Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

Neuroscience

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Summary

In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

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Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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Abstract

Eines der grundlegenden Interessen in den Neurowissenschaften ist es, die Integration von erregenden und hemmenden Eingänge entlang der sehr komplexen Struktur der dendritischen Baumes, die schließlich führt zu neuronalen Ausgang der Aktionspotentiale am Axon verstehen. Der Einfluss verschiedener räumlicher und zeitlicher Parameter des spezifischen synaptischen Eingang neuronale Ausgang wird derzeit untersucht, z. B. den Abstand Dämpfung von dendritischen Eingänge, die ortsabhängige Wechselwirkung von räumlich getrennten Eingängen der Einfluss GABAergig Hemmung exzitatorischen Integration linearen und nichtlineare Integration Modi und vieles mehr.

Mit schnellen Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA ist es möglich, genau zu untersuchen, die räumliche und zeitliche Integration der glutamatergen Anregung und GABAergen Hemmung. Critical technischen Anforderungen entweder eine ausgelöste Leuchtstofflampe, Leuchtdiode (LED) oder eine Zwei-Photonen-scanning Mikroskop zu dendritischen Zweigen, ohne dabei signifikante Foto-Schädigung des Gewebes sichtbar zu machen. Weiterhin ist es sehr wichtig, eine Mikro-Verstärker Iontophorese, das eine schnelle Kompensation der Kapazität hohe Pipetten ermöglicht haben. Ein weiterer entscheidender Punkt ist, dass kein Sender unfreiwillig durch die Pipette während des Experiments veröffentlicht.

Einmal eingerichtet, wird diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Signale mit einer hohen Spezifität Neurotransmitter und Lage geben. Im Vergleich zu Glutamat und GABA Uncaging, ermöglicht eine schnelle Iontophorese mit beiden Sendern gleichzeitig aber zu sehr weit entfernten Orten ohne Einschränkung des Sichtfeldes. Es gibt auch Vorteile gegenüber Schwerpunkt elektrische Stimulation von Axonen: mit Mikro-Iontophorese die Lage des Eingangs Website ist definitiv bekannt und es ist sicher, dass nur der Neurotransmitter von Interesse freigesetzt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass mit Mikro-Iontophorese werden nur diePostsynapse aktiviert und präsynaptischen Aspekte der Freisetzung von Neurotransmittern werden nicht aufgelöst. In diesem Artikel zeigen wir Ihnen, wie Sie Mikro-Iontophorese in Hirnschnitt Experimente.

Introduction

Neuronen im zentralen Nervensystem erhalten eine Vielzahl von synaptischen Eingänge auf ihren dünnen und verzweigten dendritischen Prozesse 1. Es sind die meisten der exzitatorischen dendritischen Eingänge glutamatergen Synapsen vermittelt. Diese Synapsen in einem räumlich verteilten Weise aktiviert werden, was zu postsynaptischen lineare Integration von exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSP). Wenn die Synapsen gleichzeitig und in räumlicher Nähe auf der Dendriten aktiviert sind, können diese exzitatorischen Eingänge supra-linear integriert werden und erzeugen dendritische Dornen 2-5.

Darüber hinaus hängt die Integration von exzitatorischen Eingänge von der Lage des Eingangs auf die dendritische Struktur. Signale, die am distalen Büschel Region ankommen sind viel stärker gedämpft als proximalen Eingänge aufgrund Kabel Filterung 6. Im Hippocampus, werden entfernte Eingänge zu den apikalen Dendriten Büschel durch eine andere Hirnregion als die auf proximalen dendri erzeugttes 7. Eine spannende Frage ist daher, wie synaptische Input von verschiedenen dendritischen Fächer verarbeitet und wenn dendritischen Integration regelt den Einfluss dieser geschichteten Eingänge auf neuronale Aktivität in unterschiedlicher Weise.

Nicht nur die funktionellen Eigenschaften, morphologische Merkmale des Dendriten, sind der Ort und die Clusterbildung der Eingänge, die die dendritische Integration von exzitatorischen Eingänge, die auch die zusätzliche hemmende Eingänge von GABAergen Terminals bestimmen maßgeblich die Wirksamkeit der glutamatergen Synapsen 8,9. Diese verschiedenen Aspekte der synaptischen Integration lässt sich ideal mit untersucht werden Neurotransmitter Mikro-Iontophorese, die räumlich definierte Anwendung verschiedener Neurotransmitter ermöglicht dendritischen Domänen. Wir zeigen hier, wie man erfolgreich etablieren Mikro-Iontophorese von Glutamat und GABA um das Signal Integration in Neuronen zu untersuchen.

Für diese Anwendung, spitzenhohe Beständigkeit Pipetten mit konzentrierter Neurotransmitter Lösungen gefüllt werden. Diese Pipetten sind in der Nähe der äußeren Membran der Zelle, wobei die Neurotransmitter-Rezeptoren befinden positioniert. Eine gute Visualisierung der dendritischen Äste erforderlich. Dies wird am besten durch Fluoreszenzfarbstoffe, die über der Patch-Pipette eingeführt werden. Dann wird eine sehr kurze (<1 ms) Stromimpuls (im Bereich 10 - 100 nA) verwendet wird, um die geladenen Neurotransmittermolekülen auszuwerfen. Mit diesen kurzen Pulsen und effektive Kapazität Kompensation kann postsynaptischen Potentiale oder Ströme mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision, die die Lage des exzitatorischen Eingang genau bekannt ist bedeutet hervorgerufen werden. Glutamate Mikro-Iontophorese kann Synapsen in einem definierten Radius, der kleiner als 6 um, wie hier (1 9) gezeigt wird, zu aktivieren, sondern es ist auch möglich, einzelne Synapse Auflösung 10-12 zu erreichen.

Heine, M., et al 13 erreicht, zu beschmutzen. Mit schnellen Mikro-Iontophorese ist es leicht möglich, zwei oder mehr iontophoretisches Pipetten verwenden und legen Sie sie in verschiedenen, auch weit entfernte Punkte auf der dendritischen Baum. Auf diese Weise läßt sich der Einbau von exzitatorischen Ereignisse, einschließlich der aus den verschiedenen Wegen, untersucht werden. Es ist auch möglich, eine Glutamat und GABA gefüllten Pipette iontophoretischen gleichzeitig verwenden. Auf diese Weise wird die Wirkung von GABA-erge Hemmung an verschiedenen Orten relativ zu der exzitatorischen Eingang (on-Pfad, außerhalb des Weges Hemmung) untersucht werden können. Auch die Auswirkungen der Hemmung durch Interneurone auf bestimmte neuronale Domains, wie distalen Dendriten, Soma oder Axonen 14, untersucht mit GABA Iontophorese werden. In kultivierten Neuronen, bietet schnellen Mikro-Iontophorese die Möglichkeit, Investigate einzelne Synapse Verteilung und die elementaren Aspekte der Kommunikation von Synapsen in Neuronen in viel mehr Details 10,11.

In diesem Artikel zeigen wir im Detail, wie Glutamat und GABA Iontophorese für den Einsatz in akuten Hirnschnitten, die Untersuchung synaptischer Integration von erregenden und hemmenden Eingänge ermöglicht in Abhängigkeit der Eingabe Lage, Eingang Stärken und Timing, allein oder im Zusammenspiel zu etablieren. Wir weisen darauf hin, die Vorteile und Grenzen dieser Technik und wie man erfolgreich beheben.

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Protocol

1. Systemanforderungen

  1. Mikroskop-System: Gut Visualisierung des Dendriten ist entscheidend. Falls vorhanden, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop-System. In unseren Experimenten verwendeten wir eine TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Deutschland oder Ultima IV-System, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin mit einem Ti ausgestattet: Sapphire ultraschnelle-gepulste Laser (Chameleon Ultra II, Coherent) und eine hohe NA Ziel (60X, 0,9 NA, Olympus) zur Visualisierung der Dendriten, die wir mit einem Fluoreszenzfarbstoff über die Patch-Pipette gefüllt hatte. Obwohl photo-Schäden als weniger stark mit der 2-Photonen-Scanning, reduzieren die Laserleistung (unter 8 mW im Gewebe) und Verweilzeiten (unter 1 us) oder so viel wie möglich.
  2. Eine zweite Möglichkeit besteht darin, eine Weitfeld-Lichtquelle (LED oder eine Leuchtstofflampe) synchron auslösen mit der Akquisition bis Belichtungszeit so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben einen Monochromator mit einer integrierten Lichtquelle (TILLPho verwendetTonika, Gräfelfing, Deutschland) auf einem Zeiss Axioskop 2 FS aufrechten Mikroskop, das mit Dodt kontrastreiche Infrarot-Beleuchtung (TILLPhotonics, Gräfelfing, Deutschland) ausgerüstet war. In unseren Experimenten Belichtungszeiten reichten von üblicherweise 10 ms bis max. 30 msec.
  3. Nutzen Sie eine schnelle Mikro-Iontophorese Verstärker, zB eine Zwei-Kanal-Mikro-Iontophorese-System MVCS-C-02 (NPI electronic, Tamm, Deutschland) mit schnellen Kapazität Entschädigung. Die spitzen Iontophorese Mikroelektroden haben Widerstände von 25 - 100 MOhm (entscheidend abhängig von der Größe der Spitze der Pipette und Form), und schnelle Anstiegszeiten kann nur erreicht werden, wenn die Kapazität Kompensation der iontophoretisches Verstärker optimal abgestimmt wird. Dieser schnelle Ausgleich ist notwendig, um Stromimpulse mit einer kurzen und schnellen Wirkungseintritt im Sub-Millisekundenbereich zur iontophoretisches Pipette anwenden und dadurch die Sender mit hoher räumlicher Auflösung in Messfelder unter 1 um 13 auszuwerfen. Iontophorese-Verstärker sind also ab mehrere andere Unternehmen, die wir nicht in unserem Labor getestet. Diese Geräte sind nach unserem Wissen nicht mit der Kapazität Kompensationsschaltungsanordnung ausgestattet.

2. Bereiten Lösungen

  1. Bereiten künstlichen Liquor (ACSF) und interne Lösung, da es für die experimentelle Design erforderlich ist. Die einzige zusätzlich zum inneren Lösung, die erforderlich ist, ist eine rote oder grüne Fluoreszenz-Farbstoff (zB 50 bis 200 um Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid, Invitrogen), abhängig von der optischen Vorrichtung. Hier ein Beispiel für ACSF Saccharose, die für die Präparation verwendet werden kann, in mM: NaCl 60, ​​100 Saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 CaCl 2, 5 MgCl 2, 20 Glukose, und für normale ACSF Lösung für Patch-Clamp-Experimente in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 15 Glukose.
  2. Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) Alle extrazellulären Lösungen ständig.
  3. Bereiten interne Lösung, beispielsweise in mm: 140 K-Gluconat, 7 KCl, 5 HEPES-Säure, 0,5 MgCl 2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA; mit 50-200 pM Alexa 488.
  4. Für Glutamat Mikro-Iontophorese Herstellung einer Lösung mit 150 mM Glutaminsäure und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0. In 50 -200 uM Alexa Fluor 488 oder 594 Hydrazid (Invitrogen) für die Visualisierung.
  5. Für Iontophorese von GABA bereiten eine 1 M GABA-Lösung und der pH-Wert bis 5 mit HCl 15. Bei diesem pH GABA aufgeladen ist, nur dann kann es unter Verwendung Iontophorese werden. Bitte beachten Sie, dass der niedrige pH-Wert in der Lösung auf den extrazellulären Raum ausgestoßen könnte bewirken GABA Getriebe selbst 16,17.
    Schützen Sie das GABA-Lösung vor Licht und häufig frisch zubereiten GABA Stammlösung, da ältere Lösung seine Wirksamkeit verlieren kann.
  6. Wenn es schwierig ist, GABAergic Veranstaltungen, ein hallo sehengh Cl - treibende Kraft interne Lösung, beispielsweise durch Weglassen KCl, könnte dazu beitragen, die GABAerge Ereignisse visualisieren, um zu sehen, wenn die GABA Iontophorese arbeitet, jedoch zu synaptischen Integration untersuchen eine physiologische Antriebskraft empfohlen werden könnte. Für allgemeine Erfassung von kleinen GABAergic Veranstaltungen kann ein Protokoll in 8C gezeigt helfen.

3. Ziehen Sie und testen Sie die Iontophorese Pipetten

  1. In der Regel ziehen die richtigen Pipetten ist vielleicht der wichtigste Schritt, um eine kontrollierte Neurotransmitter Iontophorese erreichen. Bei der Verwendung von Iontophorese in der Zellkultur, ist es möglich, sehr feine Elektroden ähnlich scharfen Mikroelektroden 10 ziehen. In patch-clamp Experimente in akuten Scheiben jedoch äußerst dünnen Pipetten auf der Scheibenoberfläche biegen, wenn sie in das Gewebe mit einem Winkel abgesenkt werden, wodurch es unmöglich tiefer Dendriten zu erreichen.
  2. Daher ziehen eine Pipette mit einem sehr kleinen Spitze, so dass kein neurotransmitter austreten kann, aber die Spitze hat noch steif genug sein, um in das Gewebe (Abbildung 2) zu durchdringen. Verwenden Sie zum Beispiel 150 GB F 8P Klasse Pipetten (Science Products, Hofheim, Deutschland) und einen horizontalen Puller (zum Beispiel ein DMZ-Universal-Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Deutschland, oder ein P-97 Abzieher, Sutter Instrument Company , Novato, CA) mit mehreren Ziehen Schritte, um eine kleine Öffnung, aber auch eine kurze Tapper mit einem steilen Winkel (Abbildung 2 und Tabelle 2) zu erreichen.
  3. Es ist auch möglich, Quarzglas Pipetten verwenden zu ziehen iontophoretischen Pipetten 10. Diese sollen eine bessere mechanische Eigenschaften aufweisen und zuverlässiger zu sein, aber spezielle Laser-Abzieher sind erforderlich. Es ist aber auch möglich, gute Ergebnisse beim Glaspipette, die in der Regel zum Ziehen Patch-Pipetten verwendet erzielen.
  4. Testen Sie die Pipette Leistung und Widerstand in einer Kammer ohne Gewebe, bevor Sie sie zum erstenZeit konnte seit Auslaufen von Glutamat schadet dem Gewebe.
  5. Richten Sie die Iontophorese Verstärker richtig. Dann füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter und Farbstoff enthaltenden Lösung und legen Sie sie in das Bad (ACSF).
  6. Kompensieren Sie die Kapazität (Abbildung 3). In der Regel sehr scharf Pipetten haben eine höhere Kapazität als diejenigen stumpf.
  7. Überprüfen Sie den Widerstand der Pipette: Der Mikro-Iontophorese Verstärker verwendet hier eine build-in Funktion für die Messung der Pipette Widerstand. Es erinnert an kurzen rechteckigen Testpulse, die mit einem Standard-Oszilloskop oder einem A / D-Karte mit einem Computer verbunden mit dem Erwerb Software überwacht werden kann. Abhängig von der Form und Größe der Spitze, sollte die Spitze einen Widerstand zwischen 25 bis 90 MOhm.
  8. Fokus auf die Spitze mit einem 60X oder 40X Wasserimmersionsobjektiv und Schalter auf Fluoreszenz-Bildgebung und, wenn möglich, zu vergrößern in. Wenn Fluoreszenzfarbstoff Lecks aus der Pipettenspitze, eine kleine positive (im Falle von gluTamate) oder negativ (im Falle von GABA, Abbildung 4) behalten Strom (<0,02 uA). Wenn das nicht hilft, um die Leckage stornieren, ändern Sie die Pipette.
  9. Tragen Sie einen starken Schritt aktuellen oder verwenden Sie die manuelle Auslösung und Überwachung der Spitze in der fluoreszierenden Bild zu sehen, ob die Lösung aus der Pipette ausgestoßen werden. Wie oben erwähnt, wird die Polarität des Stromimpulses von der Ladung des Moleküls, die angeblich ausgeworfen wird abhängig. Um Glutamat auszuwerfen ist es ein negativer Strom und für GABA ein positiver Strom (Abbildung 4).
  10. Luftblasen in der Pipette, die Block Ausstoß von Farbstoff und Sender, durch Anlegen einer hohen Ausstoß aktuellen mehrmals gelöscht werden.
  11. Zusammen genommen, wenn es keine sichtbare Leckage und Test Auswurf erfolgreich war, kompensieren die Kapazität und starten das Experiment.
  12. Achtung: Seit Kapazität Entschädigung durch eine Feedback-Schaltung erreicht wird, kann diese Schaltung Überschreitung oder schwingen, wenn es overcomp istensated. Vorsichtig mit dem Rad zur Einstellung Kapazität Entschädigung.
  13. Abhängig von der Abzieher Stabilität ist es manchmal notwendig, um die Einstellungen Abzieher von Zeit zu Zeit anpassen, da das Filament Eigenschaften verändert haben. Wenn jedoch einmal eine gute Pipette ausgebildet ist, kann es für einige Tage verwendet werden. Deshalb wird nach Fertigstellung das Experiment speichern die iontophoretisches Pipette in einem geschlossenen Behälter, ohne die Spitze.
  14. Für das nächste Experiment füllen Sie die Pipette mit dem Neurotransmitter Lösung gelten mehrere starke Impulse Auswurftaste, um die Spitze zu löschen und dann prüfen, ob die Eigenschaften (z. B. Widerstand) wesentlich ändern. Dann kompensieren die Kapazität und mit der Pipette wieder. Verwenden Sie nicht eine einzelne Pipette mit unterschiedlichen Neurotransmitter-Lösungen.

4. Bereiten Sie die Rätsel Slices

  1. Wenn Mikro-Iontophorese zum ersten Mal verwendet wird, auf jeden Fall bereiten die Scheiben nach dem Aufbau einer zuverlässig arbeitenden Puller Programm.
  2. <li> Perform Anästhesie und Enthauptung Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege Ihrer Institution oder Lokalbehörde.
  3. Nach der Entfernung des Gehirns, dann in eiskalte ACSF Saccharose (siehe Protokoll 2.1).
  4. Schneiden Sie die Region von Interesse in Scheiben entsprechender Dicke (z. B. 300 um).
  5. Inkubieren der Scheiben in ACSF Saccharose bei 35 ° C für 30 min. Anschließend Übertragung auf einen untergetauchten Haltekammer mit normaler ACSF bei Raumtemperatur.
  6. Während der Vorbereitung und Experiment carbogenize die ACSF rund um die Scheiben mit 95% O 2, 5% CO 2.

5. Stellen Sie eine Whole-cell Recording

  1. Positionieren Sie die Pipette Iontophorese (s) bereits in der Nähe der Scheibe Oberfläche vor dem Patchen einer Zelle, um dauerhafte Positionierung zu vermeiden, nach Gründung der whole-cell-Modus.
  2. Ziehen Sie einen niedrigen Widerstand Patch-Pipette (3 - 5 mOhm), füllen Sie es mit der dye enthält interne Lösung und gelten positiven Druck auf die Pipette (30 - 60 mbar).
  3. Geben Sie das Bad und den Ansatz der Zelle unter visuelle Führung (Infrarot Dodt Kontrast oder Zwei-Photonen-Gradienten kontrastreiches Bild).
  4. Überwachen Sie die Pipette Widerstand mit einem Test-Impuls (zB -10 mV, 20 ms) in Voltage-Clamp-Modus. Beim Berühren des Gewebes korrigieren Sie die Offset-Spannung.
  5. Nähern Sie die Zelle, und schieben Sie die Pipettenspitze in es, bis ein "Grübchen" ist deutlich zu erkennen. Sofort den Druck der Pipette, gelten 40 - 60 mbar Unterdruck und schalten Sie das Membranpotential auf -65 mV.
  6. Wenn die Haltestromwert Werte unter 100 pA erreicht, lassen Sie die Unterdruck.
  7. Nach dem Aufbau einer giga Dichtung (Widerstand> 1 G), Bruch der Membran mit einem kurzen, starken Sog auf die Pipette oder kurze Überkompensation der Kapazität Entschädigung Schaltung.
  8. Je nachdem, welcher Modus (Spannung oder Strom Klemme) ist erforderlichfür die experimentelle Design, angemessen zu kompensieren.
  9. Start, um den iontophoretisches Pipette in seine endgültige Position zu bringen. Wenn eine genauere Beschreibung, wie man erfolgreich durchführen Patch-Clamp-Aufnahmen benötigt wird, gibt es mehrere ausgezeichnete Leitlinien verfügbar 18,19.

6. Legen Sie die Pipette und Iontophoretische generieren Postsynaptische Iontophoretische Potential

  1. Im Allgemeinen kann iontophoretischen Ereignissen an definierten Stellen in Abhängigkeit von der gewünschten Experiment zum Beispiel bei einer spiny Dendriten Glutamat Mikro-Iontophorese, bei der dendritischen Welle Soma oder Axon Anfangsstück für GABA Mikro-Iontophorese hervorgerufen werden.
  2. Nähern Sie die Zelle bis zu etwa 1 um Distanz, ohne es zu berühren. Nach Erreichen der Position von Interesse ist es entscheidend, dass keine Neurotransmitter ausläuft und daß die Pipette Kapazität vollständig kompensiert.
  3. Wenn Annäherung der Zelle mit einem Glutamat gefüllt iontophoretischen pipette bewirkt nachweisbar Depolarisation des Membranpotentials, passen Sie die behalten, wenn möglich, Strom, oder ändern Sie die Pipette.
  4. Bewerben kurzen negativen Stromimpulse, beginnend bei Null und erhöhen die aktuelle systematisch (z. B. von 0,1 bis 0,4 ms, 0,01 bis 1 uA Impulse). Dies hilft, um herauszufinden, in welchem ​​Bereich die aktuellen iontophoretisches die gewünschten Antworten evoziert in der spezifischen experimentellen Aufbaus.
  5. Wenn es keine Reaktion nachweisbar, heben Sie die Pipette mehreren hundert Mikrometern und wenden Sie einen starken Auswurf Strom (> 0,1 uA), um die Spitze zu reinigen. Stellen Sie die Kapazität Entschädigung, nähern sich die Zelle, und versuchen Sie es erneut.
  6. Wenn es immer noch keine Antwort, reduzieren Sie die aktuelle behalten. Seien Sie sehr vorsichtig mit den DFÜ-Einstellungen da dieses Verfahren unkontrollierte Freisetzung von Neurotransmittern führen kann. Daher überwachen ständig die Aufnahme zu den jeweiligen Änderungen des Membranpotentials zu erkennen.
  7. Wenn es schwierig, GABAergic Ereignisse zu erkennen ist, kann es hilfreich sein, eine Verwendungn interne Lösung Zusammensetzung was in einem hohen Cl - treibende Kraft. Um dies zu erreichen, reduzieren Sie die Cl - Konzentration in der Pipette Lösung (siehe Abschnitt 2.6-Protokoll.). Dies wird in größeren GABAergic Ereignissen an Ruhemembranpotenzial aufgrund einer höheren treibende Kraft führen.
  8. Alternativ injizieren lange Stromstufen was Membranpotential von -100 mV Chancen auf -48 mV (8C). Mit diesem Protokoll die Cl - treibende Kraft bei hyperpolarisierte Potentiale verursacht einen depolarisierenden GABA Reaktion erhöht.
  9. Es ist auch möglich, den Schritt Strominjektion Protokoll verwenden, um die Umkehrung des evozierten Potentials Ereignisse, die die GABA-erge Art der Ereignisse zu bestimmen hilft zu bestimmen. Austritt von GABA ist schwerer zu erkennen als Leckage von Glutamat. In diesem Fall kann eine ständige Überwachung der Eingangswiderstand helfen, wenn die GABA Pipettenspitze nähert. Wenn der Eingang Widerstand abnimmt, nimmt die aktuelle behalten kann be erhöht oder eine andere Pipette verwendet werden.
  10. Als Kontrolle Experimente für Glutamat Iontophorese, empfehlen wir einen Ca 2 +-Imaging Experiment mit 200 uM OGB-1 und keine EGTA in der Pipette Lösung für lokale Calciumeinstrom visualisieren, die möglicherweise durch auslaufende Glutamat verursacht werden.
  11. In der Regel, um eine stabile Reaktion zu erzielen, ist es sehr wichtig, eine mechanisch stabile Pipette Drift mit der Zeit zu vermeiden. Drift kann durch Temperaturschwankungen verursacht werden, daher empfiehlt es sich, auf dem Gerät mindestens eine halbe Stunde wechseln, bevor die Messungen thermische Drift zu vermeiden. Achten Sie darauf, gute Dichtungen der Kartusche in die Pipette Halter verwenden und die Spitze ist wirklich fixiert. Der Halter selbst kann zusätzlich mit Teflon-Band befestigt werden, außerdem sicher sein, dass es keine Spannungen an den Kabeln aus dem headstage oder Manipulator, der auch eine potenzielle Quelle der Drift.

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Representative Results

Ein einfacher Ansatz, um die räumliche Ausdehnung der Iontophorese zu bestimmen ist, um den iontophoretischen Pipette schrittweise von Dendriten zurückzuziehen, während die ausgeworfene Glutamat konstant. Wir fanden, dass die räumliche Ausdehnung eines Mikro-iontophoretischen Stimulation einen Durchmesser von etwa 12 um (Fig. 1, Radius) hat. Wie tief in das Gewebe der Iontophorese verwendet werden kann, hängt von der Steifigkeit der Pipette. Doch die iontophoretisches Pipetten für Experimente in Scheiben (Abbildung 2), die hier erforderlich, verwendet, sind nicht die Begrenzung der Eindringtiefe. Vielmehr ist das optische System und die Abnahme der Auflösung in der Tiefe des Gehirns Scheibe ist der limitierende Faktor. Für eine gute Qualität der Aufnahme ist es entscheidend, dass kein Sender ist undicht aus der Pipette. Im Falle der Glutamat, kann ein Leck erkannt wird, wenn es einen plötzlichen Depolarisation wenn der Dendrit mit der Pipettenspitze angefahren wird, oder wenn die Basislinie plötzlich werdeninstabil (Abbildung 5). Nach dem Herstellen einer stabilen Aufzeichnung ist es möglich, EPSPs definierter Amplitude, dendritischen Dornen oder Aktionspotentiale mit dieser Technik an jedem Ort in der Dendriten (6) hervorzurufen. Durch die Anwendung Glutamat mit schnellen Mikro-Iontophorese, die Eigenschaften der EPSPs, deren Ausbreitung und Summation, gleichzeitig an verschiedenen, auch entfernte Standorte, untersucht (Abbildung 7). GABAergic Ereignisse können allein oder zusätzlich evoziert werden, um mit einem zweiten Pipette durch Füllen des iontophoretisches Pipette mit einer hochkonzentrierten Lösung GABA (siehe: Protokoll Abschnitt 2) Glutamat und einem positiven Auswurf Strom. Es ist ein einfaches Protokoll, um die GABAerge Charakter der Ereignisse zu bestätigen und GABAergen Veranstaltungen zu erleichtern, um zu erkennen, wenn nicht mit einem hohen Antriebskraft interne Lösung: Spritzen negative Ströme (ca. 1 sec; die Amplitude hängt von der Eingangswiderstand des Zelle), die sich in Hyperpolarisation voltage Schritte, beginnend bei etwa -100 mV und steigern Sie dann in 5 mV-Schritten (Abbildung 8). Bei sehr negativen Potentialen die GABAergen Ereignisse sind leichter zu erkennen, durch die höhere Antriebskraft. Und wenn die Signale um den berechneten Cl umkehren - Umkehr Potenzial für die Lösungen, ist es sehr wahrscheinlich, dass sie in der Natur sind GABAerge (Abbildung 8). Mit einem zusätzlichen GABA Mikro-Iontophorese Pipette, ist es möglich zu untersuchen, zum Beispiel die Wirkung von GABAergen Hemmung auf glutamatergen Veranstaltungen, wie dendritische Natrium / Kalzium Spikes, durch Variation der relativen Timing der dendritischen Dorn und IPSP (Abbildung 9), die relative Lage der beiden Ereignisse oder ihre Amplituden. (Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care durchgeführt und Verwenden Committee der Universität Bonn, das Deutsche Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen und des Landes Nordrhein-Westfalen.)


Abbildung 1. Räumliche Ausdehnung der iontophoretisch ausgeworfen Glutamat mit einer Pipette Rückzug bestimmt. A) Maximum Intensity Projection einer Zwei-Photonen-Bild eines CA1-Pyramidenzellen Dendrit mit 100 uM Alexa 594 und die iontophoretische Pipette in die Ausgangsposition (Maßstab 8 um) gefüllt. Einschübe zeigen Zurückziehen des iontophoretisches Pipette und die entsprechende iontophoretisches EPSP im Soma aufgezeichnet. Der Pfeil zeigt die Position des iontophoretischen Pipettenspitze. B) Entfernung Abhängigkeit von EPSP Amplituden relativ zu der Ausgangsposition des iontophoretischen Pipettenspitze (≤ 1 um von Dendriten, n = 6 Zweige). Damit konnten wir abschätzen den Radius des Glutamat systematisch Zurückziehen der Pipette verteilt. Inset zeigt repräsentative Beispiel Spuren. Fehlerbalken stellenMittelwert ± SEM. (Von Müller et al angepasst. 2012 9, mit Genehmigung von Elsevier).

Abbildung 2
Abbildung 2. Wie ein iontophoretisches Pipette aussehen sollte. A) Infrarot-CCD Bild eines iontophoretisches Pipette auf eine kleine 5,5 MOhm Patch-Pipette mit einem 60X Objektiv. B) Iontophoretische Pipette mit Skala unter Verwendung eines 60X Ziel verglichen. Kalibrierung: kleinste = 10 um.

Abbildung 3
Abbildung 3. Kapazität Kompensation der iontophoretisches Pipette mit der Build-in Test-Impuls (10 nA, 10 ms, npi electronic, Tamm,Deutschland). Es ist wichtig, die Kapazität vollständig zu kompensieren, um die richtige Pipette Widerstand zu überwachen und eine schnelle und genaue Neurotransmitter Anwendung zu gewährleisten.

Fig. 4
Abbildung 4. Grundlagen der Mikro-Iontophorese. A) Schematische Darstellung eines CA1 Pyramidenneuron in Ganzzell Patch-Clamp-Konfiguration und einer iontophoretisches Pipette mit Glutamat gefüllt. Glutamat ist negativ geladen, damit ein positiver Strom, der an der Pipette wird ein Auslaufen der Pipette zu halten: Die behalten positiv ist (linke Tafel). Um Glutamat aus der Pipette auszuwerfen, gelten ein negativer Strom (rechtes Bild). Auf diese Weise Glutamat aus der Pipette gezwungen und exzitatorischen postsynaptischen Ereignisse in der Zelle hervorrufen. B) Schematische Darstellung des CA1 Pyramidenneuron in Ganzzell Patch-Clamp-Konfiguration und einer iontophoretisches Pipette mit GABA gefüllt. GABA ist positiv bei einem niedrigen pH belastet. Daher wird ein negativer Strom aus undichten aus der Pipette (links) zu halten. Zum Auswerfen GABA gelten einen positiven Strom (rechtes Bild). Auf diese Weise kommt GABA aus der Pipette und hemmende Ereignisse in der postsynaptischen Zelle hervorzurufen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Gute und schlechte iontophoretisches Pipetten. A) Repräsentatives Beispiel eines iontophoretisches glutamatergen EPSP auf einem dendritischen Ast eines CA1 Pyramidenneuron generiert. B) repräsentatives Beispiel für einen iontophoretisches dendritischen Dorn erzeugt eine dendritische Filiale in der CA1-Region des Hippocampus mit laufenden mild Glutamat Leckage aus der Pipettenspitze.

Abbildung 6
Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse für einzelne Glutamat Mikro-Iontophorese. A) Schematische Darstellung eines gepatchten CA1 Pyramidenneuron und ein iontophoretisches Pipette mit Glutamat gefüllt. B) in einem EPSP CA1 Pyramidenneuron mit Glutamat Iontophorese hervorgerufen. C) Dendritische Na + / Ca 2 + Spike an einem proximalen Dendriten eines CA1 Pyramidenzellen evozierten Neuron, untere Kurve die Steigung der Spannung Kurve zeigt, zeigt die Spitze Spitze Steigung der dendritischen Dorn. D) Wenn die Erhöhung der Strom, der an der Iontophorese die Amplitude des EPSP wird zunehmen, bis es das Aktionspotential Schwelle überschreitet.

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Abbildung 7. Repräsentative Ergebnisse für doppelte Glutamat Mikro-Iontophorese an verschiedenen Orten auf der dendritischen Baum. A) Schematische Darstellung eines patched CA1 Pyramidenneuron und zwei iontophoretischen Pipetten mit Glutamat gefüllt, die an einem proximalen angeordnet sind, und einem distalen Dendriten sind. B) iontophoretische EPSP an einem proximalen Dendriten von CA1-Pyramidenzellen einem Neuron (1) hervorgerufen wird. C) iontophoretische EPSP an einem distalen Dendriten (2) hervorgerufen.

Fig. 8
Abbildung 8. Repräsentative Ergebnisse für GABA Mikro-Iontophorese. A) Schematische Darstellung eines gepatchten CA1 Pyramidenneuron und einer iontophoretischen Pipette mit GABA gefüllt.B) Iontophoretische IPSP an einem proximalen Dendriten eines CA1 Pyramidenneuron. Evozierte C) Lange Stromeinspeisung systematisch ändernden Amplituden zu einer CA1 Pyramidenneuron über die Patch-Pipette, um die Umkehr Potential der evozierten Ereignis (Strominjektionen von -400 pA bestimmen auf 0 pA). Artefakt zeigt die Zeit-Punkt der GABA Iontophorese. Die evozierte Ereignis eine Umkehrung Potential von etwa -70 mV (Pfeil).

Abbildung 9
Abbildung 9. Repräsentative Ergebnisse der gleichzeitigen Glutamat und GABA Iontophorese zur Integration von Hemmung und Erregung zu untersuchen. A) Schematische Darstellung eines gepatchten Pyramidenneuron und eine Pipette mit Glutamat (grün) und mit GABA (orange) gefüllt. B) iontophoretisch evoziertendendritischen Dornen Allein in den nachfolgenden Sweeps, zeigen geringere Spuren dV / dt, Spitzen dendritischen Dornen zeigen. C) iontophoretisch evozierte IPSP allein. D) Sowohl glutamatergen und GABAergen Ereignisse zusammen.

Ort Spezifität Transmitter Spezifität Toxizität / Nebenwirkungen Presynaptic Stimulation Langzeitversuch Kosten / Komplexität
Micro-Iontophorese + + + + + + + - + + + +
2-Photonen Uncaging + + + + + + + - + +
Synaptic Stimulation - - + + + + + + + + + + ++

Tabelle 1. . Vergleich verschiedener Techniken Vor-und Nachteile von Techniken, um Neuronen nach verschiedenen Kriterien zu stimulieren (- = schlecht, + = nicht optimal, + + = gut, + + + = sehr gut).

Patch-Pipetten Iontophoretische Pipetten
Pre-zieht P (A) Einzel-Pull Letzte Pull P (B) Pre-zieht P (A) Einzel-Pull Letzte Pull P (B)
Wärme H 700 480 510 600
Kraft Pre Pull F (TH) 018 035 018 008
Entfernung Threshold s (TH) 017 012 025 015
Verzögerung Heatstop t (H) 050 030 050 030
Entfernung Heatstop s (H) 030 000 030 000
Verzögerung F (F1) 000 136 000 050
Zugkraft 1 F1 000 065 200 400
Entfernung Pull 2 ​​s (F2) 000 005 000 001
Zugkraft 2 F2 000 080 000 095
Stellen (AD) 121 000 121 000

Tabelle 2. Beispielhaft Abzieher Protokoll. Für einen horizontalen Puller (DMZ-Universal-Abzieher, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Deutschland), mit GB150F-8P Filamente (Science Products, Hofheim, Deutschland) sowohl für Patch-und iontophoretisches Pipetten.

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Discussion

Hier erklären wir, wie man schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern gelten synaptischen Integration auf Dendriten zu untersuchen. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um glutamatergen und GABAergen synaptischen Übertragung in verschiedenen Hirnregionen in vitro und in vivo zu untersuchen 9,20-22. Micro-Iontophorese ist seit mehr als 60 Jahren verwendet worden, aber in den frühen Jahren war es meist verwendet, um entweder lokal gelten Neurotransmittern und Drogen bei langsamen oder mittleren Zeitskalen 23 oder für die Mikroinjektion von Substanzen in Zellen 24.

Micro-Iontophorese wurde ein besonders interessantes Werkzeug zur Untersuchung der dendritischen Integration seit Einführung der Verstärker, die mit einem schnellen Kapazität Entschädigung für hochohmigen Elektroden 10,11 ausgestattet sind. Mit dieser Verbesserung wurde es möglich, kurze rechteckige iontophoretisches Ströme was postsynaptischen Antworten, die Rese geltenmehr realistisch den Zeitverlauf der synaptischen Ereignisse 10,25 mbled.

Was sind die technischen Anforderungen und Schwierigkeiten zu bewältigen, bei der Festlegung von Mikro-Iontophorese? Lontophoretische Verstärker erforderlich ist, dass ermöglicht zur Kompensation der hohen Kapazität der feinen iontophoretisches Pipetten. Die richtige Abstimmung der Kapazität Kompensation ist sehr wichtig, wenn Betrieb mit hoher Geschwindigkeit in Verbindung mit hohem Widerstand Mikroelektroden erforderlich. Unkompensierter parasitären Kapazitäten werden von der iontophoresischen Strom, die von der mitgelieferten aufgeladen ist, und somit verlangsamt Anwendung. Ausgleichen der Kapazität richtig ist entscheidend und im Detail erklärt in dem Video. Zusätzlich ist es wichtig, dass das optische System eine gute Fluoreszenzbild des Dendriten und der iontophoretischen Pipette gibt ohne eine photo-Schädigung des Gewebes. Optimalerweise verwenden Sie einen Zwei-Photonen-System und reduzieren Laserleistung und Verweilzeiten so viel wie miteine ordentliche Bildqualität. Wenn eine herkömmliche Lichtquelle verwendet wird, stellen Sie sicher, um die Belichtungszeit so weit wie möglich zu reduzieren, zum Beispiel durch mechanische oder elektrische Rollläden Triggerung. Der wohl wichtigste Punkt ist die Pipette dar, die für eine definierte und spezifische Anwendung der Neurotransmitter verwendet ermöglicht. Dieser Schritt erfordert einigen Aufwand und Zeit, um die optimalen Einstellungen zu finden. Hier präsentieren wir Protokolle für Glutamat und GABA Iontophorese, wenn andere Neurotransmitter, Blocker oder Modulatoren verwendet werden, ist es notwendig, dass die Substanz sehr konzentriert ist und was noch wichtiger ist, dass es geladen wird. Da beispielsweise GABA eine Nettoladung von Null bei einem pH-Wert von 0 hat der pH-Wert auf (siehe Protokoll Abschnitt 2), was zu einer positiven Nettoladung.

Wenn Mikro-Iontophorese hergestellt ist, wird es eine erweiterte Toolset synaptischen Integration in Neuronen zu studieren. Es ermöglicht die Stimulierung Synapsen von Interesse selektiv miteine bestimmte Neurotransmitter. Verwendung einer ausgewählten Neurotransmitter an definierten Orten postsynaptischen Potentiale und Ströme und ihre Fortpflanzung untersucht werden. Weiterhin ist es möglich, mehrere iontophoretischen Elektroden gleichzeitig verwenden, um die Integration von mehreren glutamatergen Eingänge untersuchen oder systematisch die relative Zeitsteuerung oder die Stärke der Ereignisse.

Einige allgemeine kritische Punkte zu beachten bei der Verwendung von Mikro-Iontophorese werden. Das Profil von Neurotransmitter-Konzentration nach Mikro-Iontophorese ist anders als endogene Release. Murnick und andere 10 berichtet, dass die Geschwindigkeit der Freisetzung aus der Iontophorese Spitze (ca. 1 ms) wahrscheinlich deutlich langsamer als synaptische Freisetzung von Vesikeln, die in Bruchteilen einer Millisekunde (0,2 ms) 26 auftritt. Auch wird die Diffusion in und aus dem synaptischen Spalt wahrscheinlich verlangsamt Konzentration Aufstieg und Zerfall iontophoretisch angewendet Neurotransmitter.Darüber hinaus ist das Volumen der ausgestoßenen Neurotransmitter wahrscheinlich höher als physiologisch freigegeben Volumina jedoch mit hohem Widerstand Elektroden, Single glutamatergen und GABAergen Postsynapsen könnte aktiviert mit Mikro-Iontophorese 10-12 werden. Eine räumliche Selektivität im Bereich von wenigen Mikrometern hat kürzlich auch durch zwei-Photonen-Uncaging von Neurotransmittern 3,4,27 erreicht.

Während deutlich kostenintensiver, hat zwei-Photonen Uncaging mehrere Vorteile gegenüber Mikro-Iontophorese. Insbesondere kann es verwendet werden, um gleichzeitig Neurotransmitter freisetzen an mehreren synaptischen Seiten, und erfordert nicht die exakte Positionierung eines feinen Elektrode Spitze. Es können aber auch einige wichtige Nachteile bei der Wahl des für ein bestimmtes Experiment werden. Viele Käfig Verbindungen haben unerwünschte Nebenwirkungen, wie die Blockade von Neurotransmitter-Rezeptoren 28. Zum Beispiel, viele Glutamat und GABA KäfigeEs wurde berichtet, mit GABAergen Hemmung stören. Auch kann die relativ hohe Laserleistung für Zwei-Photonen-Uncaging erforderlich photo-Schaden der postsynaptischen Neuron führen, insbesondere, wenn die Stimulation wiederholt über mehrere Minuten angelegt. Hinzu kommt, dass Mikro-Iontophorese in der Anzahl der stimulierten Seiten begrenzt ist, können diese Seiten frei auf der gesamten Dendriten eines Neurons ausgewählt werden, zum Beispiel an den distalen und basalen Dendriten, dass sie geschichtete synaptischen Eingaben von verschiedenen Hirnregionen zu simulieren. Zwei-Photonen-Uncaging, wie sie derzeit von den meisten Gruppen verwendet wird, um synaptische Stellen in einem bestimmten Fokalebene und in dem Sichtfeld, die auf dem Ziel verwendet werden (typischerweise 40X oder 60X Wasserlagerung) hängt begrenzt. Es ist zu beachten, dass beide Techniken immer auf die Aktivierung des extrasynaptische Rezeptoren, die machen die Interpretation der Ergebnisse erschwert führen werden.

Ein weiterer Nachteil von Mikro-Iontophorese ist, dass our die Postsynapse aktiviert werden können. Wenn präsynaptischen Funktion und die Rolle der Vesikel freigesetzten Neurotransmitter in den experimentellen Schwerpunkt gesetzt werden müssen, können lokale elektrische Stimulation synaptischen eine Methode der Wahl sein. Allerdings sind die Nachteile von elektrischen synaptische Stimulation Mikro-Iontophorese Vergleich sind die unbekannten Ort der aktivierten Synapsen und die Co-Aktivierung von Axonen aus verschiedenen neuronalen Populationen, möglicherweise gehören anderen Neurotransmitter-Systeme (Tabelle 1).

Zusammenfassend der wichtigste Vorteil von Mikro-Iontophorese ist aus unserer Sicht, dass es möglich ist, mehrere verschiedene Neurotransmitter verwenden und ihre Interaktion auf die neuronale Fächer wie Dendriten 9 studieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann und Walker Jackson für das sorgfältige Lesen des Manuskripts. Die Autoren erhalten, die Finanzierung durch das Ministerium für Forschung MIWF des Landes Nordrhein-Westfalen (SR), der BMBF-Projekträger DLR deutsch-amerikanischen Zusammenarbeit in Computational Neuroscience (CRCNS; SR) zur Verfügung gestellt wurde, Centers of Excellence in Neurodegenerative Erkrankungen (COEN; SR) und der Universität Bonn intramural Förderprogramm (BONFOR; SR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany  
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA  
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent  
60X Objective, NA 0.9 Olympus  
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany  
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA  
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany  
  Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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