Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l'integrazione Synaptic

Neuroscience

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Summary

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

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Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

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Abstract

Uno degli interessi fondamentali nel campo delle neuroscienze è quello di comprendere l'integrazione di input eccitatori e inibitori lungo il molto complessa struttura dell'albero dendritico, che finisce per produzione neuronale di potenziali d'azione presso l'assone. L'influenza dei diversi parametri spaziali e temporali di specifica ingresso sinaptica neuronale in uscita è attualmente sotto inchiesta, ad esempio, la distanza di attenuazione in funzione degli ingressi dendritiche, l'interazione dipendente dalla posizione degli ingressi spazialmente segregati, l'influenza di inibizione GABAergig sull'integrazione eccitatorio, lineare e le modalità di integrazione non lineari, e molti altri.

Con rapido micro-ionoforesi di glutammato e GABA è possibile indagare con precisione la integrazione spaziale e temporale di eccitazione e di inibizione GABAergica glutammatergica. Requisiti tecnici critici sono o una lampada fluorescente triggered, diodi emettitori di luce (LED), o di un due fotoni SCAnning microscopio per visualizzare rami dendritici senza introdurre significative foto-danneggiamento del tessuto. Inoltre, è molto importante avere un amplificatore micro-ionoforesi che permette la rapida compensazione capacitanza di pipette ad alta resistenza. Un altro punto cruciale è che nessun trasmettitore è involontariamente rilasciato dalla pipetta durante l'esperimento.

Una volta stabilito, questa tecnica darà segnali affidabili e riproducibili con un alto neurotrasmettitore e la posizione specificità. Rispetto al glutammato e GABA uncaging, ionoforesi veloce permette utilizzando entrambi i trasmettitori contemporaneamente ma in luoghi molto distanti senza limitazione al campo di vista. Ci sono anche vantaggi rispetto alla focale stimolazione elettrica degli assoni: con micro-ionoforesi la posizione del sito di ingresso sicuramente noto ed è sicuro che solo il neurotrasmettitore di interesse viene rilasciato. Tuttavia è da considerare solo quest'ultimo con il micro-ionoforesipostsynapse si attiva e aspetti presinaptico del rilascio di neurotrasmettitori non sono risolti. In questo articolo mostriamo come configurare micro-ionoforesi in esperimenti fetta del cervello.

Introduction

Neuroni nel sistema nervoso centrale ricevono una varietà di input sinaptici sul loro processi dendritici sottili e ramificate 1. Lì, la maggioranza degli ingressi eccitatori dendritiche sono mediate da sinapsi glutamatergiche. Queste sinapsi possono essere attivati ​​in modo spazialmente distribuito, con conseguente integrazione lineare postsinaptica dei potenziali post-sinaptici eccitatori (EPSPs). Se le sinapsi vengono attivati ​​contemporaneamente e in prossimità spaziale sul dendrite, questi ingressi eccitatori possono essere integrati sovra-lineare e generano picchi dendritica 2-5.

Inoltre, l'integrazione di ingressi eccitatori dipende dalla posizione dell'ingresso sull'albero dendritico. I segnali che arrivano alla regione ciuffo distale sono molto più attenuate rispetto ingressi prossimale a causa di filtraggio cavo 6. Nell'ippocampo, ingressi lontane verso le dendriti apicali ciuffo sono generati da una regione del cervello differente rispetto a quelli su prossimale dendriTES 7. Una domanda interessante è quindi, come ingresso sinaptica viene elaborato da diversi compartimenti dendritici e se l'integrazione dendritica regola l'influenza di questi ingressi a strati su neuronale in modi diversi.

Non solo le proprietà funzionali, le caratteristiche morfologiche del dendrite, la posizione e il clustering degli ingressi stanno interessando l'integrazione dendritica di input eccitatori, anche gli ingressi inibitori aggiuntivi da terminali GABAergici cruciale determinare l'efficacia delle sinapsi glutamatergiche 8,9. Questi diversi aspetti dell'integrazione sinaptica possono essere idealmente studiati usando neurotrasmettitore micro-ionoforesi, che permette l'applicazione spazialmente definita di diversi neurotrasmettitori a domini dendritiche. Dimostriamo qui come stabilire con successo micro-ionoforesi di glutammato e GABA per indagare l'integrazione del segnale nei neuroni.

Per questa applicazione, a punta finealta resistenza pipette riempite con soluzioni concentrate neurotrasmettitori vengono utilizzati. Queste pipette sono posizionati vicino alla membrana esterna della cellula, dove si trovano i recettori dei neurotrasmettitori. È necessaria una buona visualizzazione dei rami dendritici. Ciò si ottiene utilizzando coloranti fluorescenti, che vengono introdotti attraverso la pipetta di patch. Poi un brevissimo (<1 msec) impulso di corrente (nell'intervallo di 10-100 nA) viene utilizzata per espellere le molecole del neurotrasmettitore cariche. Con queste brevi impulsi rapidi ed efficaci alle capacità, potenziali post-sinaptici o correnti possono essere evocate con alta precisione temporale e spaziale, il che significa che la posizione del input eccitatorio sia noto con precisione. Glutammato micro-ionoforesi può attivare sinapsi in un raggio definito, che è più piccolo di 6 ìm come qui mostrato (Figura 1 9), ma è anche possibile raggiungere sola risoluzione sinapsi 10-12.

Heine, M., et al 13. Con la veloce micro-ionoforesi è facilmente possibile utilizzare due o più pipette iontoforesi e metterli a diversi punti, anche lontani sull'albero dendritico. In questo modo, l'integrazione di eventi eccitatori, compresi quelli di differenti vie, può essere indagato. È anche possibile utilizzare un glutammato e GABA una pipetta riempita Iontoforetico contemporaneamente. In questo modo l'effetto di inibizione GABAergica in luoghi diversi relativi all'ingresso di eccitatorio (on-path, off-path inibizione) può essere studiato. Inoltre, l'impatto della inibizione da interneuroni di targeting specifici domini neuronali, come dendriti distali, soma o assoni 14, può essere indagato mediante ionoforesi GABA. In neuroni in coltura, veloce micro-ionoforesi offre l'opportunità di investigate distribuzione sinapsi singolo e gli aspetti elementari della comunicazione sinaptica in neuroni in modo molto più dettagliato 10,11.

In questo articolo si dimostra in dettaglio come stabilire ionoforesi glutammato e GABA per l'uso in fettine di cervello acuto, che permette di indagare l'integrazione sinaptica degli input eccitatori e inibitori in dipendenza della posizione di ingresso, i punti di forza di input, e la tempistica, da soli o in interazione. Noi evidenziare i vantaggi ei limiti di questa tecnica e su come risolvere i problemi con successo.

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Protocol

1. Requisiti di sistema

  1. Sistema microscopio: buona visualizzazione del dendrite è cruciale. Se disponibile, utilizzare un sistema di microscopio a scansione laser a due fotoni. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un ambito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, in Germania o in un sistema di Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin dotato di Ti: Sapphire ultraveloce-laser pulsato (Chameleon Ultra II, coerenti) e un obiettivo di alto NA (60X, 0.9 NA, Olympus) per visualizzare le dendriti che avevamo riempito con un colorante fluorescente tramite la pipetta di patch. Sebbene foto-danneggiamento è pensato per essere meno grave utilizzando la scansione 2-fotone, ridurre la potenza del laser (di seguito 8 mW a tessuto) ei tempi di sosta (sotto di 1 msec), o il più possibile.
  2. Una seconda possibilità è quella di attivare un largo campo sorgente luminosa a fluorescenza (LED o una lampada fluorescente) sincrono con acquisizione di ridurre il tempo di esposizione il più possibile. Abbiamo utilizzato un monocromatore con una fonte di luce integrata (TILLPhotonici, Gräfelfing, Germania) su una Zeiss Axioskop 2 FS microscopio verticale che era dotata di Dodt contrasto di illuminazione a infrarossi (TILLPhotonics, Gräfelfing, Germania). Nei nostri esperimenti tempi di esposizione variano da solitamente 10 msec a max. 30 msec.
  3. Utilizzare un amplificatore micro-ionoforesi veloce, ad esempio un sistema di micro-ionoforesi due canali MVCS-C-02 (NPI elettronica, Tamm, Germania) con compensazione capacità veloce. I microelettrodi ionoforesi punta fine hanno resistenze di 25-100 MW (fondamentalmente a seconda della dimensione della punta e la forma della pipetta), e tempi di salita rapidi possono essere raggiunti solo se la compensazione capacità dell'amplificatore iontoforetica è sintonizzato in modo ottimale. Questa compensazione veloce è necessario applicare impulsi di corrente con un breve e rapido inizio nel range sub-millisecondo alla pipetta iontoforetica e quindi per espellere il trasmettitore con alta risoluzione spaziale in formati di punto sotto 1 um 13. Amplificatori ionoforesi sono alcosì disponibile da diverse altre aziende, che non abbiamo testato nel nostro laboratorio. Questi dispositivi sono a nostra conoscenza non dotati di circuiti di compensazione capacitanza.

2. Preparare le soluzioni di

  1. Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione interna come è richiesto per la progettazione sperimentale. L'unica aggiunta della soluzione interna, che è richiesto, è un colorante fluorescente rosso o verde (es. 50 a 200 pM Alexa Fluor 488 o 594 idrazide, Invitrogen), secondo il componente ottico. Qui un esempio per ACSF saccarosio che può essere utilizzato per la dissezione, in mM: NaCl 60, ​​100 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 1 CaCl 2, 5 MgCl 2, 20 glucosio, e per il normale ACSF soluzione per esperimenti di patch-clamp in mm: 125 NaCl, KCl 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl 2, 1.3 MgCl2, 15 glucosio.
  2. Carbogenize (95% O 2, 5% di CO 2) tutte le soluzioni extracellulari costantemente.
  3. Preparare soluzione interna, per esempio, in mM: 140 K-gluconato, 7 KCl, HEPES 5-acido, 0.5 MgCl2, 5 fosfocreatina, 0.16 EGTA, con 50-200 mM Alexa 488.
  4. Per glutammato micro-ionoforesi preparare una soluzione con 150 mM di acido glutammico e regolare il pH a 7,0 con NaOH. Aggiungere 50 -200 micron Alexa Fluor 488 o 594 hydrazide (Invitrogen) per la visualizzazione.
  5. Per ionoforesi del GABA preparare una soluzione 1 M GABA e regolare il pH a 5 con HCl 15. A questo pH GABA è carica, solo allora può essere applicato mediante iontoforesi. Si ricorda che il basso pH nella soluzione espulso nello spazio extracellulare potrebbe effetto trasmissione GABA sé 16,17.
    Proteggere la soluzione GABA dalla luce e spesso preparare fresco soluzione madre GABA, in quanto soluzione più vecchio può perdere la sua efficacia.
  6. Se è difficile vedere gli eventi GABAergici, un high Cl - driving soluzione interna forza, per esempio lasciando fuori KCl, potrebbe aiutare a visualizzare gli eventi GABAergici per vedere se la ionoforesi GABA sta lavorando, ma per indagare l'integrazione sinaptica una forza motrice fisiologico potrebbe essere raccomandato. Per il rilevamento generale di piccoli eventi GABAergici, un protocollo illustrato nella Figura 8C può aiutare.

3. Tirare e testare i Pipettes ionoforesi

  1. In generale, tirando le pipette giuste è forse la fase più critica per ottenere neurotrasmettitore ionoforesi controllata. Quando si utilizza ionoforesi in coltura cellulare, è possibile tirare molto fini elettrodi simili a microelettrodi taglienti 10. In esperimenti di patch-clamp in fettine acute, tuttavia, queste pipette molto sottili si piegano sulla superficie fetta quando vengono calate in tessuto con un angolo, il che rende impossibile raggiungere dendriti più profondi.
  2. Pertanto, tirare una pipetta con una punta molto piccola, in modo che nessuna neurotransmitter può fuoriuscire, ma la punta deve essere ancora abbastanza rigida per penetrare nel tessuto (Figura 2). Ad esempio, utilizzare 150 GB F 8P pipette di classe (Science Products, HOFHEIM, Germania), e un estrattore orizzontale (ad esempio un estrattore DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, in Germania, o di un P-97 Puller, Sutter Instrument Company , Novato, CA) con varie fasi tirando per ottenere una piccola apertura, ma anche a breve maschiatore con un angolo ripido (Figura 2 e Tabella 2).
  3. È anche possibile utilizzare pipette di vetro di quarzo di tirare pipette iontoforesi 10. Queste dovrebbero avere migliori proprietà meccaniche e di essere più affidabile, ma estrattori laser speciali sono necessari. Ma è anche possibile ottenere buoni risultati con pipette di vetro normali, che di solito vengono utilizzati per tirare pipette di patch.
  4. Verificare le prestazioni e la resistenza pipetta in una camera senza tessuto, prima di usarli per la primatempo, poiché fuoriuscita di glutammato potrebbe danneggiare il tessuto.
  5. Impostare l'amplificatore ionoforesi correttamente. Poi riempire la pipetta con il neurotrasmettitore e colorante soluzione contenente e metterlo nella vasca da bagno (ACSF).
  6. Compensare la capacitanza (Figura 3). Di solito pipette molto tagliente avranno una capacità maggiore di quelli contundenti.
  7. Verificare la resistenza della pipetta: L'amplificatore micro-ionoforesi qui utilizzato ha un accumulo in funzione per misurare la resistenza pipetta. Evoca brevi impulsi di prova rettangolari, che possono essere monitorati con un oscilloscopio standard o una scheda A / D collegato a un computer con il software di acquisizione. A seconda della forma e delle dimensioni punta, la punta dovrebbe avere una resistenza tra 25-90 MW.
  8. Focus sulla punta con un obiettivo ad immersione in acqua 60X o 40X e passare l'imaging a fluorescenza e, se possibile, lo zoom in Se fluorescenti perdite colorante fuori della punta della pipetta, applicare una piccola positivo (nel caso di glutamate) o negativo (nel caso del GABA, figura 4) mantengono corrente (<0,02 μA). Se questo non aiuta ad annullare le perdite, cambiare la pipetta.
  9. Applicare una forte corrente passo o utilizzare il trigger manuale e monitorare la punta nell'immagine fluorescente per vedere se la soluzione può essere espulso dalla pipetta. Come menzionato sopra, la polarità dell'impulso di corrente dipende dalla carica della molecola che dovrebbe essere espulso. Per espellere glutammato è una corrente negativa e per GABA una corrente positiva (Figura 4).
  10. Le bolle d'aria nella pipetta quel blocco espulsione di colorante e trasmettitore, possono essere cancellati mediante l'applicazione di un alto espulsione corrente più volte.
  11. Presi insieme, se non vi siano perdite visibili ed espulsione test ha avuto successo, compensare la capacitanza e iniziare l'esperimento.
  12. Attenzione: Poiché la compensazione capacitanza viene raggiunto da un circuito di retroazione, questo circuito può oscillare overshoot o se è overcompensated. Utilizzare con cautela la impostazione di selezione per la compensazione di capacità.
  13. A seconda della stabilità estrattore a volte è necessario regolare le impostazioni estrattore di volta in volta, in quanto il filamento potrebbe essere cambiato proprietà. Tuttavia, se una volta che una buona pipetta è progettato, può essere utilizzato per diversi giorni. Pertanto, dopo aver terminato l'esperimento memorizzare la pipetta Iontoforetico in un contenitore chiuso senza danneggiare la punta.
  14. Per il prossimo esperimento riempire la pipetta con la soluzione di neurotrasmettitore, applicare più forti impulsi di espulsione per rimuovere la punta e poi verificare se le proprietà (per esempio resistenza) cambia in modo significativo. Poi compensare la capacitanza e utilizzare nuovamente la pipetta. Non utilizzare un solo pipetta con soluzioni differenti neurotrasmettitori.

4. Preparare le Fette cervello

  1. Se il micro-ionoforesi è utilizzata per la prima volta sicuramente preparare le fette dopo che istituisce un programma estrattore di lavoro affidabile.
  2. <li> eseguire l'anestesia e la decapitazione procedure in conformità alle linee guida per la cura degli animali del vostro istituto o ente locale.
  3. Dopo la rimozione del cervello, trasferirla a ghiaccio freddo ACSF saccarosio (vedi 2.1 Protocol).
  4. Tagliare la regione di interesse in fette di spessore adeguato (per esempio 300 micron).
  5. Incubare le fette in ACSF saccarosio a 35 ° C per 30 min. In seguito, trasferirli su una camera di contenimento sommersa contenente ACSF normale a temperatura ambiente.
  6. Tutta la preparazione e l'esperimento carbogenize ACSF circonda le fette con 95% O 2, 5% di CO 2.

5. Stabilire una registrazione Whole-cell

  1. Posizionare la pipetta iontoforesi (s) già vicino la superficie fetta prima patch una cella, per evitare il posizionamento di lunga durata, dopo aver stabilito la modalità a cellula intera.
  2. Tirare una resistenza bassa toppa pipetta (3-5 MW), riempirlo con il dye contenente soluzione interna e applicare pressione positiva alla pipetta (30 - 60 mbar).
  3. Inserisci il bagno e l'approccio alla cella sotto guida visiva (contrasto Dodt infrarossi o due di contrasto immagine gradiente fotone).
  4. Monitorare la resistenza pipetta con un impulso di prova (ad esempio -10 mV, 20 msec) in modalità morsetto di tensione. Quando si tocca il tessuto correggere il potenziale di offset.
  5. Avvicinarsi alla cella e premere delicatamente la punta della pipetta in esso fino a quando un "fossetta" può essere visto chiaramente. Rilasciare immediatamente la pressione della pipetta, applicare 40 - 60 mbar pressione negativa e commutare il potenziale di membrana a -65 mV.
  6. Quando la corrente di mantenimento raggiunge valori inferiori a 100 pA, rilasciare la pressione negativa.
  7. Dopo aver stabilito un sigillo giga (resistenza> 1 GΩ), la rottura della membrana con una breve e forte aspirazione alla pipetta o breve sovracompensazione del circuito di compensazione capacità.
  8. A seconda del modo (morsetto di tensione o corrente) è richiestoper il disegno sperimentale, compensare adeguatamente.
  9. Iniziare a portare la pipetta Iontoforetico nella sua posizione finale. Se è necessaria una descrizione più dettagliata di come eseguire correttamente le registrazioni di patch clamp, ci sono diversi ottimi linee guida disponibili 18,19.

6. Posizionare la pipetta Iontoforetico e generare un potenziale Iontoforetico Postsynaptic

  1. In generale, gli eventi iontoforesi possono essere evocate in punti specificati seconda dell'esperimento desiderato, per esempio, ad un dendrite spinosa per glutammato micro-ionoforesi, sull'albero dendritico, soma o assone segmento iniziale per GABA micro-ionoforesi.
  2. Avvicinarsi alla cella fino a circa 1 micron distanza senza toccarlo. Dopo aver raggiunto la posizione di interesse è fondamentale che non siano perdite di neurotrasmettitore e che la capacità pipetta viene compensata correttamente.
  3. Se si avvicina la cella con un glutammato riempito pipett Iontoforeticoe provoca depolarizzazione rilevabile del potenziale di membrana, regolare la corrente conservano se possibile, o cambiare la pipetta.
  4. Applicare brevi impulsi di corrente negativi, partendo da zero e aumentare la corrente sistematicamente (es. 0,1 - 0,4 msec, 0,01-1 μA impulsi). Questo aiuta a scoprire in cui l'intervallo di corrente Iontoforetico evoca le risposte desiderate nella specifica configurazione sperimentale.
  5. Se non vi è alcuna risposta rilevabile, sollevare la pipetta diverse centinaia di micrometri e applicare una forte corrente di espulsione (> 0,1 μA) per pulire la punta. Regolare la compensazione capacità, avvicinarsi alla cella, e riprovare.
  6. Se non vi è ancora alcuna risposta, ridurre la corrente di trattenere. State molto attenti con le impostazioni di chiamata in quanto questa procedura può causare la fuoriuscita incontrollata di neurotrasmettitore. Pertanto, monitorare costantemente il controllo per rilevare rispettive variazioni nel potenziale di membrana.
  7. Se è difficile rilevare eventi GABAergici, può essere utile utilizzare unn composizione soluzione interna cedendo in un'alta Cl - forza motrice. Per raggiungere questo, ridurre il Cl - concentrazione nella soluzione di pipetta (vedi sezione protocollo 2.6.). Questo si tradurrà in maggiori eventi GABAergici a potenziale di riposo di membrana dovuto ad una forza di guida superiore.
  8. In alternativa, iniettare passi attuali lunghi con conseguente potenziale di membrana probabilità da -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Con questo protocollo il Cl - forza motrice viene aumentata a potenziali iperpolarizzati causando una risposta GABA depolarizzante.
  9. È anche possibile utilizzare il protocollo di iniezione di corrente passo per determinare il potenziale di inversione degli eventi evocati, che contribuisce a determinare la natura GABAergica degli eventi. Perdita di GABA è più difficile da rilevare rispetto fuoriuscita di glutammato. In questo caso, un monitoraggio costante della resistenza di ingresso può aiutare, quando la pipetta riempita GABA si avvicina. Se la resistenza di ingresso diminuisce, il mantenere attuale può be aumentato o una pipetta differente deve essere usato.
  10. Come esperimenti di controllo per ionoforesi glutammato, suggeriamo un esperimento di Ca 2 + di imaging, utilizzando 200 micron OGB-1 e non EGTA nella soluzione di pipetta di visualizzare l'influsso di calcio locale che potrebbe essere causato da emissioni di glutammato.
  11. In generale, per ottenere una risposta stabile è molto importante avere una pipetta meccanicamente stabile per evitare deriva nel tempo. Drift può essere causato da variazioni di temperatura, pertanto si consiglia di accendere l'apparecchio, almeno mezz'ora prima che le misure per evitare la deriva termica. Assicurarsi di utilizzare buone guarnizioni della cartuccia nel supporto pipetta e la punta è davvero risolto. Il titolare della stessa può essere ulteriormente fissato con nastro di teflon, inoltre, assicurarsi che non vi sia tensione sui cavi dal headstage o manipolatore, che è anche una potenziale fonte di deriva.

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Representative Results

Un approccio semplice per determinare la diffusione spaziale di ionoforesi è retrarre l'pipetta Iontoforetico a gradini dalla dendrite, mantenendo costante la glutammato espulso. Abbiamo trovato che l'estensione spaziale di una stimolazione micro-Iontoforetico aveva un diametro di circa 12 micron (Figura 1 mostra raggio). Quanto in profondità nel tessuto della ionoforesi può essere utilizzato dipende dalla rigidità della pipetta. Tuttavia, le pipette iontoforesi necessari per esperimenti in fettine (figura 2), che vengono utilizzati qui, non sono limitanti la profondità di penetrazione. Piuttosto il sistema ottico e la risoluzione decrescente nella profondità della fetta cervello è il fattore limitante. Per una registrazione di buona qualità è fondamentale che nessun trasmettitore perde fuori della pipetta. Nel caso di glutammato, una dispersione può essere identificata se vi è un'improvvisa depolarizzazione quando il dendrite viene raggiunto con la punta della pipetta o se la linea di base diventa improvvisamenteinstabile (Figura 5). Dopo aver stabilito una registrazione stabile, è possibile evocare EPSPs di ampiezze definite, picchi dendritiche o potenziali d'azione con questa tecnica in qualsiasi luogo in tutto l'albero dendritico (Figura 6). Applicando glutammato con veloce micro-ionoforesi, le proprietà di EPSPs, la loro propagazione e la sommatoria, simultaneamente in diverse località anche lontane, possono essere studiati (Figura 7). Eventi GABAergici possono essere evocate sole o in aggiunta a glutammato con una seconda pipetta riempiendo la pipetta Iontoforetico con una soluzione altamente concentrata GABA (vedi: sezione Protocol 2) ed una corrente di espulsione positivo. Vi è un semplice protocollo per confermare la natura GABAergici degli eventi e per rendere più facile eventi GABAergici di rilevare, se non si utilizza una soluzione interna elevata forza di azionamento: Iniettare correnti negative (circa 1 sec, l'ampiezza dipende dalla resistenza di ingresso del cella) con conseguente hyperpolarising vopassi ensione, a partire da circa -100 mV e quindi aumentare in 5 passi mV (Figura 8). A potenziali molto negativi gli eventi GABAergici sono più facili da individuare, a causa della forza di guida superiore. E se i segnali invertono attorno al Cl calcolato - potenziale inversione per le soluzioni, è molto probabile che essi siano GABAergico in natura (Figura 8). Con un ulteriore GABA pipetta micro-iontoforetica, è possibile indagare, per esempio, l'effetto di inibizione GABAergica su eventi glutamatergici, come sodio / calcio picchi dendritiche, variando la relativa tempistica di dendritico spike e IPSP (figura 9), la posizione relativa dei due eventi, o le loro ampiezze. (Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida della cura degli animali e del Comitato Utilizzare l'Università di Bonn, il Centro tedesco per le Malattie Neurodegenerative e lo stato Nord Reno-Westfalia.)


Figura 1. Estensione spaziale del glutammato iontophoretically espulso determinata dalla pipetta retrazione. A) l'intensità massima di proiezione di un'immagine a due fotoni di un dendrite CA1 piramidale cella riempita con 100 mM Alexa 594 e la pipetta Iontoforetico nella posizione iniziale (scala bar 8 micron). Riquadri mostrano retrazione della pipetta iontoforetica e la corrispondente EPSP iontoforetica registrata al soma. Freccia indica la posizione della punta della pipetta iontoforetico. B) Distanza dipendenza di EPSP ampiezze rispetto alla posizione iniziale della punta della pipetta Iontoforetico (≤ 1 um distanti dendrite, n = 6 filiali). Con questo potremmo stimare il raggio del glutammato diffuso ritraendo sistematicamente la pipetta. Spettacoli inserto esempio tracce rappresentative. Barre di errore rappresentanomedia ± SEM. (Adattato da Müller et al. 2012 9, ristampato con il permesso di Elsevier).

Figura 2
Figura 2. Come una pipetta iontoforetico dovrebbe essere simile. A) Infrarossi immagine CCD di una pipetta iontoforetico paragonato a un piccolo 5,5 MW cerotto pipetta usando un obiettivo 60X. B) pipetta Iontoforetico con scala usando un obiettivo 60X. Calibrazione: più piccole = 10 micron.

Figura 3
Figura 3. Compensazione di capacità della pipetta iontoforetica utilizzando la configurazione in prova-pulse (10 nA, 10 msec, NPI elettronica, Tamm,Germania). È importante compensare la capacità di monitorare correttamente destra resistenza pipetta e per assicurare l'applicazione neurotrasmettitore rapido e preciso.

Figura 4
Figura 4. Principi di micro-ionoforesi. A) Schema di un neurone piramidale CA1 in tutta la configurazione di patch-clamp cellulare e una pipetta iontoforetico pieno di glutammato. Glutammato è carico negativamente, quindi una corrente positiva applicata alla pipetta manterrà fuoriuscita della pipetta: Il conservano corrente è positiva (pannello di sinistra). Per espellere glutammato dalla pipetta, applicare una corrente negativa (pannello di destra). In questo modo il glutammato è costretto fuori dalla pipetta e può evocare gli eventi eccitatori nella cellula post-sinaptica. B) Schema di CA1 neurone piramidale in tutta la configurazione di patch-clamp cellulare e una pipetta iontoforetico pieno di GABA. GABA è caricato positivamente ad un basso pH. Pertanto, una corrente negativa manterrà fuoriuscita della pipetta (pannello di sinistra). Per espellere GABA applicare una corrente positiva (pannello destro). In questo modo GABA esce dalla pipetta e può evocare eventi inibitorie nella cellula postsinaptica.

Figura 5
Figura 5. Buone e cattive pipette iontoforesi. A) Esempio rappresentativo di una EPSP glutamatergico iontoforetico generato su un ramo dendritico di un neurone piramidale CA1. B) Esempio rappresentativo di una iontoforetico dendritiche picco generato un ramo dendritiche nella zona CA1 dell'ippocampo con perdita continua glutammato mite dalla punta della pipetta.

Figura 6
Figura 6. Risultati rappresentativi per singolo glutammato micro-ionoforesi. A) Schema di una patch CA1 piramidale neuroni e una pipetta iontoforetico pieni di glutammato. B) EPSP evocato in un neurone piramidale CA1 con ionoforesi glutammato. C) Dendritic Na + / Ca 2 + picco evocata su un dendrite prossimale di un CA1 piramidale neurone, tracce inferiore indica la pendenza della traccia tensione, picco indica la pendenza picco del picco dendritica. D) Aumentando la corrente applicata al iontoforetica l'ampiezza del EPSP aumenterà fino ad attraversare il potenziale della soglia azione.

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Figura 7. I risultati rappresentativi per il doppio glutammato micro-ionoforesi in posizioni diverse sul albero dendritico. A) Schema di un patch CA1 piramidale neurone e due pipette iontoforesi riempito con glutammato, che sono posizionati su una prossimale, e un dendrite distale, rispettivamente. B) dell'EPSP Iontoforetico evocata su un dendrite prossimale di un neurone piramidale CA1 (1). C) dell'EPSP Iontoforetico evocata ad un dendrite distale (2).

Figura 8
Figura 8. Risultati rappresentativi per GABA micro-ionoforesi. A) Schema di una patch CA1 piramidale neuroni e una pipetta iontoforetico pieno di GABA.B) IPSP Iontoforetico evocata su un dendrite prossimale di un neurone piramidale CA1. C) Lungo iniezione di corrente cambiando sistematicamente ampiezze di un neurone piramidale CA1 tramite la pipetta di patch, per determinare il potenziale di inversione dell'evento evocato (iniezioni correnti da -400 pA a 0 Pa). Artefatto indica time-point di ionoforesi GABA. L'evento evocato indica una potenziale inversione di circa -70 mV (freccia).

Figura 9
Figura 9. Risultati rappresentativi di glutammato simultanea e ionoforesi GABA per investigare l'integrazione di inibizione e eccitazione. A) Schema di un neurone piramidale rattoppato e una pipetta piena di glutammato (verde) e con il GABA (arancione). B) Iontophoretically evocatasole picchi dendritiche, con movimenti successivi, tracce inferiori mostrano dV / dt, picchi indicano picchi dendritiche. C) Iontophoretically evocati IPSP solo. D) Sia eventi, glutammatergiche e GABAergici insieme.

Località specificità Trasmettitore specificità Effetti di tossicità / side Stimolazione presinaptica Esperimento a lungo termine Costi / complessità
Micro-ionoforesi + + + + + + + - + + + +
2-fotone uncaging + + + + + + + - + +
Stimolazione sinaptica - - + + + + + + + + + + ++

Tabella 1. . Confronto delle diverse tecniche Vantaggi e svantaggi delle tecniche per stimolare i neuroni in base a diversi criteri (- = male, + = non ottimale, + + = buono, + + + = migliore).

Pipette di patch Pipette Iontoforesi
Pre-tira P (A) tirare singolo Ultimo Pull P (B) Pre-tira P (A) Pull singolo Ultimo Pull P (B)
Calore H 700 480 510 600
Forza Pre Pull F (TH) 018 035 018 008
Distanza di soglia s (TH) 017 012 025 015
Ritardo Heatstop t (H) 050 030 050 030
Distanza Heatstop s (H) 030 000 030 000
Ritardo F (F1) 000 136 000 050
Forza di trazione 1 F1 000 065 200 400
Distanza Pull 2 ​​s (F2) 000 005 000 001
Forza di trazione 2 F2 000 080 000 095
Regolare (AD) 121 000 121 000

Tabella 2. Esemplarmente protocollo estrattore. Per un estrattore orizzontale (DMZ-Estrattore universale, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Germania), con filamenti GB150F-8P (Prodotti Scienza, HOFHEIM, Germania), sia per il cerotto e pipette iontoforesi.

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Discussion

Qui spieghiamo come applicare velocemente micro-ionoforesi di neurotrasmettitori per indagare l'integrazione sinaptica su dendriti. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per indagare trasmissione sinaptica glutamatergica e GABAergica in differenti regioni cerebrali in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-ionoforesi è stato utilizzato per più di 60 anni, ma nei primi anni è stato in gran parte utilizzato per applicare sia a livello locale neurotrasmettitori e farmaci su tempi lenti o intermedio 23 o per microiniezione di sostanze in cellule 24.

Micro-ionoforesi è diventata uno strumento particolarmente interessante per studiare l'integrazione dendritica in quanto l'introduzione di amplificatori, che sono dotati di una compensazione rapida capacità di elettrodi ad alta resistenza 10,11. Con questo miglioramento è stato possibile applicare brevi correnti di iontoforesi rettangolari con conseguente risposte post-sinaptici, che Resembled più realisticamente l'andamento nel tempo degli eventi sinaptici 10,25.

Quali sono i requisiti tecnici e le difficoltà da affrontare, quando si stabilisce micro-ionoforesi? Un amplificatore iontoforetica è necessaria che consente la compensazione della elevata capacità delle belle pipette iontoforesi. La corretta regolazione della compensazione della capacità è molto importante se è richiesto il funzionamento ad alta velocità in combinazione con microelettrodi ad alta resistenza. Capacità parassite non compensati sono addebitate dalla corrente iontoforetica che viene fornita dallo strumento, e quindi rallenta l'applicazione. Compensando la capacità corretta è fondamentale e spiegato in dettaglio nel video. Inoltre, è fondamentale che il sistema ottico dà una buona immagine fluorescente del dendrite e la pipetta Iontoforetico senza indurre foto-danneggiamento del tessuto. In modo ottimale, utilizzare un sistema a due fotoni e ridurre la potenza del laser e tempi di sosta per quanto compatibile con launa qualità di immagine decente. Se viene utilizzata una sorgente di luce più convenzionale, assicurarsi di ridurre il tempo di esposizione, per quanto possibile, per esempio, utilizzando otturatori meccanici o elettrico di scatto. Probabilmente il punto più critico è il disegno pipetta, che consentirà per un'applicazione definita e specifica del neurotrasmettitore utilizzato. Questo passaggio richiede un certo sforzo e tempo per trovare le impostazioni ottimali. Qui, presentiamo protocolli per ionoforesi glutammato e GABA, se sono utilizzati altri neurotrasmettitori, bloccanti o modulatori, è necessario che la sostanza è altamente concentrata e ancora più importante che sia carica. Per esempio, dal GABA ha una carica netta di zero a un pH pari a 0, il pH deve essere regolato (vedere protocollo 2), risultante in una carica netta positiva.

Quando viene stabilita micro-ionoforesi, fornirà un set di strumenti esteso per studiare l'integrazione sinaptica nei neuroni. Esso consente stimolando sinapsi di interesse selettivamente conun particolare neurotrasmettitore. Utilizzando un neurotrasmettitore selezionato posizioni definite, correnti post-sinaptiche e le potenzialità e la loro propagazione può essere indagato. Inoltre, è possibile utilizzare più elettrodi di iontoforesi simultaneamente per investigare l'integrazione di più ingressi glutamatergici o modificare sistematicamente la temporizzazione relativa o la forza di eventi.

Alcuni punti critici generali devono essere considerati quando si usano micro-ionoforesi. Il profilo di concentrazione di neurotrasmettitore dopo micro-ionoforesi è diverso dal rilascio endogeno. Murnick e altri 10 hanno riferito che la velocità di uscita dalla punta ionoforesi (circa 1 msec) è probabile che sia significativamente più lento di rilascio sinaptico da vescicole, che si verifica in frazioni di millisecondo (0,2 msec) 26. Inoltre, la diffusione da e per la fessura sinaptica è probabile rallentamento aumento concentrazione e il decadimento dei neurotrasmettitori iontophoretically applicate.Inoltre, il volume di neurotrasmettitore espulso rischia di essere superiore volumi fisiologicamente liberati, tuttavia, con elettrodi ad alta resistenza, singolo glutamatergici e GABAergici postsynapses poteva essere attivato tramite micro-ionoforesi 10-12. Una selettività spaziale nel range di pochi micrometri è anche stato recentemente raggiunto da uncaging due fotoni di neurotrasmettitori 3,4,27.

Mentre notevolmente più dispendiosa, uncaging due fotoni ha diversi vantaggi rispetto micro-ionoforesi. In particolare può essere utilizzato per rilasciare neurotrasmettitore contemporaneamente in più siti sinaptici e non richiede il posizionamento preciso di un elettrodo di punta fine. Tuttavia, ha anche alcuni svantaggi importanti da considerare quando si seleziona un metodo per un particolare esperimento. Molti composti in gabbia hanno effetti collaterali indesiderati, come il blocco dei recettori dei neurotrasmettitori 28. Per esempio, molti glutammato e GABA gabbiesono stati segnalati per interferire con inibizione GABAergica. Inoltre, la potenza del laser relativamente elevata necessaria per uncaging due fotoni può provocare foto-danneggiamento del neurone postsinaptico, in particolare quando la stimolazione è applicato ripetutamente per diversi minuti. Inoltre, mentre la micro-ionoforesi è limitato nel numero di siti stimolati, questi siti possono essere scelti liberamente su tutto l'albero dendritico di un neurone, per esempio su dendriti distali e basale, per simulare stratificato ingresso sinaptica da diverse regioni del cervello. Due fotoni uncaging, come è attualmente utilizzato dalla maggior parte dei gruppi, sarà limitato ai siti sinaptici in un piano focale specifico e nel campo visivo, che dipende dall'obiettivo utilizzato (tipicamente 40X o 60X immersione in acqua). Si deve considerare che entrambe le tecniche portano sempre alla attivazione dei recettori extrasynaptic, che possono rendere l'interpretazione dei risultati più difficili.

Un altro svantaggio di micro-ionoforesi è che oolo il postsynapse può essere attivata. Se la funzione presinaptica e il ruolo delle vescicole rilasciato neurotrasmettitore devono essere impostati nel fuoco sperimentale, stimolazione sinaptica elettrica locale può essere un metodo di scelta. Tuttavia, gli svantaggi di stimolazione elettrica sinaptica rispetto ai micro-ionoforesi sono la posizione sconosciuta delle sinapsi attivate e la co-attivazione di assoni da diverse popolazioni neuronali, potenzialmente appartenenti ad altri sistemi neurotrasmettitoriali (Tabella 1).

In sintesi il vantaggio più importante di micro-ionoforesi è, a nostro avviso, che è possibile utilizzare diversi neurotrasmettitori diversi e studiare la loro interazione in compartimenti neuronali come dendriti 9.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Ringraziamo Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson per aver letto con attenzione il manoscritto. Gli autori hanno ricevuto finanziamenti che è stato fornito dal Ministero della Ricerca MIWF dello stato Nord Reno-Westfalia (SR), il BMBF-Projekträger DLR collaborazione USA-tedesco in neuroscienze computazionali (CRCNS, SR), Centri di Eccellenza nelle malattie neurodegenerative (COEN; SR), e l'Università di Bonn programma di finanziamento intramurale (BONFOR; SR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany  
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA  
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent  
60X Objective, NA 0.9 Olympus  
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany  
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany  
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA  
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany  
  Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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