In vivo méthode d'imagerie à distinguer inflammation aiguë et chronique

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons une méthode d'imagerie non-invasive permettant de distinguer les stades inflammatoires. Administration systémique de luminol révèle des zones d'inflammation aiguë dépendent activité MPO dans les neutrophiles. En revanche, l'injection de lucigénine permet de visualiser l'inflammation chronique dépend de l'activité Phox dans les macrophages.

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Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation. J. Vis. Exp. (78), e50690, doi:10.3791/50690 (2013).

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Abstract

L'inflammation est un aspect fondamental de nombreuses maladies humaines. Dans ce reportage vidéo, nous démontrons techniques d'imagerie non invasives bioluminescence qui distinguent inflammation aiguë et chronique chez des modèles de souris. À une lésion tissulaire ou invasion pathogène, les neutrophiles sont la première ligne de défense, en jouant un rôle majeur dans la médiation de la réponse inflammatoire aiguë. Comme la réaction inflammatoire progresse, monocytes circulants migrent progressivement dans le site de la lésion et se différencient en macrophages matures, qui interviennent dans l'inflammation chronique et de promouvoir la réparation des tissus par l'enlèvement des débris de tissus et la production de cytokines anti-inflammatoires. L'injection intrapéritonéale de luminol (,4-phtalazinedione, sel de sodium 5-amino-2 ,3-dihydro-1) permet la détection d'une inflammation aiguë largement médiatisée par infiltrant les tissus neutrophiles. Luminol réagit spécifiquement avec le superoxyde généré dans les phagosomes de neutrophiles puisque les résultats de bioluminescence d'une myéloperoxydase (MPO) réaction médiée. Lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate) réagit également avec le superoxyde afin de générer la bioluminescence. Cependant, lucigénine bioluminescence est indépendant du MPO et il repose uniquement sur phagocyte NADPH oxydase (Phox) dans les macrophages au cours de l'inflammation chronique. Ensemble, luminol et lucigénine permettent la visualisation non invasive et l'évaluation longitudinale des différentes populations phagocytaires dans les phases inflammatoires aigus et chroniques. Compte tenu du rôle important de l'inflammation dans une variété de maladies humaines, nous pensons que cette méthode d'imagerie non-invasive peut aider à enquêter sur les rôles différentiels de neutrophiles et de macrophages dans une variété de conditions pathologiques.

Introduction

L'inflammation est une réponse biologique très réglementé impliqué dans une variété de maladies humaines, y compris l'infection microbienne 1, la cicatrisation 2, le diabète 3, 4 cancer, les maladies cardiovasculaires 5, 6 neurodégénératives, maladies auto-immunes et 7. inflammation des tissus nécessite une bonne coordination des différentes cellules immunitaires afin d'atteindre dégagement pathogène, la réparation des tissus et de la résolution de la maladie. Neutrophiles et les macrophages sont des médiateurs immunitaires clés de l'inflammation des tissus. Dans la phase aiguë de l'inflammation, les neutrophiles sont les premiers intervenants à divers stimuli nocifs et des lésions tissulaires 8. Les neutrophiles s'extravaser rapidement de la circulation au site de la lésion, où les cellules inactivent microbes envahisseurs en libérant des granulés anti-microbiennes et la phagocytose. Au cours de la phagocytose, les neutrophiles engloutir microbes envahisseurs en phagosomes, dans lequel les cellules produisent des niveaux élevés de superoxydeide (O 2 · -). Superoxyde phagosome est la principale source de beaucoup d'espèces réactives de l'oxygène en aval (ROS). Par exemple, on peut dismutées superoxyde en peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) par dismutation spontanée ou par la superoxyde dismutase (SOD) 9, 10. Dans les neutrophiles, la myéloperoxydase (MPO) convertit en outre du peroxyde d'hydrogène à de l'acide hypochloreux antimicrobien (HOCl) 11. Comme les réactions inflammatoires se poursuivent, monocytes circulants migrent progressivement vers le site de la lésion et se différencient en macrophages matures 2, dont la fonction phagocytaire aider à éliminer les agents pathogènes inactivés et les débris cellulaires. En outre, comme un régulateur clé dans la dernière phase de l'inflammation, les macrophages favorise la réparation des tissus en produisant des cytokines anti-inflammatoires 12 et en générant extracellulaire ROS à un niveau inférieur 9. Le ROS généré à ce stade ultérieur réguler le remodelage des tissus, formation de nouveaux vaisseaux, et reepithelialisation 13.

Phagocyte NADPH oxydase (Phox) est la principale source de production de superoxyde dans les deux neutrophiles et les macrophages 9. Phox est un complexe multi-unité dont l'assemblage est strictement réglementé 9. L'holoenzyme contient plusieurs sous-unités régulatrices cytosolique (p67 phox, p47 phox, p40 phox, et RAC) et une membrane-bound hétérodimère cytochrome b 558 (composé de sous-unité CYBA et CYBB). Cytochrome b 558 est le noyau réaction dans laquelle la sous-unité CYBB (également connu comme p91 phox et NOX2) effectue la première réaction en chaîne oxydo-réduction 9. Fait intéressant, ses sites d'assemblage sont différents entre les neutrophiles et les macrophages. Dans les neutrophiles au repos, le cytochrome b 558 est surtout présente dans la membrane des granules de stockage intracellulaires 14. Au cours de la phagocytose, les neutrophiles assembler les holoenzymes à phagosomes 9, où des niveaux élevés d'activité MPO sont également présents. Le neutrophiles Phox consomme rapidement l'oxygène et exerce son pouvoir microbicide par la production de ROS, un phénomène appelé l'explosion respiratoire 11. En revanche, les macrophages ont un faible niveau d'expression MPO et le cytochrome b 558 se trouve principalement dans la membrane plasmique 15, 16. Ainsi neutrophiles produisent des niveaux élevés de superoxyde de l'activité anti-microbienne, tandis que les macrophages génèrent moins de superoxyde des fonctions de réglementation 15.

Depuis l'inflammation est un complexe dans le processus vivo, des méthodes d'imagerie non invasives spécifiques pour les différentes phases de l'inflammation permettraient une évaluation quantitative et longitudinale de modèles de maladies. En utilisant des études mécanistes, nous avons déjà démontré que l'utilisation de deux agents chimiluminescents, le luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phtalazinedione) et lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate), Pour l'imagerie non-invasive de phase aiguë et chronique (retard) de l'inflammation, respectivement 17. Luminol permet de visualiser l'activité MPO neutrophiles dans la phase aiguë de l'inflammation 18-20, alors que la bioluminescence de lucigénine peut être utilisé pour évaluer l'activité des macrophages, en association avec la phase tardive ou une inflammation chronique 17. Dans ce manuscrit, nous avons utilisé deux modèles d'inflammation expérimentales (sc PMA et sc LPS) pour démontrer ces techniques d'imagerie.

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Protocol

Note: Toutes les études chez l'animal ont été réalisées selon des protocoles approuvés institutionnels et des lignes directrices de soins aux animaux.

1. Réactifs et solutions

  1. Solution PMA pour sc inoculation: Préparer une solution stock de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à 5 mg / ml dans le DMSO. Conservez la solution stock à -20 ° C. Avant inoculation, décongeler la solution de stock et diluer à 1 mg / ml de PMA dans PBS.
  2. LPS solution pour inoculation SC: Dissoudre lipopolysaccharide (LPS de Salmonella enterica sérotype Enteritidis) dans du PBS stérile à 1 mg / ml avant sc inoculation.
  3. Solution de luminol pour l'imagerie de phase aiguë: Dissoudre luminol (,4-phtalazinedione, sel de sodium de 5-amino-2 ,3-dihydro-1) dans une solution saline normale stérile (NaCl 0,9%) à 10 mg / ml. La solution peut être conservé à -20 ° C avant utilisation.
  4. solution de lucigénine pour l'imagerie de phase chronique: Dissoudre lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate) dans une solution saline normale stérileà raison de 2,5 mg / ml. La solution peut être conservé à -20 ° C avant utilisation.

2. Sous-cutanée PMA Inflammation du modèle

  1. Anesthésier la souris nude NCR dans une chambre d'induction avec 1-2% d'isoflurane. Confirmer l'anesthésie générale par la perte de circulation et une fréquence respiratoire constante. Transférer un animal à un cône de nez alimentée en gaz isoflurane à l'emploi et maintenir l'animal sous anesthésie.
  2. Utilisez un chiffon d'alcool isopropylique pour nettoyer et désinfecter le site d'injection sur le flanc gauche.
  3. En utilisant une technique stérile, injecter 50 ul de la solution d'inoculation PMA (contenant 50 mg de PMA) dans l'espace sous-cutané sur le flanc gauche. Éliminer le liquide en excès à partir du site d'injection à l'aide d'un tampon imbibé d'alcool isopropylique. Évitez l'utilisation de l'analgésie car il peut affecter les réactions inflammatoires.
  4. Déplacez l'animal dos à la cage de logement et de surveiller étroitement sa récupération de l'anesthésie. Afin d'aider à la récupération, utilisez un coussin chauffant pour garder l'animal au chaud.

3. Sous-cutanée LPS Inflammation du modèle

  1. Anesthésier souris C57BL/6J avec 1-2% d'isoflurane dans une chambre d'induction. Une fois que l'établissement anesthésie générale, transférer un animal à un cône de nez alimentée en gaz isoflurane et garder l'animal sous anesthésie.
  2. Utiliser un alcool isopropylique pour nettoyer la site d'injection sur le coussinet plantaire gauche.
  3. En utilisant une technique stérile, injecter 50 ul de la solution inoculation LPS (contenant 50 pg de LPS) dans le coussinet gauche. Éliminer le liquide en excès à partir du site d'injection à l'aide d'un tampon imbibé d'alcool isopropylique. Évitez l'utilisation de l'analgésie car il peut affecter les réactions inflammatoires.
  4. Déplacez l'animal dos à la cage de logement et de surveiller étroitement sa récupération de l'anesthésie. Utilisez un coussin chauffant pour conserver la chaleur animale pendant la récupération.

4. l'imagerie par bioluminescence de l'inflammation

  1. Anesthésier l'animal dans une chambre d'induction avec 2.1% de gaz isoflurane mélangé. Confirm anesthésie générale par la perte de circulation et une fréquence respiratoire constante.
  2. Alors que l'animal est encore sous anesthésie, par voie intrapéritonéale (IP) d'injecter la solution de luminol (10 mg / ml), ou la solution de lucigénine (2,5 mg / ml) pour l'imagerie de l'inflammation aiguë ou chronique, respectivement. La dose finale est de 100 mg / kg pour le luminol et 25 mg / kg pour lucigénine. Une dose plus faible de lucigénine (10-15 mg / kg) peut être utilisé pour éviter la toxicité possible pour certaines souches de souris. Les signes de toxicité comprennent l'essoufflement et une détresse respiratoire. La souche C57BL/6J a inférieur lucigénine tolérabilité que la souche nue RCN.
  3. Le transfert de l'animal dans la chambre de formation d'image d'un système d'imagerie par bioluminescence.
  4. Effectuez l'imagerie par bioluminescence séquentielle à des intervalles de 1 min. Chaque étape imagerie est composé de 1 min temps d'acquisition, f / arrêt = 1, binning = 16 et 0 sec retard.
  5. Dans le panneau d'acquisition d'image, pour permettre l'imagerie multi-étapes séquentielles, cliquez sur la séquence mise button. Fournir des mesures d'imagerie suffisantes dans le profil de l'acquisition pour déterminer le débit de luminescence maximale (généralement 15 étapes d'une minute suffiront). La section d'imagerie de 15 min est suffisante pour permettre l'absorption du substrat et la circulation systémique.
  6. Retirer l'animal de la chambre de l'imagerie et le ramener dans la cage du logement. Afin d'aider à la récupération, utilisez un coussin chauffant pour garder l'animal au chaud.
  7. Lors de l'analyse post-acquisition, utilisez le logiciel d'imagerie pour calculer signal de bioluminescence totale pic à travers des régions normalisées d'intérêt (ROI). Les images sont présentes que dans l'éclat des photons / sec / cm 2 / sr avec un seuil minimal et maximal indiqué. Les données quantitatives sont présentés comme des flux total en photons par seconde par le ROI.

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Representative Results

Nous avons procédé à l'imagerie par bioluminescence longitudinale pour évaluer l'inflammation aiguë et chronique dans les modèles expérimentaux d'inflammation. Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) est une protéine kinase C agoniste puissant (PKC) qui active Phox pour la production d'anion superoxyde et déclenche des réactions inflammatoires aiguës intenses 21. Injection sous-cutanée de 50 mg de PMA chez la souris nude NCR a causé une irritation rapide de la peau et une inflammation aiguë des sites d'injection 18, 22, 23. Nous avons procédé à l'imagerie par jour pendant 4 jours avec les premières images obtenues dès 3 heures après l'injection PMA. Figure 1 montre l'imagerie par bioluminescence longitudinal en utilisant le luminol et lucigénine comme substrats. Aux premiers stades de l'inflammation (3 heures), nous avons observé bioluminescence luminol significative indiquant des niveaux élevés d'activité de MPO neutrophiles dans les sites d'injection PMA. Non significatif bioluminescence lucigénine a été observée au cours de ces premières étapes de l'inflammation. A partir dujour 2, nous avons observé la formation de croûtes et donc réduit l'intensité de luminescence. Comme la cicatrisation est devenu évident (figure 1A, jour 3 et 4), nous avons observé augmentation constante de bioluminescence lucigénine (figure 1B). Ces résultats illustrent que la bioluminescence luminol est associé à la phase aiguë de l'inflammation, tandis que lucigénine bioluminescence est étroitement associée à la réparation des tissus à la fin des phases de l'inflammation.

Indépendamment, nous sc injecté 50 pg de lipopolysaccharide (LPS) dans les pattes des souris C57BL/6J de type sauvage, et réalisé l'imagerie par bioluminescence longitudinal pour un maximum de 10 jours (figure 2A). Le LPS est un composant de la membrane de bactéries gram-négatives. SC inoculation du LPS est capable de déclencher des réactions inflammatoires solides par l'activation du récepteur TLR4 et chimiokine / la production de cytokine inflammatoire ultérieur 24. Contrairement aux PMA qui active directement Phox pour productio dismutasen, LPS nécessite une longue période de temps pour activer complètement le tissu infiltrer phagocytes 18. Que les neutrophiles sont les premiers à répondre aux infections de microbe, nous avons observé bioluminescence luminol élevée pendant les 4 premiers jours de l'inflammation aiguë, qui a décliné après jour 5 (figure 2B). En revanche, la bioluminescence de lucigénine augmenté progressivement dans la phase tardive et chronique de l'inflammation (figure 2B, 5-10 jours).

Ensemble, ces résultats démontrent la capacité d'utiliser différentiel spécificité de substrat de distinguer les stades inflammatoires aiguës et chroniques. Surtout, l'imagerie est médiée par les activités enzymatiques endogènes des cellules immunitaires, et il n'est pas nécessaire pour l'expression ectopique de journalistes.

Figure 1
Figure 1. Dans l'imagerie par bioluminescence longitudinal vivo des phases aiguës et à la fin de l'inflammation. strong> (A) nous avons provoqué une inflammation du tissu local en injection sous-cutanée de 50 mg PMA, et effectué quotidiennement luminol (100 mg / kg, ip) et lucigénine (25 mg / kg, ip) l'imagerie par bioluminescence à partir de 3 heures après l'injection PMA. Aucune expérience significative auto-luminescence a été observée aux sites d'inflammation sans agents chimiluminescentes. (B) représentation quantitative de bioluminescence luminol et lucigénine aux sites d'injection. Dans la phase aiguë de l'inflammation, les signaux luminol ont dominé la sortie de la bioluminescence (3 h). Dans les derniers stades de l'inflammation, les sites d'injection ont eu plus de bioluminescence lucigénine par rapport à luminol (jour 4). Les barres d'erreur représentent les écarts-types de mesures de bioluminescence à chaque point de temps d'imagerie. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. (A) 50 pg de LPS a été injecté sc dans les pattes des souris C57BL/6J. Imagerie par bioluminescence longitudinale avec luminol et lucigénine ont été effectuées par jour pendant 10 jours. (B) représentation quantitative de bioluminescence luminol et lucigénine aux sites d'injection de LPS. Bioluminescence luminol a augmenté durant les 4 premiers jours de l'inflammation aiguë. Toutefois, dans les phases tardives / chronique de l'inflammation, les signaux luminol ont rapidement diminué et bioluminescence lucigénine progressivement augmenté. Les barres d'erreur représentent les écarts-types de mesures de bioluminescence à chaque point de temps d'imagerie. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Dans ce rapport, nous démontrons une méthode de bioluminescence pour l'imagerie non-invasive de l'inflammation chez les animaux vivants. Profitant de deux substrats luminescent, le luminol et lucigénine, la méthode peut distinguer les différentes phases de l'inflammation. Bioluminescence luminol est associée à des neutrophiles dans la phase aiguë de l'inflammation, de la bioluminescence alors que la lucigénine est médiée par des macrophages dans la phase chronique. Relativement faible (MW = 177,16 g / mol) et électriquement non chargée, le luminol peut facilement pénétrer le plasma et la membrane du phagosome 25-29. En outre, la luminescence du luminol est spécifique à l'activité de la MPO intracellulaire dans les neutrophiles 9. D'autre part, lucigénine est surtout membrane imperméable en raison de sa grande taille (MW = 510,5 g / mol) et deux charges positives 25, 27-30.

Neutrophiles et les macrophages assembler les holoenzyme Phox à différents endroits sous-cellulaires. Bien que les deux réactifsdépendent Phox pour fournir l'anion superoxyde (O 2 · -), la disparité dans la perméabilité cellulaire et MPO-dépendance permet de différencier les substrats phagocytes inflammatoires dans des modèles de maladies. Neutrophiles expriment la plupart des Phox dans la membrane des vésicules intracellulaires (phagosomes) 14, où des niveaux élevés de MPO sont également présents. En conséquence, le luminol bioluminescence est spécifiquement associé à neutrophiles activés lors d'une inflammation aiguë. En revanche, les macrophages se réunissent Phox dans la membrane plasmique comme ils s'infiltrent et viennent à échéance au cours de l'inflammation chronique 15. Lucigénine non perméable peut directement interagir avec le superoxyde extracellulaire produite par les macrophages pour produire bioluminescence inflammatoire chronique.

L'inflammation est un processus compliqué en vivo qui nécessite une bonne coordination de nombreux types de cellules et de diverses molécules de signalisation extracellulaire. Dans ce reportage vidéo, nous démontrons l'utilisation synergique des deux luminol et lucigénine, pour surveiller l'inflammation de la phase aiguë et tardive (chronique) dans des modèles animaux. Étant donné que ces substrats sont disponibles dans le commerce et relativement bon marché, nous croyons que cette méthode d'imagerie relativement simple et robuste peut être facilement convertis en applications in vivo dans de nombreux domaines thérapeutiques. Fait à noter, par rapport à des techniques d'imagerie de fluorescence PET IRM et le proche infrarouge (NIR), la méthode de chimioluminescence n'est pas idéal pour l'imagerie des tissus profonds en raison de spectres d'émission bleu de substrats. Pour améliorer la pénétration tissulaire, il a été récemment démontré que l'émission de chimiluminescence bleue peut être transféré à des nanoparticules co-administrés pour NIR émission 31. Une autre modification de leur structure chimique pourrait améliorer leur efficacité quantique pour la sortie de la lumière forte et affiner leurs spectres d'émission pour la pénétration tissulaire profond.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts dans cette étude.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation Nancy Lurie marques. Nous remercions le Dr Nancy E. Kohl pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Kin K. Wong pour son aide dans la préparation de ce reportage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO P8139  
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO L2012  
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO A4685  
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO M8010  
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA  

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hi there,

    I am Hussain from Germany and working on similar research topic. Please give me a chance to watch this video, at least for one time.
    Sincerely
    Hussain

    Reply
    Posted by: Hussain A.
    September 11, 2013 - 9:07 AM

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