 ul, 8-Kanal-Pipette 4 ul DNA Resuspensionspuffer in jede Vertiefung, die Proben deinen Durst. Es ist nicht notwendig, Pipettenspitzen zwischen den Spalten verwerfen, wenn darauf geachtet wird, nicht zu berühren Flüssigkeit.
  3. Mit einem 8-Kanal-Pipette, verzichten 20 ul MA1 in jede Vertiefung der Platte. Für jede neue Reagenzien, verwenden Sie eine neue Reagenz-Becken. Die Platte mit einem wiederverwendbaren Dichtung, Puls-Zentrifuge und Wirbel für 1 min bei 1.600 rpm auf einem Schüttler.
  4. 2.4) Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 30 min.
  5. Verzichten 4 ul 0,1 N NaOH in jedes Well der Platte. Die Platte mit dem wiederverwendbaren Dichtung, Puls-Zentrifuge und Wirbel für 1 min bei 1600 Umdrehungen pro Minute.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
  7. Dispense 34 ul MA2 in jede Vertiefung der Platte.
  8. Dispense 38 ul von MSM in jede Vertiefung der Platte. Die Platte mit derDichtung wiederverwendbar, Puls-Zentrifuge und Wirbel für 1 min bei 1600 Umdrehungen pro Minute.
  9. Legen Sie im Ofen für 20-24 Std.

Tag zwei

3. Zersplitterung

  1. FMS Röhren entfernen aus der "Post-1" -20 ° C-Box (eine Tube reicht für jede Gruppe von 96 Proben). Tauwetter auf der Bank oder in einem Raum-Temperatur-Wasserbad. Nach dem Einlegen der MIDI-Platteneinsatz in eine Tischplatte Mikroprobe Inkubation System, schalten Sie den Wärmeblock und auf 37 ° C eingestellt
  2. Sobald Rohre werden aufgetaut, entfernen Probenplatte aus dem Ofen und Puls-Zentrifuge. Dispense 25 ul der FMS in jedes Well der DNA-Platte. Setzen Sie den Deckel, Puls-Zentrifuge und Wirbel bei 1.600 rpm für 1 min.
  3. Inkubieren Platte in Wärmeblock für 1 Stunde.

4. Fällung

  1. Entfernen PM1 Rohr aus "Post-3", 4 ° C Feld oder packen und auf Raumtemperatur (eine Röhre ist ausreichend für jeden Satz von 96 Proben). Platte entfernen von der Hitze block und Puls-Zentrifuge.
  2. Geben Sie 50 ul der PM1 in jede Vertiefung der Platte. Setzen Sie den Deckel, Puls-Zentrifuge und Wirbel bei 1.600 rpm für 1 min.
  3. Inkubieren Platte in Wärmeblock für 5 min.
  4. Entfernen Platte von Wärmeblock, schalten Sie es aus, und entsorgen Sie die Platte Deckel. Dispense 155 ul von 100% Isopropanol in jede Vertiefung der Platte. Decken Sie eng mit einem neuen Deckel und die Platte manuell umdrehen mehrmals, um zu mischen.
  5. Platzieren Platte 4 ° C für mindestens 30 min. Schalten Sie Kühlzentrifuge und auf 4 ° C eingestellt, um zu kühlen.
  6. Gleichen Sie die Platte und Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei 3.000 x g.
  7. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte ohne Umdrehen und bestätigen die Proben in einem blauen Pellet gefällt. Wenn keine Pellets, Zentrifuge wieder gesehen werden. Holen Sie sich Papierhandtücher.
  8. Entsorgen Sie den Deckel und schnell zu entfernen, die Flüssigkeit durch Umdrehen der Platte und mit Nachdruck Antippen auf der Tischplatte in Papiertüchern abgedeckt. Sobald die Platte inverted darauf, sich nicht darauf zurückgreifen, während jede Flüssigkeit bleibt. Immer wieder tippen Sie auf die Tischplatte gegen die, bis alle Flüssigkeit entfernt wird.
  9. Legen Sie die Platte auf einem Reagenzglasständer, invertiert, um zu trocknen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.

5. Resuspension

  1. Entfernen RA1 von "Post-2" -20 ° C Box und Tauwetter in Wasserbad bei Raumtemperatur. Schalten Sie den Backofen und stellen Sie es auf 48 ° C
  2. Einmal aufgetaut, verzichtet RA1 23 ul zu jeder Vertiefung der Probenplatte. Die ganze Flasche RA1 gießen Sie nicht in das Becken, sparen Sie 30 ml für später. Wenn die Proben auf den Arrays später am Tag hybridisiert werden, legen Sie die RA1 in einen 4 ° C kühler. Wenn die Proben werden zu einem späteren Zeitpunkt ausgeführt werden, beschriften Sie die Flasche und wieder einfrieren die RA1.
  3. Heißsiegel einen neuen Deckel auf der Platte. Puls-Zentrifuge die Platte und legen Sie sie in den Ofen für 1 Stunde.
  4. Die Platte aus dem Ofen und Wirbel bei 1.800 rpm für 1 min.
    Die Proben können sicher sein held in dieser Phase bis zu einer Woche. Die Platten können gelagert werden, und Proben können neu organisiert, um für den Wulst Chip Antrags vorbereiten kann, wenn nötig. Wenn dem Verfahren fortfahren, lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur und schalten Sie den Wärmeblock. Andernfalls speichern die Platte bei -20 ° C

6. Kreuzung

WARNUNG: Proben sollten nicht unterziehen, es sei denn Hybridisierung 5,5 Stunden sind am folgenden Tag für die Färbung verfügbar und Waschschritte.

  1. Schalten Sie den Wärmeblock und setzen ihn auf 95 ° C Schalten Sie den Backofen und stellen Sie es auf 48 ° C
  2. Sobald die Temperatur stabilisiert hat, Inkubation der Platte auf dem Wärmeblock für 20 min.
  3. Während die Platte Denaturierung, entfernen Sie die Schachtel mit Wulst-Chips von 4 ° C und setzen Sie ihn auf die Bank. Nehmen Sie eine Flasche XC4 (von Raumtemperatur-Kit), und fügen Sie 330 ml 100% Ethanol. Gut schütteln und bei Raumtemperatur über Nacht. Vorbereitung Formamid / EDTA-Mischung (95% Formamid, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% H 2 O auf das Volumen) und gefrier in getrennten 15 ml-Schritten. Überschüssiges Formamid kann gelagert werden.
  4. Entfernen Sie den Probenteller aus dem Wärmeblock. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
  5. Während die Kühlplatte, bereiten Sie die hyb Kammer. Eine Kammer wird für jeweils vier Wulst Chips verarbeitet benötigt werden.
    Legen Sie eine Gummimatte auf der Oberseite der Kammer hyb Basis, Ausrichten der dickere Loch mit der Vorderseite der Basis. Die Barcode-Symbol in die Basis geätzt sollte noch sichtbar sein (siehe Abbildung 2).
  6. Mit einer 1000 ul Pipette 400 ul PB2 in jedem der acht in den Boden gehauen Befeuchtung Stauseen. PB2 in "Post-3"-Box oder Packung gefunden werden. Legen Sie die hyb Kammerdeckel an der Basis und umklammern die beiden Enden durch Schließen zwei Schnallen an diagonal gegenüberliegenden Seiten zuerst.
  7. Entfernen Sie die einzelnen Silber Packungen von Perle Chips von ihren jeweiligen Boxen, sondern, um der Chips expo minimierenAchten Sie darauf, Luft und Licht, noch nicht öffnen. Vorsichtig scannen die Barcodes der Chips und die Reihenfolge, in der sie auf einem Blatt Tracking geladen werden, zusammen mit den Feld-IDs, aus denen sie kamen. Ein gründliches Verständnis davon, wo jeder einzelne DNA-Probe wird auf dem Wulst Chips verzichtet werden notwendig.
  8. Entfernen Sie die einzelnen Silber Packungen von Perle Chips von ihren jeweiligen Boxen, sondern, um die Exposition der Chips an Luft und Licht zu minimieren, wissen noch nicht öffnen. Vorsichtig scannen die Barcodes der Chips und die Reihenfolge, in der sie auf einem Blatt Tracking geladen werden, zusammen mit den Feld-IDs, aus denen sie kamen. Ein gründliches Verständnis davon, wo jeder einzelne DNA-Probe wird auf dem Wulst Chips verzichtet werden notwendig.
  9. Kurz bevor die 30 Minuten abkühlen abgeschlossen ist, öffnen Sie die Silberkugel Chip-Packs. Entfernen Sie die Chips von ihrer klaren Kunststoffhülsen. Ohne Berührung der Perlen, legen jede Perle Chip auf einem hyb Raumeinsatz, Ausrichten der ChipBarcode mit dem Barcode-Symbol in oberen Fläche des Einsatzes geätzt.
  10. Abziehen und entsorgen Sie den Deckel der Probenplatte. Nimmt 15 ul Probe von der Probenplatte und langsam abzug am Einlaß zu der Anordnung (siehe Fig. 3). Außerordentliche muss darauf geachtet werden, um die richtige Probe auf dem richtigen Wulst-Chip in die richtige Position zu bringen, passend zu den zuvor aufgenommenen Chip Wulst um werden. Ein Mehrkanalpipette verwendet werden, um Flüssigkeit auf die Chips zu verzichten, aber Umsicht zu treffen, um nur die Anzahl der Proben, die sicher auf dem Wulst-Chip platziert werden können, abzusaugen, wenn die Anzahl von Zeilen auf einer Platte nicht immer die Anzahl der übereinstimmt Zeilen auf dem Chip.
  11. Einmal pro Probe auf seiner entsprechenden Array platziert eine Sichtkontrolle des Chip für Blasen oder Regionen nicht in Flüssigkeit beschichtet. Wenn diese Probleme existieren, schaukeln den Einsatz. Falls erforderlich, kann mehr Flüssigkeit Array hinzugefügt. Achten Sie auf die korrekte DNA-Probe hinzufügen.
  12. Öffnen Sie die hyb Kammer eind die Einsätze über die Befeuchtung Stauseen zu platzieren. Der Barcode des Chips sollte über den Barcode in die hyb Kammerbasis geätzt platziert werden. Ersetzen Sie die hyb Raumdeckel und schließen Sie alle vier Klammern durch das Schließen der Schnallen an diagonal gegenüberliegenden Seiten zuerst.
  13. Hyb die Kammer inkubieren in den Ofen für 16 bis 24 Stunden. Achten Sie darauf, um die Kammern zu kippen, wenn sie bewegt.
  14. Wenn mehr als eine Platte zu verarbeiten ist, kehren Sie zu Schritt 6.2. Verarbeitung von mehr als 24 Wulst Chips in einem Tag nicht um sowohl minimieren die Wahrscheinlichkeit menschlicher Fehler bei der Handhabung einer großen Menge von Verbrauchsmaterialien oder Chips und um die Menge an Zeit benötigt, um die Chips in zukünftigen Schritte zu minimieren empfohlen, als darauf zu um den Einfluss von Luft so weit wie möglich zu begrenzen. Eine Flasche XC4 ist für bis zu 24 Wulst Chips ausreichend.

Tag drei

7. Die Färbung Vorbereitung

  1. Entfernen Sie die hyb Kammern aus dem Ofen und bei Raum temperatur für 25 min. Wenn die Verarbeitung mehr als zwei hyb Kammern, schwanken ihre doppelte Entfernung alle 10 min. Um die Chips vor dem Austrocknen zu halten, noch nicht öffnen die hyb Kammern.
  2. Während die hyb Kühlkammern, Rohre XC1, XC2, TEM, STM und Geldautomaten zu entfernen aus der "Post-1" -20 ° C Box und auf die Bank gesetzt zu tauen. Nehmen Sie eine Flasche RA1 von der "Post-2"-Box bei -20 ° C (oder 4 ° C, wenn die Wiederverwendung des Reagenz vom Vortag) und Auftauen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur. Tauwetter ein Rohr von 95% Formamid als gut. 8 Wulst Chips verarbeitet, zwei Rohre von jedem Reagenz, RA1 10 ml, 15 ml Formamid und 150 ml XC3 (in einer Raumtemperatur, unternehmens geliefert Feld gefunden) erforderlich.
  3. Für jeden Chip verarbeitet, wird ein Glasobjektträger, einer Kunststoffdurchfluss Klammer, zwei Metallklammern, und ein Kunststoffabstandshalter erforderlich. Für die Kunststoff-Abstandshalter, verwenden Sie nur die klare man, trennen und entsorgen Sie die undurchsichtige Spacer. Darüber hinaus wurden zwei Perlen Chip Wasch Gerichte undeine Perle Spänewanne benötigt werden, zusammen mit einer Flüssigkeit Montagestation und ein Kunststoffmontageschiene.
  4. Reinigen Sie die Glasobjektträger durch Besprühen mit Ethanol und wischte sie trocken.
  5. Schalten Sie den Heißwasserbad, die der Durchflusskammer Rack angebracht ist und stellen Sie es auf 44 ° C Schütteln Sie die Kammer Zahnstange, um keine Blasen zu entfernen.
  6. Wenn die hyb Kammer für 25 min gekühlt, füllen eine Waschschüssel mit PB1 (ca. 200 ml). PB1 können in der "Post-4" Raumtemperatur Kasten.
  7. Öffnen Sie ein hyb Kammer. Entfernen Sie die Deckeldichtung aus einem Wulst Chip durch Ergreifen der Dichtung an einer Ecke und sanft diagonal Peeling (siehe Abbildung 4). Sobald das Siegel entfernt, sofort platzieren Sie den Chip in einem Wulst Chip-Fach und tauchen in PB1 ohne Berührung der Perlen. Wiederholen, bis die Schale mit Perlen-Chips gefüllt, wobei darauf geachtet, keine Chips trocknen lassen.
  8. Rühren Sie die Schublade, alle Blasen zu entfernen und die Chips für 1 min eingetaucht.Füllen Sie einen zweiten Waschschale mit PB1. Schütteln Sie das Fach wieder.
  9. Bewegen Sie das Tablett mit Perlen Chips in den zweiten Waschschüssel. Vorsichtig geschwenkt und einwirken lassen für 1 min, dann wieder aufregen.
  10. In der flüssigen Durchfluss-Montagestation, legen vier schwarze Kunststoffdurchfluss Klammern in den Nuten. Füllen Sie die Station mit PB1, bis die Flüssigkeit fast die Höhe der acht Montagewinkel (ca. 150 ml) erreicht.
  11. Entfernen einer Wulst-Chip aus dem Fach und legen Sie sie in der Montagestation auf einer Kunststoffdurchfluss Klammer. Der Chip Barcode sollte über dem Barcode-Symbol in der Montagestation geätzt ausgerichtet werden. Wiederholen für die anderen drei Chips, die in der Montagestation passen.
  12. Legen Sie eine klare Kunststoff-Abstandhalter auf einem Wulst Chip. Die äußeren Ränder der Abstandshalter sollten die Klammern in der Montagestation zu umgeben. Wiederholen Sie dies für die anderen Chips in der PB1 getaucht.
  13. Setzen Sie die Kunststoff-Montageschiene in der Montagestation, indem Sie ihn in den Nuten. Sanft statt ein Glas Folie auf der Oberseite des Kunststoffabstandshalter, indem Sie das hintere Ende des Schlittens gegen die Montageschiene und langsames Absenken des vorderen in die Flüssigkeit. Die Nut auf der Oberseite des Schiebers nach unten weisen soll, direkt über dem Strichcode des Chips, wobei ein Spalt zwischen dem Wulst Chip und dem Schlitten auf den Barcode Ende. Wiederholen Sie dies für die anderen Chips in der PB1 getaucht. Für eine komplette Durchfluss-Montageplan, siehe Abbildung 5.
  14. Prüfen Sie, ob Luftblasen zwischen dem Chip und Rutsche. Wenn sich Blasen bilden, hebe die Folie auf den Barcode Ende und versuchen Sie es erneut. Persistent Blasen aus dem Glas mit einer Papierlabortuch (Kimwipe) abgewischt werden.
  15. Rasten zwei Metallklammern um die Glasobjektträger, einer zum Barcode Ende und ein nach hinten. Die Kanten der Schnallen sollte das Kunststoffgriffdurchfluss Klammer unter dem Chip. Wiederholen Sie für jeden Chip in PB1 getaucht.
  16. Entfernen Sie die abgeschlossen Durchfluss-Baugruppen und legen horizontal auf dem bench. Achten Sie darauf, die Montage vertikal kippen, so dass die Flüssigkeit unter dem Glasobjektträger zu entkommen. Wenn mehrere Chips in der Waschwanne warten, können sie unter den gleichen PB1 montiert werden. Wenn andere Chips werden in ihrer Original hyb Kammern warten, entsorgen Sie alle Flüssigkeit in der Montagestation und Geschirr spülen, und kehren Sie zu Schritt 7.6.
  17. Sobald alle Perle-Chips sind in ihrer Durchfluss Baugruppen, nehmen Sie eine chirurgische Schere und schneiden Sie beide Enden des Abstandhalters aus, als in der Nähe der Glasobjektträger, wie möglich.

8. Die Färbung und Verlängerung

  1. Überprüfen, ob der Durchflusskammer Gestell 44 ° C in mehreren Positionen mit einem Temperaturfühler erreicht. Wenn die Temperatur aus ist um mehr als ein halbes Grad, stellen Sie die Temperatur des Wasserbades.
  2. Legen Sie eine Perle Chip Durchfluss-Montage auf der Kammer-Rack, indem die Montage unten und Einhaken der Klammer an der Spitze. Die Rückseite der Perle Chip sollte die Kammer Rack berühren. Das glass Folie sollte dabei nach außen, mit der Nut an der Spitze, ein Reagenz Reservoir bilden. Wiederholen Sie für jede Perle Chip-Montage.
  3. Mit einer 200 ul Pipette 150 ul RA1to den Durchfluss Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 30 sek. 5x wiederholen.
  4. Mit einer 1000 ul Pipette 450 ul XC1to den Durchfluss Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 10 min.
  5. In 450 ul XC2 auf die Flow-Through-Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 10 min.
  6. In 200 ul TEM zu den Flow-Through-Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation: 15 min.
  7. In 450 ul 95% Formamid / EDTA-Mix auf die Flow-Through-Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 1 min. Wiederholen 1x.
  8. Inkubieren der Durchflussleitungen für 5 min.
  9. Stellen Sie die heißen Wasserbad auf die Temperatur lIsted auf den Rohren des STM (oder 37 ° C, wenn keines gezeigt ist). Stellen Sie sicher, dass jede STM Rohr hat die gleiche Temperatur aufgeführt.
  10. In 450 ul XC3 zu den Durchfluss Baugruppen. Inkubation für 1 min. Wiederholen 1x.
  11. Wenn die Heißwasserbadtemperatur die gewünschte Temperatur erreicht hat, hinzufügen 250 μLSTM den Durchflussanordnungen durch Abgeben der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 10 min.
  12. In 450 ul XC3 zu den Durchfluss Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 1 min. Wiederholen 1x.
  13. Inkubieren der Durchflussleitungen für 5 min.
  14. In 250 ul ATM auf die Flow-Through-Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 10 min.
  15. In 450 ul XC3 zu den Durchfluss Baugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 1 min. Wiederholen 1x.
  16. Inkubieren der Durchflussleitungen für 5 min.
  17. Add 250 ul STM auf die DurchflussBaugruppen durch Abgabe der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 10 min.
  18. Add4 50 ul XC3 den Durchflussanordnungen durch Abgeben der Flüssigkeit in den Glasbehälter. Inkubation für 1 min. Wiederholen 1x.
  19. Inkubieren der Durchflussleitungen für 5 min.
  20. Wiederholen Sie die Schritte 8,14-8,19 1x.
  21. Entfernen Sie die Durchfluss Baugruppen aus der Kammer Rack-und Ausschalten des Wasserbad.

9. Wasch-und Dicht

  1. Füllen Sie eine Färbung Wulst Chip Waschschale mit PB1 (ca. 315 ml). Zwei vertikalen Wasch Gerichte und eine vertikale Wulst Chipablage benötigt werden, zusammen mit mindestens einer Vakuumkammer.
  2. Demontieren Sie eine Durchfluss Montage durch Einsetzen einer dünnen Metallstange zwischen den Klammern und der Klammer und dann schwenken. Beiseite Glasrutsche und entfernen Sie die Wulst-Chip. Sofort legen die Perle in der vertikalen Chip Bead Chip-Fach und tauchen in PB1. Wiederholen Sie für jeden Durchfluss Montage, wobei darauf zu eac Gesichth Wulst Chip in der gleichen Richtung und minimiert den Einfluss von Luft.
  3. Rühren Sie vorsichtig die Wulst Chip-Fach, um Blasen zu entfernen. Die untergetaucht Wulst Chips Inkubation in PB1 für 5 min. Füllen Sie den zweiten vertikalen Waschschüssel mit dem XC4 am Vortag vorbereitet. Man schüttelt den Wulst Chip-Fach wieder.
  4. Bewegen Sie den Wulst Chip-Fach in die Waschschüssel mit XC4 gefüllt. Rühren Sie die Schublade, um Blasen zu entfernen. Inkubation für 5 min und wieder rühren.
  5. In einer fließenden Bewegung, ziehen Sie den Wulst Chip-Tray aus der Waschschüssel und Set auf einem Reagenzglasständer, so dass die Perlen auf jeder Wulst Spanfläche nach oben. Mit selbstsicher Pinzette, schieben Sie eine Perle Chip aus dem Fach und legen Sie auf einem Reagenzglas Rack. Wiederholen Sie für jede Perle Chip.
  6. Der Reagenzglasständer von Chips transferieren Sie Vakuumexsikkator. Schließen Sie und schalten Sie das Vakuum, wodurch eine ordnungsgemäße Abdichtung. Inkubation: 50-55 min. Wenn notwendig, erwärme den Scanner während der Inkubation.

10. Scannen

  1. Turn aus dem Vakuum und langsam den Druck auf Atmosphärendruck zurückzukehren. Überprüfen Sie, dass die Wulst-Chips trocken sind. Falls notwendig, reinigen Sie die Kanten und Unterseite des Chips mit einem Papiertuch, um alle flüssigen oder Ablagerungen zu entfernen.
  2. Aktivieren Sie die Scan-Software und Chips bewegen Wulst um den Scanfach. Laden Sie Dateien decodieren (dMAPS) des Chips durch die Aktivierung der Datei-Decode-Client-Software und Eingabe der gewünschten Wulst Chip Barcodes, zusammen mit ihren entsprechenden Feld-IDs. Ungescannte Wulst Chips können sicher in einem trockenen, dunklen Raum für bis zu 72 Stunden aufbewahrt werden.
  3. Sobald die Chips richtig in die Schublade eingelegt und die Decodier-Dateien werden von der Software erkannt, Scannen beginnen.

Representative Results

Ein richtig verarbeitet Wulst Chip sollte hell und deutlich roten und grünen Laser-Lichtintensitäten beim Scannen angezeigt. In Abbildung 6 zeigt die iScan Scan-Software eine Standard genomischen DNA-Probe erfolgreich zu einer benutzerdefinierten Bild SNP-Genotypisierung Array hybridisiert. Die markierten Nukleotide, die in den Ausbau und die Färbeschritte befestigt waren fluoreszieren unter den Lichtern der beiden Laser. Da diese Nukleotide selektiv erweitern den Wulst des Oligonukleotid-Kette an die fragmentierte DNA-Strang hybridisiert, und als die Oligonukleotid-Ketten sind direkt an der Stelle der Variante zu beenden, kann die Farbe und die Intensität des sich ergebenden Signals verwendet werden, die an die vorhandenen Allele zu bestimmen, SNP-Stelle.

Ein User-generierten Probenblatt, die Proben-IDs und klinische Informationen CHIPID und Lage entspricht, und ein Array-spezifischen SNP manifestieren, direkt von der Firma erhalten, notwendig sind beide um die sca importierennner Ausgabedateien in die Genome Analyse-Software. Beispiel Musterblätter können auf der Website des Unternehmens zu finden. Sobald die Genome Projekt erstellt wird, kann Genotypen aus den resultierenden Intensität Cluster von der Software automatisch generiert erzielt werden. Obwohl mehrere Display-Optionen bestehen, die Standardansicht, Norm-R (eine normierte Intensitätswert) vs Norm-Theta (ein Allel-Intensitätsverhältnis), ist oft die einfachste Handlung zu drei unterschiedliche Cluster unterscheiden. Die meisten SNPs sollte eine, zwei oder drei Gruppen zeigen, abhängig von der Neben Allelfrequenz.

Die drei Cluster stellen Proben demonstriert AA, AB oder BB-Allele (siehe Abbildung 7). Diese Cluster können Genotypen entweder, indem Sie eine Standard-Clustering-Position Vorlage direkt aus dem Unternehmen, indem Sie "Cluster Alle SNPs" aus der Symbolleiste Analyse der Software oder durch Klicken und Ziehen Sie die farbigen Kreise auf der Intensitätsgrundstücke manuell edi zugeordnet werden t nennt. Die Farbe der Probe von der Intensität Grundstück (rot, violett oder blau) gibt an, den Anruf (AA, AB oder BB, respectively), schwarz zeigt keine Anruf. Durch Scrollen durch die in der Volldatenbereich der Software aufgeführt SNPs kann das Clustering für jeden SNP angezeigt oder abgerufen werden. Sobald die Cluster zufriedenstellend Anrufe vergeben, wird die Volldatenbereich der Software sind die Genotypen für jede einzelne Probe bei jedem einzelnen SNP. Die Option Spaltenauswahl über der Tabelle können Datenformate umzuschalten.

Daten können entweder über die Symbolleiste Analyse oder direkt von der Full Data-Tabelle für eingehende Analyse exportiert werden.

Figur 1
Fig. 1 ist. Übersicht - Infinium Assay-Protokoll.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Komplette Hyb Kammerbasis und Matte sowie Deckel. [12] Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
Abbildung 3 Laden einer BeadChip -.. Dispense die Probe auf den Einlassöffnungen [12] Klicken Sie hier, um zu vergrößern Bild.

Fig. 4
Abbildung 4 Entfernen der BeadChip Cover -.. Fassen Sie die Dichtung an der Ecke diagonal schälen und sanft [12] Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 5
5. Komplette BeadChip Durchflussversammlung - Das BeadChip wird aus einem Glasobjektträger mit einem Abstandshalter getrennt und mit Klammern gebunden.> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 6
6. Erfolgreiche BeadChip Scan - A) Die BeadChip ist sowohl mit einem roten und grünen Laser abgetastet, die Scan-Software zeigt beide gleichzeitig. Sections vorbei Intensität QC wird grün auf dem BeadChip Display nach links zu markieren. § § andernfalls Intensität QC wird auf der Anzeige zu markieren BeadChip rot. B) Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, wird die Software die roten und grünen Anzeigen überlagern. Ein vergrößerten Bild gezeigt. Die Farbe und die Intensität der einzelnen Perle zeigt den aktuellen Allel. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


Abbildung 7. SNP-NORM-R vs NORM-THETA Clusterprofile - A) Eine gültige SNP mit drei verschiedenen Clustern, die AA, AB und BB-Genotypen, rot, lila, blau und b) ein SNP erfordern Bearbeitung.. Die mittlere Cluster, die homozygot AB sein soll, bleibt un-genannt. Die BB-Cluster fälschlicherweise als AB. C) Eine schlechte leistungs SNP. Keine Genotypen können von dieser Intensität Grundstück erhalten werden, da keine unterschiedliche Cluster existieren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Groß Genotypisierung Anwendungen verwendet worden, um den genetischen Mechanismus viele menschliche Krankheiten zugrunde liegen, besser zu verstehen. Die Entdeckung einer signifikanten Variante durch eine genomweiten Assoziationsanalyse kann eine Kandidatenregion für die weitere Untersuchung Flagge. Darüber hinaus ist Genotyp Daten ein gutes Werkzeug für die Qualitätskontrolle auf Sequenzierungsprojekten.

Um Probendurchsatz zu maximieren, können mehrere Probenplatten verstärkt und in ihrer fragmentiert, resuspendierten Staaten gespeichert werden. Acht Platten können an einem einzigen Tag verstärkt werden, die Kombination der ersten 24 Stunden des Protokolls für mehrere Chargen und Bereitstellung von genügend Material für ~ 2-8 Tagen Chip-Verarbeitung. Wenn Platten verstärkt werden vorher gehortet, und wenn neue Proben auf Chips hybridisiert sofort nach dem Scanvorgang beginnt mit dem vorherigen Lauf, kann die Verarbeitung kontinuierlich, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Probenvorbereitung Pause laufen. Daher wird zwar Proben drei Tage zu unterziehen die kompletteAssays können Daten täglich erzeugt. Assuming24 Chips werden jeden Tag verarbeitet werden, ermöglicht über ein 1.000 DNA-Proben auf einer 12-Sample-Wulst-Chip ausgeführt werden 5 Tage-Woche. Wenn jeder Schritt oder Reagenz ausgefallen ist, aber mehrere Batches könnte mit einem Risiko für eine schlechte Leistung sein, bevor eine Korrektur angewendet werden kann. Fehler können sich Aufmerksamkeit entgehen, bis die Arrays werden gescannt oder analysiert, daher, wenn der Durchsatz maximiert, Hunderte von Proben in verschiedenen Stadien des Protokolls vielleicht schon das gleiche fehlerhafte Behandlung nach Entdeckung erhielt. Wie verloren Reagenzien und Daten nicht wiederhergestellt werden können, muss der Benutzer diese Risiken gegen die Notwendigkeit einer beschleunigten Workflow wiegen.

Die Genome Analyse-Software ist die erste Chance, um wirklich beurteilen den Erfolg der Genotypisierung Prozess. Wenn die Norm-R vs Norm-Theta Intensität Stücke richtig gruppiert sind, sollte die durchschnittliche Anrufrate (Prozent des Gesamt SNPs erfolgreich typisiert) der Proben nähern sich 99%, obwohl dieser Wert variiert slightly je nach Array-Typ. Die Daten von jeder Probe mit einem Anrufrate niedriger als 85-90% ist nicht vertrauenswürdig und muss verworfen werden. Für die Qualitätskontrolle, sollten die Ergebnisse zu allen bisher bekannten Genotypen, wann immer möglich verglichen werden. Wenn keine solche Daten vorhanden sind, ist gewollt Probe Vervielfältigung ein nützliches Werkzeug bei der Überprüfung Platte oder Array-Platzierungen. Diese doppelten Paare sollten auf getrennten Chips, Platten, Chargen, oder Projekte gelegt werden, deren Genotypen bei der Erzeugung überprüft. Während spezifische QC Einschränkungen variieren je nach den Prüfer bevorzugt werden gemeinsame SNP Einschränkungen Beispielaufruf Erfolg, Hardy-Weinberg-Gleichgewicht oder missingness zwischen Fällen und Kontrollen, basiert, während gemeinsame Probe Einschränkungen werden auf Tarife für Gespräche, Mendel Unstimmigkeiten oder Querverweise auf Basis X-Chromosom Heterozygotie der klinischen Daten Geschlecht [13].

Wenn ein Problem auftritt, die Controls-Armaturenbrett, in der Analyse-Suite gefunden wird, kann die eingereicht werdenUnternehmen, um Ursache zu ermitteln. Diese Kontrollen können oft verengen das Thema auf die wahrscheinlichste Schritt oder Reagenzienversagen. Falls SNPs von Interesse sind durch eine Genotypisierung Infinium Experiment gefunden, sollten ihre Intensität Stücke doppelt überprüft in Genome für Clustering Fehler, bevor weitere Untersuchungen durchgeführt werden.

Ein fehlgeschlagener Versuch Infinium Genotypisierung ist wahrscheinlich auf menschliche Verarbeitungsfehler oder schlechte Qualität der eingesetzten DNA. Beispiel Quantifizierung müssen genau und präzise sein. Für beste Ergebnisse, alle Reagenzien hinzugefügt, um jede Probe oder Chip muss an der mit dem Protokoll festgelegten Volumen verzichtet werden. Pipetten sind ordnungsgemäß zu kalibrieren. Reagenzien dürfen nach Ablauf ausgeführt werden und sollte nicht einmal aufgetaut wieder eingefroren werden, mit Ausnahme der RA1 Reagenz. Um mögliche Färbung und Verlängerung Fehler zu minimieren, sollte das Formamid / EDTA-Mischung jeden Monat frisch zubereitet werden. Alle -20 ° C Reagenzien werden in nur manuelle Abtauen Gefriergeräte gelagert werden. Alle Laborgeräte in der st verwendetaining, Erweiterung und Wasch Teile des Protokolls sollten gründlich mit Wasser und einem milden Reinigungsmittel sofort bei Nichtgebrauch ausgespült werden. Die Befeuchtung Stauseen in der hyb Kammer sollte mit einem Reagenzglas Bürste und einem milden Reinigungsmittel gewaschen werden. Die Glasobjektträger mit 10% Bleichmittel gewaschen werden, wie durch ihre Benutzerhandbüchern angewiesen, einmal pro Woche.

Disclosures

Die Autoren dieses Artikels haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Acknowledgements

Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 und NIH R56 AI063274 versehen worden

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable or Equipment Manufacturer Part Number Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate Thermo Scientific AB-0765 1
Plate Mats Thermo Scientific AB-0674 2
Reagent Basin Fisher Scientific 13-681-502 9
Heat-seal Sheets Thermo Scientific AB-0559 1
Flow-through Spacer Fisher Scientific NC9563984 6
Pipette tips - 200 μl Rainin GP-L200F 192
Pipette tips - 10 μl Rainin GP-L10F 16
Pipette tips - 1,000 μl Rainin GP-L1000F 16
DNA Suspension Buffer Teknova T0220 0.5 ml
0.1 N NaOH Fisher Scientific AC12419-0010 0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade) Fisher Scientific A451 15 ml
Ethanol (200-proof) Sigma-Aldrich 459836 330 ml
Formamide (100%) Thomas Scientific C001K38 15 ml
EDTA (0.5 M) Amresco E177 0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette Rainin L8-10XLS 1
200 μl 8-channel Pipette Rainin L8-200XLS 2
1,000 μl Single-channel Pipette Rainin L-1000XLS 1
Microplate Shaker VWR 13500-890 1
Refrigerated Microplate Centrifuge VWR BK369434 1
Hybridization Oven Illumina SE-901-1001 1
Hybex Microsample Incubator SciGene 1057-30-0 1
Hybex MIDI Heat Block Insert Illumina BD-60-601 1
Heat Sealer Thermo Scientific AB-0384 1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat Illumina BD-60-402 2
Surgical Scissors Fisher Scientific 13-804-20 1
Flow Through Assembly Parts Illumina WG-10-202 8
Wash Rack and Dish Illumina BD-60-450 1
Genepaint Chamber Rack Tecan 760-800 1
Temperature Probe Illumina A1-99-109 1
Staining Rack and Dish Illumina WG-10-207 1
Self-Closing Tweezers Ted Pella, Inc 5374-NM 1
Vacuum Manifold Ted Pella, Inc 2240 1
iScan or HiScan Illumina - 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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