एक्यूट ल्यूकेमिया के इलाज के लिए tyrosine kinase inhibitors के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन

Medicine

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Summary

रिसेप्टर tyrosine kinases ectopically कई तरह के कैंसर में व्यक्त कर रहे हैं और तीव्र लेकिमिया में चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है. इस पांडुलिपि तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए tyrosine kinase inhibitors के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन है.

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Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

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Abstract

रिसेप्टर tyrosine kinases ल्यूकेमिया और ठोस ट्यूमर दोनों सहित कई तरह के कैंसर के विकास और प्रगति में शामिल किया गया है, और आकर्षक druggable चिकित्सकीय लक्ष्य कर रहे हैं. यहाँ हम तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में tyrosine kinase inhibitors (TKIs) के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए एक कुशल चार कदम रणनीति का वर्णन. प्रारंभ में, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सुसंस्कृत ल्यूकेमिया कोशिकाओं में लक्ष्य निषेध पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्रियात्मक गतिविधि तो methylcellulose या नरम अगर संस्कृतियों में clonogenic assays का उपयोग मूल्यांकन किया है. सेल संस्कृति assays में गतिविधि प्रदर्शित करता है कि प्रायोगिक यौगिकों मानव ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों के साथ orthotopically प्रत्यारोपित इशारा-SCID गामा (एनएसजी) चूहों का उपयोग vivo में मूल्यांकन कर रहे हैं. प्रारंभिक vivo में pharmacodynamic पढ़ाई अस्थि मज्जा से अलग leukemic विस्फोटों में लक्ष्य निषेध का मूल्यांकन. यह दृष्टिकोण प्रभावी रोकना लक्ष्य के लिए आवश्यक प्रशासन की खुराक और समय निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैआयन. बाद के अध्ययन जिससे एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर ल्यूकेमिया बोझ और चिकित्सकीय प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के गैर इनवेसिव bioluminescent निगरानी के लिए अनुमति देता है, luciferase ल्यूकेमिया कोशिकाओं को व्यक्त उपयोग vivo में TKIs की प्रभावकारिता का मूल्यांकन. इस रणनीति में इन विट्रो और इन विवो में TKIs के मूल्यांकन के लिए प्रभावी कर दिया गया है और चिकित्सीय क्षमता के साथ molecularly लक्षित एजेंटों की पहचान के लिए या कई यौगिकों का प्रत्यक्ष तुलना और प्राथमिकता के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

तीव्र लिम्फोब्लासटिक लेकिमिया (सभी) बच्चों 1,2 में सबसे आम द्रोह है. बाल चिकित्सा बी वंश सब (बी सभी) के लिए समग्र जीवित रहने की दर लगभग 85% है, लेकिन टी वंश सब (टी सभी) सहित विशिष्ट जैविक उपप्रकार, यहां तक ​​कि वर्तमान चिकित्सकीय प्रोटोकॉल के साथ अभी भी गरीब पूर्वानुमान है. Relapsed सब के आगे के इलाज के लिए एक चुनौती 3 बनी हुई है. तीव्र लेकिमिया के साथ वयस्क रोगियों के बहुमत अप सामने रसायन चिकित्सा के साथ एक छूट प्राप्त है, कई रोगियों को अब भी डूबने 4 ग्रस्त हैं. तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में वर्तमान chemotherapeutic regimens विषाक्तता से जुड़े लघु और लंबी अवधि के दुष्प्रभाव का कारण जाना जाता है. इसलिए, विशेष रूप से सामान्य ऊतकों पर न्यूनतम प्रभाव के साथ कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित है कि कम विषाक्त उपचारों बहुत जरूरत है. हाल के वर्षों में, जोर उपन्यास, कैंसर की कोशिकाओं के लिए विशिष्टता के साथ molecularly लक्षित एजेंटों, अक्सर चलने का रसायन शास्त्र के उपयोग के विकास पर रखा गया हैतब की तुलना में और 5 प्राथमिकता के आधार पर किया जाना चाहिए, जो कई सक्रिय यौगिकों उत्पन्न करने के लिए. इस पांडुलिपि नशीली दवाओं के विकास को सुविधाजनक बनाने के क्रम में एक ही परिसर के मूल्यांकन के लिए या कई यौगिकों का प्रत्यक्ष तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए TKIs के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन है.

यहाँ प्रस्तुत विधि चार चरण होते हैं. सबसे पहले जैव रासायनिक (1) और विरोधी ल्यूकेमिया (2) यौगिक (ओं) की गतिविधियों सेल संस्कृति में मूल्यांकन कर रहे हैं, तो लक्ष्य के निषेध के पशु मॉडल (3) में पुष्टि की, और TKI (एस) के अंत में चिकित्सीय प्रभावकारिता है orthotopic ल्यूकेमिया xenograft मॉडल में निर्धारित किया जाता है (4). इन अध्ययनों के लिए, यह सबसे आम जीवविज्ञान उपप्रकार के प्रतिनिधि हैं जो प्रासंगिक सेल लाइनों, का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. सेल लाइनों जीवविज्ञान प्रभाव मेड कर रहे हैं कि क्या जांच करने के लिए, दोनों, ब्याज के लक्ष्य को व्यक्त करने और ब्याज के लक्ष्य की कमी है, जो चयनित किया जाना चाहिएलक्ष्य का निषेध करके iated. यह विरोधी ट्यूमर गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है कि बंद लक्ष्य प्रभाव है जो छोटे अणु inhibitors के विकास के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. यह इस तरह के प्रसार या अस्तित्व के रूप में कार्यात्मक प्रभाव के लिए लक्ष्य पर निर्भर है कि एक सेल लाइन का चयन करने के लिए भी आवश्यक है. लक्ष्य को बाधित करने के लिए शाही सेना के हस्तक्षेप या अन्य विशिष्ट साधन का उपयोग कर (इस लेख के दायरे के बाहर) प्रारंभिक लक्ष्य सत्यापन अध्ययन लक्ष्य पर निर्भर सेल लाइनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह सेल संस्कृति परिणाम और अधिक सीधे vivo में प्रयोगों के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि इस तरह murine xenografts, फार्म कर सकते हैं कि सेल लाइनों का चयन करने के लिए भी वांछनीय है.

ल्यूकेमिया कोशिकाओं में TKIs द्वारा मध्यस्थता जैव रासायनिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए, रिसेप्टर phosphorylation में कमी लक्ष्य निषेध का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण या एलिसा assays एंटीबॉडी की उपलब्धता और विशिष्टता के आधार पर नियोजित किया जा सकता है.लक्ष्य के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, तो वे अधिक मात्रात्मक और कुशल हैं, एलिसा assays बेहतर कर रहे हैं. एलिसा के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं जहां मामलों में, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण आवश्यक हो सकता है. इस मामले में, lysate की एक बड़ी राशि की immunoprecipitation कम बहुतायत में हैं कि लक्ष्यों का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है. यह दृष्टिकोण पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में संकेत में तेजी से बदलाव के लिए अनुमति देने के लिए एक कम आधा जीवन हो सकता है जो phospho-प्रोटीन की माप के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. कुछ phosphorylated प्रोटीन, बेहद अस्थिर फास्फेटेजों साथ जटिल गठन का एक परिणाम के रूप में सबसे अधिक संभावना है. इन phosphorylated प्रोटीन की मजबूत और लगातार पता लगाने के लिए, यह भी पिछले पूरे सेल lysates की तैयारी करने के लिए phospho प्रोटीन को स्थिर करने के लिए, pervanadate, एक अपरिवर्तनीय प्रोटीन tyrosine फॉस्फेट अवरोध करनेवाला 6 के साथ कोशिकाओं का इलाज संभव हो सकता है.

तकजैव रासायनिक गतिविधि विरोधी ट्यूमर प्रभाव में परिणाम है कि यह निर्धारित, लक्ष्य पर निर्भर जैविक प्रक्रियाओं सेल आधारित प्रयोगों में नजर रखी जा सकती है. ल्यूकेमिया सेल लाइनों के लिए, TKIs द्वारा मध्यस्थता लेकिमिया विरोधी गतिविधि methylcellulose या नरम अगर 7 में प्रदर्शन कॉलोनी गठन assays का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता. इस एक TKI के साथ दोहराया उपचार आवश्यक है यदि हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है कि एक ठोस माध्यम के रूप में नरम अगर पसंद किया जा सकता. कई तीव्र myloid ल्यूकेमिया (एएमएल) सेल लाइनों नरम अगर में कालोनियों के रूप में करते हैं, सबसे सभी सेल लाइनों केवल एक अर्द्ध ठोस माध्यम है, जो methylcellulose में कालोनियों बनेगी. यह methylcellulose संस्कृतियों में मध्यम और / या TKIs ताज़ा करने के लिए संभव है, केवल छोटी मात्रा में इस्तेमाल किया और सीमित आवृत्ति के साथ किया जा सकता है. इसी प्रकार, यह methylcellulose में उन्हें बिना बाधा पहुँचा कालोनियों दाग अधिक मुश्किल है. प्रारंभिक अध्ययन methylcellulose और / या नरम अगर और टी में कालोनियों के रूप में करने के लिए उचित सेल लाइनों की क्षमता को परिभाषित करना चाहिएवह संस्कृति में कोशिकाओं का इष्टतम घनत्व कालोनियों गैर अतिव्यापी हैं और पर्याप्त संख्या में (35 मिमी प्लेट प्रति आम तौर पर 50-200 कालोनियों) सांख्यिकीय प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के लिए कि इस तरह के.

इन विट्रो assays मजबूत और लागत प्रभावी रहे हैं, और जबकि पूरे पशु प्रयोगों, चिकित्सकीय यौगिकों की उन्नति से कम नैतिक प्रभाव पशु मॉडल में प्रभावकारिता और सुरक्षा के सबूत की आवश्यकता है. Vivo अध्ययन के लिए, मानव तीव्र लेकिमिया सेल लाइनों orthotopically मैं tm1Wjl / SzJ (एनएसजी) चूहों और TKIs आसानी इंजेक्शन या मौखिक नलिका - पोषण द्वारा प्रशासित किया जा सकता l2rg NOD.Cg-Prkdc SCID में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. कुछ सेल लाइनों xenografts स्थापित करने के लिए आदेश में विकिरण का एक कम सेल लाइन पर निर्भर खुराक के लिए परमाणु आपूर्तिकर्ता समूह के चूहों के निवेश की आवश्यकता हो सकती है, और इस उदाहरण में चूहों एक 5-10 दिन वसूली की अवधि के बाद विकिरण के बिना मौखिक नलिका - पोषण बर्दाश्त नहीं कर सकता है. इस पांडुलिपि का उपयोग बी सब और टी सभी xenografts की पीढ़ी का वर्णनउदाहरण लेकिन xenografts के रूप में विशेष सेल लाइनों (697 और Jurkat) सेल लाइनों की एक विस्तृत विविधता का उपयोग एनएसजी चूहों में स्थापित किया जा सकता है. अन्य सेल लाइनों अधिक लागू कर रहे हैं कि घटना में, विकिरण के लिए आवश्यकता, प्रत्यारोपण, और रोग शुरुआत प्रगति के समय से कोशिकाओं के इष्टतम संख्या प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, इन मॉडलों (बीमारी के कारण आदर्श 20-30 दिनों के अध्ययन से उपचार और हटाने की दीक्षा के बीच) पूर्ण penetrance (प्रतिरोपित हर जानवर ल्यूकेमिया विकसित करता है), लगातार कैनेटीक्स (ल्यूकेमिया सभी जानवरों में इसी प्रकार की प्रगति), और एक उचित उपचार खिड़की होगा . प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या penetrance और गतिज स्थिरता में सुधार करने के लिए वृद्धि हुई है या यदि आवश्यक उपचार खिड़की में सुधार करने के लिए कम किया जा सकता है.

TKIs vivo में लक्ष्य निषेध मध्यस्थता निर्धारित करने के लिए, नमूने TKI या केवल वाहन के साथ उपचार के बाद ल्यूकेमिया xenografts के साथ चूहों से एकत्र कर रहे हैं. आदर्श रूप में, खुराक एकइन प्रयोगों के लिए प्रशासन की डी अनुसूची अक्सर वाणिज्यिक प्रयोगशालाओं द्वारा प्रदर्शन किया और इस लेख के दायरे से बाहर किया जा सकता है जो pharmacokinetic अध्ययन, द्वारा निर्देशित कर रहे हैं. Pharmacokinetic डेटा उपलब्ध हैं, TKI की एक खुराक निम्नलिखित सेल संस्कृति में प्रभावी लक्ष्य निषेध और अधिकतम सीरम एकाग्रता के लिए आवश्यक यौगिक की एकाग्रता जानवरों के अध्ययन के लिए एक प्रारंभिक खुराक को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Pharmacokinetic अध्ययन भी pharmacodynamic अध्ययन और प्रशासन के मार्ग के लिए नमूना संग्रह के बाद इलाज के समय को सूचित कर सकते हैं. लक्ष्य का निषेध किसी भी प्रभावित अंग में मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन सबसे अधिक आसानी से एकत्र की है और कार्रवाई की जाती है कि ऊतकों बेहतर कर रहे हैं. विशिष्ट अंग प्रभावित हालांकि सबसे तीव्र लेकिमिया सेल लाइनों, जिगर, अस्थि मज्जा, प्लीहा, परिधीय रक्त, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में स्थापित करने और इन अंगों में engraftment की हद मॉडल के बीच होती है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Phosph का आकलनO-प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग अस्थि मज्जा में निषेध है, लेकिन ठोस अंगों लगातार फसल के लिए आसान हो सकता है और नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान phospho प्रोटीन की गिरावट के लिए अवसर कम है, की अनुमति से पहले ठंड के लिए कम या कोई संसाधन की आवश्यकता हो सकती है. Immunohistochemistry भी ठोस ट्यूमर या ल्यूकेमिया से प्रभावित अंगों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अंत में, TKI (एस) के चिकित्सीय प्रभावकारिता orthotopic ल्यूकेमिया xenograft मॉडल में निर्धारित किया जाता है. इन अध्ययनों के लिए, इलाज दीक्षा के समय रोग अधिक या कम की स्थापना की है कि इस तरह के, अलग किया जा सकता है. प्रारंभिक उपचार के अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण के बाद तुरंत शुरू कर सकते हैं और उसके बाद महत्वपूर्ण रोग बोझ और अधिक बारीकी से एक नैदानिक ​​उपचार मॉडल लगभग करने के लिए पता चला है जब तक अनुवर्ती अध्ययन में देरी हो. आदर्श रूप में, इन पशु मॉडल भी रोग बोझ का माप गैर इनवेसिव के लिए क्षमता है. हम जुगनू लूसिफ़ेर की शुरूआत के लिए तरीकों अनुकूलित हैबीमारी की शुरुआत और अस्थि मज्जा और ठोस अंगों में रोग बोझ की प्रगति और मूल्यांकन की गैर इनवेसिव, अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए अनुमति वायरस की तरह कणों का उपयोग ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों में एएसई जीन,. इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण पॉलीक्लोनल सेल लाइनों का उपयोग के साथ जुड़े luciferase व्यक्त ल्यूकेमिया के विकास में परिवर्तनशीलता को रोकने के लिए मोनोक्लोनल luciferase टैग सेल लाइनों का इस्तेमाल होता है और एक TKI 8 के साथ इलाज के लिए असंबंधित है.

साथ में ले ली, इन चरणों का एक भी TKI के मूल्यांकन के लिए या एकाधिक TKIs की प्रत्यक्ष तुलना और रैंकिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल TKIs के विकास पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इन तरीकों में अन्य लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और परख विकास के लिए विचार वर्णित हैं. इस प्रकार, इस रणनीति तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए और अधिक मोटे तौर पर लागू molecularly लक्षित एजेंटों के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन करने के लिए हो सकता है.

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Protocol

जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों कोलोराडो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित नियामक मानकों का पालन किया. प्रदर्शन किया प्रोटोकॉल कोलोराडो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. Phospho प्रोटीन वेस्टर्न ब्लाट

  1. Lysates की तैयारी
    1. ब्याज की रिसेप्टर tyrosine kinase व्यक्त संस्कृति सेल लाइनों. हार्वेस्ट कोशिकाओं और थाली 3-5 एक्स 10 एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान में 400 μl मध्यम विकास में 6 कोशिकाओं / नमूना. 2-3 घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    2. मध्यम विकास में 5x TKI समाधान के 100 μl जोड़ें और 60 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. 50 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl, 10 मिमी EDTA, 10% (v / v) ग्लिसरॉल, 1% (v / v) ट्राइटन X-100, और protease inhibitors के साथ lysis बफर तैयार करें. संस्कृतियों से पहले फसल को pervanadate साथ इलाज किया जा नहीं होगा, फॉस्फेट अवरोधक (1 मिमी सोडियम orthova जोड़lysis बफर करने nadate और 0.1 मिमी सोडियम molybdate).
    4. तुरंत उपयोग करने से पहले pervanadate (पीवी) फॉस्फेट अवरोध करनेवाला समाधान तैयार करें. बर्फ पर एक अंधेरे ट्यूब (एक 30% शेयर समाधान के 1:100 कमजोर पड़ने) में ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में हाइड्रोजन पेरोक्साइड (सतर्कता) के एक 0.3% समाधान तैयार करें. 0.2 एम सोडियम orthovanadate 5 मिनट के लिए (OV, सावधानी) शेयर समाधान के एक विभाज्य उबाल लें. कमरे के तापमान (आर टी) में 20 मिमी OV समाधान बनाने के लिए पीबीएस में 01:10 पतला. 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड और 20 मिमी OV 1:1 मिश्रण और 20 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते हैं.
    5. पूरा मध्यम (60 μl पी.वी. + 940 μl मध्यम) में पी.वी. पतला. अच्छी तरह पतला पी.वी. / के 100 μl जोड़ें. 3 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर बर्फ पर थाली जगह.
    6. 5 मिनट के लिए 2500 rpm पर ठंड microfuge ट्यूबों में कोशिकाओं फसल. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और lysis बफर के 120 μl में resuspend कोशिकाओं. 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. 3 मिनट के लिए 6000 rpm पर एक ठंडा microfuge में lysate स्पष्ट करें. Supe के स्थानांतरणएक ताजा ठंड ट्यूब rnatant. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. Immunoprecipitation
    1. 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर microfuge में प्रोटीन जी sepharose मोती स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें और मोती 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ 2x धो लो. एक 50% घोल बनाने के लिए पीबीएस के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. प्रत्येक नमूने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी और 20 μl 50% प्रोटीन जी मोती जोड़ें. ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर - 2 घंटे के लिए सेते हैं.
    2. 9,000 rpm पर एक ठंडा microfuge में मोती नीचे नाड़ी. सतह पर तैरनेवाला निकालें और मोती 150 μl ठंड lysis बफर के साथ 2x धो लो. 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर ठंड microfuge में स्पिन. 2-mercaptoethanol (सतर्कता) के साथ 20 μl 2X एसडीएस नमूना बफर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें. -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत या स्टोर का उपयोग
    3. एक एसडीएस पृष्ठ Tris-ग्लाइसिन जेल पर 5 मिनट और चलाने के लिए उबाल लें नमूनों. एक nitrocellulose झिल्ली प्रोटीन स्थानांतरण और पश्चिमी धब्बा द्वारा phospho प्रोटीन का पता लगा.
    4. पानी के साथ दाग कुल्ला और फिर, 2% एसडीएस में 62.5 मिमी Tris (6.8 पीएच), 0 सेते हैं.50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 एम β-mercaptoethanol (सतर्कता) पानी के साथ 2x कुल्ला और फिर समाधान अलग करना दूर करने के लिए टीबीएस आयकर की 5-6 परिवर्तन में 60-90 मिनट के लिए धोएं.
    5. वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा कुल प्रोटीन का पता लगा.

2. Methylcellulose परख

  1. एक बाँझ बड़े बोर कुंद अंत सुई का उपयोग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में methylcellulose मानव आधार मध्यम से विभाज्य 4 मिलीलीटर. (नोट:. Methylcellulose का उपयोग करने से पहले आर टी ओ / एन में सी. पिघलना ° aliquoted और -20 पर संग्रहीत किया जा सकता है)
  2. 10 सेकंड के लिए methylcellulose और भंवर मिश्रण के 4 एमएल के लिए मध्यम विकास में 10x TKI या वाहन के 500 μl जोड़ें.
  3. फसल और गिनती कोशिकाओं. अंतिम सेल एकाग्रता से 10x अधिक है जो एक एकाग्रता में वृद्धि मध्यम में एक सेल निलंबन की तैयारी. Methylcellulose मिश्रण करने के लिए 500 μl सेल निलंबन जोड़ें. 10 सेकंड के लिए भंवर और बुलबुले को दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए बैठते हैं.
  4. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज और बाँझ larg का उपयोग methylcellulose मिश्रण के 4 एमएल ड्राई कुंद अंत सुई बोर. बुलबुले ड्राइंग बचें. तीन 35 मिमी टिशू कल्चर प्लेटों के केंद्र में methylcellulose मिश्रण का 1 मिलीलीटर बांटना. नीचे पूरी तरह से methylcellulose के साथ कवर किया जाता है जब तक बर्तन भंवर.
  5. प्रत्येक methylcellulose प्लेट के लिए, एक आर्द्र वातावरण सुनिश्चित करने के लिए बाँझ पानी से भर दो अतिरिक्त 35 मिमी टिशू कल्चर प्लेटों के साथ एक 10 सेमी बाँझ टिशू कल्चर प्लेट तैयार करते हैं. पानी में रखें संस्कृतियों 10-14 दिनों के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर की जैकेट.
  6. 1-2 सप्ताह के बाद कालोनियों गणना. कालोनियों में 20 से अधिक कोशिकाओं और अतिव्यापी नहीं होना चाहिए. कालोनियों एक ग्रिड के साथ एक खुर्दबीन मंच से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर या एक स्वचालित कॉलोनी काउंटर का उपयोग गिना जा सकता है. TKI के साथ उपचार के जवाब में कॉलोनी आकार या आकृति विज्ञान में परिवर्तन भी मूल्यांकन किया जाना चाहिए. (4,5-डाइमिथाइल-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ब्रोमाइड प - (3 के 60-100 μl जोड़कर कॉलोनी काउंटर, दाग कालोनियों द्वारा पता लगाने में सुधारution (MTT, -20 डिग्री सेल्सियस पर एच 2 हे, दुकान में 5 मिलीग्राम / एमएल, प्रकाश, सावधानी से रक्षा) ड्रॉप के लिहाज से प्रत्येक थाली की सतह पर और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए incubating.

3. नरम अगर परख

  1. नीचे की परत, ऊपर परत के लिए 0.7% महान अगर और 2x मध्यम विकास के लिए 1% महान अगर तैयार करें. एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2x मध्यम विकास संतुलित करना. हीट 1% और एक माइक्रोवेव (लगभग 1 min/100 मिलीलीटर) में 0.7% महान अगर और एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संतुलित करना. 1% अगर और 2x मध्यम और 50 मिलीलीटर conicals में अलग से 0.7% अगर और 2x माध्यम के बराबर भागों मिलाएं. प्रत्येक स्तर के लिए नरम अगर मिश्रण / छह अच्छी तरह से थाली की योजना 10 मिलीलीटर.
  2. लेबल 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें. 1.5 मिलीलीटर 1% नरम अगर मिश्रण के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक भरें. चढ़ाना दौरान बुलबुले से बचें. 30 मिनट के लिए बाँझ हुड में lids के साथ बंद सूखी प्लेटें.
  3. कक्षों की गणना. अंतिम सेल concentrati से 500x अधिक है जो एक एकाग्रता में वृद्धि मध्यम में एक सेल निलंबन की तैयारीपर. 0.7% अगर मिश्रण करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 1% अगर परत के ऊपर अगर सेल मिश्रण की 1.5 एमएल बांटना. ऊपर परत 30 मिनट के लिए जमना.
  4. TKI या वाहन पर नियंत्रण युक्त 1x मध्यम विकास तैयार करें. शीर्ष अगर परत के शीर्ष पर TKI के वांछित एकाग्रता के साथ मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. 5% में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 10 दिनों के लिए संस्कृतियों सेते सीओ 2. हर 3 दिन निकालें और overlaying मध्यम जगह.
  6. कालोनियों नग्न आंखों, महाप्राण overlaying मध्यम करने के लिए दिखाई दे रहे हैं और (4 डिग्री सेल्सियस पर एच 2 हे, दुकान में 1 मिलीग्राम / एमएल एनबीटी प्रकाश, सावधानी से रक्षा) 200 μl नाइट्रो tetrazolium नीले समाधान जोड़ते हैं. 24-48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर पर लौटें. पूर्व गिनती करने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक ले जाएँ. सना हुआ प्लेटें एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. एक माइक्रोस्कोप या एक स्वचालित कॉलोनी काउंटर का उपयोग कालोनियों गणना.

4. विवो में Phospho प्रोटीन निषेध का मूल्यांकन

  1. सी लीजिएएल्स 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में centrifugation द्वारा लॉग चरण में बढ़ रहा है. बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें और एक उपयुक्त एकाग्रता में पीबीएस में resuspend (आमतौर पर 1-5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल). एक 28 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग नस पूंछ में नसों में इंजेक्शन द्वारा 6-12 सप्ताह पुराने एनएसजी चूहों में 100 μl की एक मात्रा में प्रत्यारोपण कोशिकाओं. नसों को चौड़ा करने के लिए गर्म पानी की एक बीकर में पूंछ गर्मी, और इंजेक्शन के लिए पहले एक chlorhexidine झाड़ू के साथ पूंछ साफ, एक restrainer में पशु रखें. इंजेक्शन के बाद, खून बह रहा बंद हो जाता है जब तक बाँझ धुंध का उपयोग इंजेक्शन साइट के लिए दबाव डालते हैं. प्रत्यारोपण कम से कम 3 जानवरों / समूह. 1 मिलीग्राम / एमएल gentamycin सल्फेट युक्त पानी पर चूहों बनाए रखें.
  2. चौदह दिन बाद प्रत्यारोपण, लक्ष्य निषेध के विश्लेषण के लिए TKI या केवल वाहन और फसल नमूनों के साथ पशुओं का इलाज. जानवरों के वजन और एक उचित खुराक TKI या वाहन की (शरीर के वजन के मिलीग्राम / किग्रा) के साथ व्यवहार करते हैं. 5 एमएल / कश्मीर के एक मात्रा में उपचार प्रशासनमौखिक नलिका - पोषण द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) या 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन से जी शरीर के वजन. आईपी ​​इंजेक्शन के लिए, मैन्युअल रूप से माउस को नियंत्रित करना और एक 29 जी सुई का उपयोग करते हुए पेट के निचले सही चक्र में इंजेक्षन. मौखिक नलिका - पोषण के लिए, मैन्युअल रूप से माउस को नियंत्रित करना और ईमानदार पशु पकड़ो. जीभ पर और मुँह के पीछे में मुंह में नलिका - पोषण ट्यूब रखें. घुटकी के माध्यम से और पेट में ट्यूब पारित करने के लिए थोड़ा दबाव लागू करें. इलाज के प्रशासन के लिए सिरिंज सवार दबाना. सवार आसानी से दबाना नहीं है, तो नलिका - पोषण सुई निकाल दिया और repositioned किया जाना चाहिए. तुरंत उपयोग करने से पहले TKI योगों तैयार करें.
  3. Pervanadate उपचार वांछित है, (कदम 1.1.4) ऊपर वर्णित के रूप में फसल से पहले पी.वी. समाधान 20 मिनट में तैयार करने और 1 माइक्रोन 2 MgCl और 100 यू / मिलीलीटर DNase (120 μl पी.वी. + 880 μl मध्यम) के साथ मध्यम में पतला. नोट: पी.वी. कमजोर पड़ने के बाद कम से कम 1 घंटे के लिए स्थिर है.
  4. एपी में सीओ 2 निद्रावहन द्वारा पशुओं का बलिदानpropriate समय (ओं) को उपचार के बाद. हड्डियों को पूरी तरह से उजागर कर रहे हैं कि ताकि पूरे पैर से फर, त्वचा और मांसपेशियों को हटाने के द्वारा femurs काटना. सिर्फ कूल्हे नीचे और फिर संयुक्त घुटने से ऊपर कैंची विदारक साथ कतरन द्वारा femurs निकालें. एक सिरिंज और एक 27 जी सुई का उपयोग 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस या पतला पी.वी. समाधान के साथ एक पेट्री डिश और फ्लश अस्थि मज्जा पर स्थानांतरण. पी.वी. के साथ इलाज करते हैं, तो 10 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी पर सेते हैं.
  5. Lysates तैयार है और (कदम 1.1.6-1.2.5) ऊपर संकेत के रूप में phospho प्रोटीन और कुल प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण.
  6. Densitometry का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए रिश्तेदार phospho प्रोटीन और कुल प्रोटीन के स्तर quantitate. वाहन का इलाज पशुओं के लिए औसत phospho-protein/total-protein मूल्य को phospho-protein/total-protein रिश्तेदार की गणना.

5. सभी xenograft मॉडल में TKIs की लेकिमिया विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन

  1. यदि आवश्यक हो, एक रुपये 2000 irradiator एक दिन PRIO में विकिरण की 200 cGy के लिए चूहों का पर्दाफाशप्रत्यारोपण के लिए आर. (4.1 कदम) ऊपर वर्णित के रूप में ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों के साथ प्रत्यारोपण चूहों. समूह प्रति प्रत्यारोपण में कम से कम 6 चूहों. कान पंच द्वारा चूहों को पहचानें. वैकल्पिक रूप से, एक काला मार्कर अपनी दुम पर हैश निशान के साथ चूहों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अध्ययन के दौरान पिंजरे दोस्त आक्रामकता के लिए क्षमता को कम करने के लिए पिंजरों को संवर्धन जोड़ें.
  2. (4.2 कदम) ऊपर वर्णित के रूप में केवल एक TKI या वाहन के साथ चूहों समझो. शारीरिक परीक्षा और वजन दृढ़ संकल्प के माध्यम से दैनिक चूहों के स्वास्थ्य की स्थिति की निगरानी. ल्यूकेमिया की उम्मीद लक्षण (गतिविधि स्तर, वजन घटाने, पिछले अंग पक्षाघात, और आंख में संक्रमण कम हो). वजन में कमी और अधिक से अधिक 10% -15% आमतौर पर दो दिनों के भीतर माउस की मौत के साथ जुड़ा हुआ है और आम तौर पर मानक IACUC आवश्यकताओं के अनुसार मौत के लिए एक किराए समापन बिंदु है.
  3. साप्ताहिक 2x अप करने के लिए एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली के माध्यम से engraftment और ल्यूकेमिया के विकास की निगरानी. Steri में एक 200x डी luciferin शेयर समाधान (30 मिलीग्राम / एमएल) की तैयारीLe पानी. डी luciferin पूरी तरह भंग है जब तक उलटा द्वारा धीरे मिलाएं. -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत प्रयोग करें, या विभाज्य और फ्रीज पिछले आरटी पर डी luciferin की aliquots पिघलना और 15 मिलीग्राम / एमएल और फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ के अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में 01:02 पतला, एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग इमेजिंग के लिए.
  4. ऑक्सीजन में 1.5% साँस isoflurane के साथ इमेजिंग से पहले चूहों anesthetize. मांसपेशी छूट, आंदोलन की हानि, और पैर के अंगूठे चुटकी उत्तेजना के जवाब के नुकसान की विशेषता पर्याप्त संज्ञाहरण, मॉनिटर.
  5. तुरंत इमेजिंग से पहले, आईपी इंजेक्शन (शरीर के वजन के 15 मिलीग्राम / एमएल luciferin / जी की 10 μl) से 150 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन डी luciferin प्रशासन.
  6. अनुक्रमिक 30, 60 और 90 सेकंड जोखिम और एक 120 सेकंड जोखिम के साथ एक अंतिम छवि के साथ छवियों के 2 श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का प्रयोग करें. इमेजिंग के बाद, पिंजरों में चूहों लौटने और संज्ञाहरण से वसूली के लिए निगरानी. पर निर्भर करता हैbioluminescence की तीव्रता, जोखिम बार अलग किया जा सकता है. इष्टतम जोखिम बार किसी दिए गए मॉडल के लिए पूर्व निर्धारित और व्यक्तिगत समय अंक के लिए संकेत तीव्रता पूरे अध्ययन भर में तुलना कर रहे हैं कि लगातार इस तरह रखा जाना चाहिए.
  7. लिविंग छवि 3.2 अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक माउस के लिए bioluminescence तीव्रता का निर्धारण. दूसरा प्रत्येक माउस से अधिक समान आकार का ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों ड्राइंग द्वारा फोटॉनों / में मापा कुल प्रवाह मूल्यों का निर्धारण करते हैं.
  8. अधिक से अधिक से अधिक 15% वजन घटाने की स्थिति में, पक्षाघात का प्रदर्शन, मरणासन्न, या अध्ययन के अंत में अगर सीओ 2 जोखिम और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान. चूहों और रिकॉर्ड टिप्पणियों (; अस्थि मज्जा पीला तिल्ली, जिगर, या लिम्फ नोड्स के जैसे इज़ाफ़ा) काटना. एक 27 जी सुई का उपयोग femurs और ठंड पीबीएस के साथ फ्लश अस्थि मज्जा काटना.
  9. 5 मिनट के लिए 2500 rpm पर एक microfuge में कोशिकाओं को इकट्ठा. 2% FBS युक्त पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.20 मिलीग्राम / एमएल DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, 1:1,000) और FITC संयुग्मित α-hCD45 (1:100) या माउस आईजीजी 1 निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (1:100) के साथ कोशिकाओं और दाग लीजिए . फ्लो का उपयोग ल्यूकेमिया engraftment मूल्यांकन. व्यवहार्य आबादी पर गेट (DAPI नकारात्मक) और CD45 + कोशिकाओं (% अस्थि मज्जा विस्फोटों) का प्रतिशत निर्धारित.

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत assays TKIs द्वारा मध्यस्थता जैव रासायनिक और कार्यात्मक प्रभाव का मूल्यांकन और इन विट्रो में और vivo में लक्ष्य निषेध की डिग्री के आधार पर उपन्यास यौगिकों पद के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कॉलोनी गठन की कमी, और एनएसजी चूहों में leukemogenesis में देरी luciferase के साथ प्रतिरोपित ल्यूकेमिया कोशिकाओं में चिह्नित.

Immunoblot विश्लेषण TKIs साथ इलाज के बाद ल्यूकेमिया कोशिकाओं में प्रोटीन लक्ष्य की सक्रिय phosphorylated फार्म का निषेध निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था. TKIs के साथ उपचार. 1 TKI सी सबसे शक्तिशाली होने के साथ एक तीव्र लेकिमिया सेल लाइन में तीन अलग TKIs द्वारा लक्ष्य phosphorylation के निषेध से पता चलता है phosphorylated प्रोटीन की मात्रा में एक खुराक पर निर्भर कमी के परिणामस्वरूप, TKI बी कम शक्तिशाली जा रहा है, और TKI एक कोई प्रभाव रहा. इस प्रकार, इस परख एक सेल आधारित मॉडल प्रणाली में जैव रासायनिक गतिविधि की शक्ति पर आधारित यौगिकों की रैंकिंग की अनुमति देता है. में दिखाया उदाहरणों मेंचित्रा 1, immunoprecipitation और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला pervanadate के उपयोग द्वारा प्रतिजन के संवर्धन व्याख्या परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक थे. उस के लिए कारण इस tyrosine kinase के प्रोटीन phosphorylation चरम अस्थिर है कि, हो सकता है.

तीव्र ल्यूकेमिया कोशिकाओं के oncogenic संपत्तियों पर TKIs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, कॉलोनी गठन assays के लिए इस्तेमाल किया गया. हम methylcellulose आधारित (सभी) मध्यम में और नरम अगर (एएमएल) में कालोनियों के रूप में करने के लिए लक्ष्य पर निर्भर ल्यूकेमिया कोशिकाओं की क्षमता की जांच की. चित्रा 2A, कॉलोनी संख्या में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी में दिखाए गए उदाहरण में एक TKI के साथ उपचार के बाद एक सभी सेल लाइन में मनाया गया. इसी तरह के परिणाम नरम अगर में TKIs साथ उपचार के बाद एएमएल सेल लाइनों में मनाया गया. चित्रा 2B में, TKI साथ उपचार और के जवाब में कमी आई कॉलोनी संख्या की ओर एक प्रवृत्ति है कमी खुराक पर निर्भर होता है, लेकिन फर्क सेंट नहीं हैप्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता के परिणाम के रूप में atistically महत्वपूर्ण. 2A चित्रा चित्रा 2B सापेक्ष में बड़े मानक त्रुटियों पर ध्यान दें. अर्द्ध ठोस मध्यम और कुओं या प्लेटों में अर्द्ध ठोस मध्यम के समान वितरण में कोशिकाओं की पर्याप्त मिश्रण clonogenic assays में replicates के बीच स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है. पूर्व चढ़ाना के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की सटीक गिनती. चित्रा -2, कालोनियों की एक असमान वितरण के साथ एक थाली से पता चलता नरम अगर में बुलबुले, और अधूरा थाली में नरम अगर (सही पैनल) के प्रसार और भी प्रयोगों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है तुलना (पैनल छोड़ दिया है) के लिए पर्याप्त चढ़ाना के साथ एक थाली. Methylcellulose ऊष्मायन अवधि के दौरान बाहर सूखा नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए यह हर डिश में बाँझ पानी की प्लेटें शामिल करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. Methylcellulose मध्यम निर्जलीकरण इसकी घनत्व में परिवर्तन और जिससे संभावित, कालोनियों के रूप में कोशिकाओं की क्षमता कम कर देता हैउपयोगी परिणाम की पीढ़ी को रोकने.

TKIs vivo में लक्ष्य प्रोटीन को बाधित कर सकते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण एक तीव्र लेकिमिया सेल लाइन के साथ प्रतिरोपित एनएसजी चूहों से अलग अस्थि मज्जा विस्फोटों में phospho प्रोटीन और कुल प्रोटीन के स्तर की जांच के लिए नियुक्त किया गया था. 3 चित्र में दिखाए गए उदाहरण में, pharmacodynamic विश्लेषण केवल वाहन के साथ इलाज चूहों को TKI रिश्तेदार के साथ इलाज चूहों से अलग leukemic विस्फोटों में phospho प्रोटीन के स्तर में कमी का पता चला. इन अध्ययनों से इन यौगिकों अस्थि मज्जा तक पहुँचने और प्रभावी ढंग से रोकना लक्ष्य, पुष्टि है कि vivo में TKIs साथ इलाज के बाद ल्यूकेमिया कोशिकाओं में ऑटो phosphorylation के निषेध प्रदर्शित करता है. TKI डी इस परख में TKI ई की तुलना में कम सक्रिय था. उदाहरण के लिए, लक्ष्य phospho प्रोटीन को स्थिर करने और पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए pervanadate की आवश्यकता उपयोग दिखाया.

एनएसजी मील में तीव्र लेकिमिया के एक orthotopic माउस xenograft मॉडलCE एक luciferase व्यक्त सभी सेल लाइन विवो में oncogenic संभावित पर एक TKI के साथ उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ इंजेक्शन. चित्रा 4 में दिखाया गया है, TKI साथ इलाज चूहों केवल वाहन के साथ इलाज चूहों के लिए एक कम ल्यूकेमिया बोझ रिश्तेदार का संकेत है, bioluminescence का एक महत्वपूर्ण कम स्तर पर था. इलाज के 10 दिनों के बाद, सभी चूहों वाहन और TKI के साथ इलाज जानवरों के साथ इलाज जानवरों के बीच काफी अलग नहीं था कि bioluminescence का स्तर कम था. TKI की एक उच्च खुराक के साथ इलाज चूहों बहुत कम संकेत तीव्रता थी, जबकि इसके विपरीत, 19 दिनों से उपचार के बाद, वाहन का इलाज चूहों, (86.12 ± 19.17 फोटॉनों / सेक) महत्वपूर्ण उच्च bioluminescence तीव्रता था (29.64 ± 9.04 फोटॉनों / सेक) .

चित्रा 1
चित्रा 1. TKIs विट्रो में लक्ष्य प्रोटीन की phosphorylation रोकना. सेल संस्कृतियों 1 घंटे के लिए TKI ए, TKI बी, या TKI सी के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया. Pervanadate लक्ष्य प्रोटीन की phosphorylated फार्म को स्थिर करने के लिए 3 मिनट के लिए सेल संस्कृतियों में जोड़ा गया था. लक्ष्य प्रोटीन सेल lysates से immunoprecipitated गया था और phospho प्रोटीन और कुल प्रोटीन वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा पता चला रहे थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. TKI methylcellulose और नरम अगर में तीव्र लेकिमिया सेल लाइनों में कॉलोनी गठन कम कर देता है. सभी कोशिकाओं methylcellulose (ए) और एएमएल कोशिकाओं में चढ़ाया गया है में चढ़ाया गयाएक TKI या DMSO (वाहन नियंत्रण) की उपस्थिति में बहुधा अगर (बी). कालोनियों संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद गिना रहे थे. मीन मूल्यों और मानक त्रुटियों तीन प्रतियों प्लेटों से प्राप्त किए गए. (सी) कालोनियों के इष्टतम वितरण (बाएं पैनल) या कालोनियों के असमान वितरण और एक आंशिक रूप से अलग नरम अगर (सही पैनल) के साथ प्रतिनिधि मुलायम अगर प्लेटों दिखाए जाते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. TKI के साथ उपचार विवो में phospho प्रोटीन के स्तर को कम कर देता है. एक एनएसजी चूहों एक सभी सेल लाइन के साथ प्रतिरोपित और केवल ल्यूकेमिया के विकास के बाद एक भी TKI डी की खुराक, TKI ई, या वाहन के साथ इलाज किया गया. अस्थि एमतीर कोशिकाओं femurs से एकत्र की है और पिछले पूरे सेल lysates की तैयारी करने के लिए pervanadate साथ इलाज किया गया. लक्ष्य प्रोटीन, और पश्चिमी धब्बा द्वारा phospho और कुल प्रोटीन का पता लगाने के Immunoprecipitation प्रदर्शन किया गया. बी संकेत तीव्रता densitometry और वाहन पशुओं का इलाज करने के लिए phosphorylated प्रोटीन लक्ष्य के सापेक्ष गणना की गई के अंश द्वारा quantitated गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. TKI के साथ उपचार एक luciferase व्यक्त मानव सभी सेल लाइन के साथ प्रतिरोपित चूहों में रोग प्रगति में देरी. एनएसजी चूहों की पूंछ में इंजेक्शन द्वारा luciferase-transduced सभी कक्षों की एक मोनोक्लोनल आबादी के साथ प्रत्यारोपित किया गयानस. डी luciferin intraperitoneally इंजेक्ट किया गया था और bioluminescence छवियों (Bining: 8, FOV 19.6, एफ / 1 रोक, जोखिम समय 120 सेकंड) दो बार साप्ताहिक ले जाया गया. एक pseudocolor छवियों ल्यूकेमिया कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित चूहों में समय के साथ वृद्धि हुई bioluminescence तीव्रता और एक TKI साथ इलाज पशुओं में bioluminescence तीव्रता में एक खुराक पर निर्भर कमी का प्रदर्शन दिखाया गया है. एक अध्ययन समूह के लिए मतलब bioluminescence तीव्रता और मानक त्रुटि के बी Quantitation. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

इस पांडुलिपि तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में उपन्यास tyrosine kinase inhibitors के मूल्यांकन के लिए एक प्रभावी रणनीति का वर्णन है. इस दृष्टिकोण का उपयोग, जैव रासायनिक और विरोधी ल्यूकेमिया गतिविधियों में इन विट्रो सेल आधारित assays में पहली बार मूल्यांकन किया है और फिर इन विवो में xenograft मॉडल में कर रहे हैं. Immunoblot विश्लेषण सफलतापूर्वक TKIs साथ उपचार के बाद ल्यूकेमिया कोशिकाओं में लक्ष्य tyrosine kinase के निषेध प्रदर्शित करने के लिए और सीधे कोशिकाओं में कई यौगिकों की शक्ति तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, pervanadate phospho प्रोटीन को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation द्वारा केंद्रित किया गया था. इन मापों वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए अपर्याप्त थे, phospho प्रोटीन के स्तर को भी साथ या pervanadate बिना, या तो ligand के अलावा द्वारा बढ़ाया जा सकता है. इसी तरह, ligand pharmacodynamic अध्ययन के लिए अस्थि मज्जा फ्लश करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है. लीगांड शुद्ध किया जा सकता है या, कुछ मामलों में, भ्रूण गोजातीय सीरम के एक घटक के रूप में प्रदान किया जा सकता है. यह संभव है जब सीधे लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने के लिए बेहतर है, हालांकि इन तरीकों ऑटो phosphorylated tyrosine kinase का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं देते कि घटना में, बहाव के लक्ष्यों को भी, लक्ष्य निषेध के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई सेलुलर प्रोटीन प्रभावित करता है एक गैर चयनात्मक फॉस्फेट अवरोध करनेवाला है जो pervanadate, का उपयोग कर प्रयोगों के परिणामों की व्याख्या जब ध्यान से, सावधानी से किया जाना चाहिए. इस कारण से, pervanadate बहाव के संकेत घटकों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.

पशु मॉडल में अध्ययन करने से पहले, यह ल्यूकेमिया कोशिकाओं में TKIs द्वारा मध्यस्थता लेकिमिया विरोधी गतिविधि की पुष्टि करने के लिए वांछनीय है. इन अध्ययनों के लिए हम methylcellulose या नरम अगर मध्यम में clonogenic assays पर भरोसा करते हैं. अन्य assays भी संस्कृति में विरोधी ट्यूमर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कॉलोनी गठन assays अक्सर अधिक जनसंपर्क कर रहे हैंतरल संस्कृति में प्रसार और / या अस्तित्व का आकलन है कि अधिक परंपरागत assays के लिए vivo में प्रभावकारिता रिश्तेदार की edictive. हालांकि, इन assays TKIs द्वारा मध्यस्थता लेकिमिया विरोधी गतिविधि के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए और भी ब्याज की एक सेल लाइन कालोनियों के रूप में नहीं है कि घटना में उपयोगी हो सकता कॉलोनी गठन assays के साथ प्रयोग किया जा सकता है. विशेष रूप से, यह cleaved / सक्रिय caspases के स्तर को निर्धारित करने के लिए प्रवाह cytometric assays का उपयोग TKIs साथ उपचार के जवाब में apoptosis के शामिल होने का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, कोशिका की सतह को Annexin वी के बंधन में वृद्धि हुई है, या YOPRO-1-आयोडाइड का अंतर तेज . इसी तरह, यह भी लेकिमिया विरोधी गतिविधि में योगदान कर सकते प्रसार या भेदभाव के शामिल होने की कमी हुई. जैसे, विकास घटता प्रसार और सेलुलर आकारिकी और भेदभाव चरण निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती कोशिका की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का आकलन करने के लिए TKI की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उत्पन्न किया जा सकता है. clonogenic का उपयोगassays अच्छी तरह से दवा के विकास के क्षेत्र में स्थापित और TKIs के मूल्यांकन के लिए एक लागत प्रभावी उपकरण के रूप में कार्य करता है. हालांकि, यह (वृद्धि कारक है और अन्य की खुराक, सीरम संरचना में बदलाव, और TKI समाधान के पीएच में मतभेद के अलावा सहित) संस्कृति की स्थिति में व्यवस्थित परिवर्तन कॉलोनी विकास और chemosensitivity 9,10 दोनों को प्रभावित कर सकते हैं कि जाना जाता है. इसलिए, संस्कृति की स्थिति में स्थिरता इस परख में reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं या TKI का असमान वितरण भी प्रायोगिक उपचारों (चित्रा -2) की प्रभावकारिता के mischaracterization हो सकती है. दवा प्रदर्शन के बाद कॉलोनी गिनती या चढ़ाना के लिए एक से अधिक बार बिंदु के अलावा मूल्यांकन में विरोधी proliferative प्रभाव मध्यस्थता लेकिन कोई उपचारात्मक संभावित 7 है कि दवाओं के बीच अंतर करने में मदद मिल सकती है.

यहाँ वर्णित vivo अध्ययन clinica ओर रास्ते पर एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्वएक TKI के एल आवेदन. लक्ष्य निषेध प्रदर्शित करने के लिए pharmacodynamic पढ़ाई प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के बाद पढ़ाई के लिए प्रासंगिक खुराक और प्रशासन की आवृत्ति को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. ज्यादातर मामलों में यह लक्ष्य प्रोटीन की पूर्ण और निरंतर निषेध प्राप्त करने के लिए और इस अधिक एक दिन में एक बार से उपचार की आवश्यकता हो सकती है बेहतर है. इसके अलावा, xenograft मॉडल में leukemogenesis और वृद्धि की उत्तरजीविता के निषेध अस्थि मज्जा में पूर्ण और सतत जैव रासायनिक अवरोध के लिए आवश्यक है की तुलना में TKI की एक उच्च खुराक की आवश्यकता हो सकती है. ल्यूकेमिया कई स्थलों पर स्थापित करता है और TKIs के लिए जोखिम मस्तिष्क सहित विभिन्न शारीरिक स्थानों में विषम हो सकता है क्योंकि यह तब हो सकता है, या यह (सक्रिय लक्ष्य प्रोटीन की सीमित शेष मात्रा का पता लगाने के लिए एक विफलता में जिसके परिणामस्वरूप परख की संवेदनशीलता में सीमाओं को प्रतिबिंबित सकता है यानी अधूरा लक्ष्य निषेध). बहरहाल, उनकी अधिकतम पर प्रशासित रहे हैं जो पारंपरिक साइटोटोक्सिक उपचार के विपरीतखुराक सहन, अधिक ट्यूमर चयनात्मक molecularly लक्षित एजेंटों लक्ष्य प्रोटीन की जैव रासायनिक अवरोध के लिए पर्याप्त हैं लेकिन महत्वपूर्ण toxicities के साथ संबद्ध नहीं हैं कि कम मात्रा में समान रूप से प्रभावी हो सकता है. इस प्रकार, एजेंटों के इस वर्ग के लिए, xenograft मॉडल में ल्यूकेमिया प्रगति पर एक TKI के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रारंभिक अध्ययन अक्सर लक्ष्य की पूर्ण और निरंतर निषेध प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम खुराक का उपयोग. ल्यूकेमिया प्रगति या अस्तित्व पर कोई प्रभाव मनाया जाता है विषाक्तता मनाया जाता है, जब तक खुराक बढ़ा जा सकता है. इन मॉडलों को भी इस तरह के विकास के बाद नैदानिक ​​प्रोटोकॉल बताए, मानक ल्यूकेमिया चिकित्सा के साथ संयोजन में प्रशासित एक TKI के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

luciferase व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग कर तीव्र ल्यूकेमिया के xenograft मॉडल की स्थापना के अधिक परंपरागत xenograft मॉडल पर एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है और काफी तेजी लाने की क्षमता हैदवाओं की खोज और विकास 11 की प्रक्रिया. Bioluminescence इमेजिंग जिससे पढ़ाई के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम है, ल्यूकेमिया बोझ से गैर इनवेसिव अनुदैर्ध्य निर्धारण के लिए अनुमति देता है, और यह भी बीमारी के शारीरिक स्थान के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, TKIs की संभावित नैदानिक ​​उपयोगिताओं पर विस्तार करने के प्रयास में, bioluminescence इमेजिंग reproducibly प्राथमिक मानव luciferase टैग रोगी के नमूने 12 के प्रत्यारोपण के बाद प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, bioluminescence छवियों की व्याख्या के कारण प्रकाश उत्सर्जक कोशिकाओं की स्थितीय अनिश्चितता को चुनौती दे रहा है और इस तरह इन विवो bioluminescence इमेजिंग में ही समान स्थितियों 13 के तहत एक ही पशु पालन करने के लिए एक semiquantitative उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए किया जा सकता है.

कई यौगिकों आगे रैनकिन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि यहाँ वर्णित assays, अतिरिक्त मापदंड में महत्वपूर्ण और तुलनीय गतिविधि है कि भाग्यशाली घटना मेंयौगिकों के ग्राम रिश्तेदार यौगिक संश्लेषण में आसानी, विलेयता, मौखिक bioavailability की डिग्री, pharmacokinetic गुण, और विष विज्ञान के अध्ययन में शामिल हैं. साथ में ले ली, इन आंकड़ों चिकित्सीय जांच के लिए प्रगति के लिए एक इष्टतम परिसर की पहचान के लिए अनुमति और नैदानिक ​​अध्ययन के लिए सक्षम करने के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के साथ एक investigational नई औषध (इंडस्ट्रीज़) आवेदन दाखिल करने का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं चाहिए. क्लिनिक में इन उपन्यास एजेंटों की उन्नति के लिए आवश्यक है कि इन महत्वपूर्ण पूर्व नैदानिक ​​डेटा पैदा करने के बाद, स्वास्थ्य के कैंसर के उपचार के मूल्यांकन कार्यक्रम (CTEP) के राष्ट्रीय संस्थान के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए. इस कार्यक्रम में क्लिनिकल परीक्षण शोधों पर एक विशेष जोर देने के साथ, नए विरोधी कैंसर एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए प्रायोजित कर रहे हैं. देखभाल के संरक्षण के लिए पेटेंट आवेदन प्रस्तुत करने के साथ, उपन्यास यौगिकों के ढांचे और संश्लेषण के विवरण सहित पूर्व नैदानिक ​​डेटा की सार्वजनिक प्रस्तुति, समन्वय करने के लिए लिया जाना चाहिएबौद्धिक संपदा अधिकारों टी. इस मामले की रचना और उपयोग के तरीकों की रक्षा के पेटेंट आवेदन दायर किया गया है जब तक सामान्य तौर पर, डेटा सार्वजनिक रूप से प्रस्तुत नहीं किया जाना चाहिए.

अंत में, हम तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में उपन्यास TKIs की क्षमता की जांच और मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल रणनीति का प्रदर्शन किया है. ल्यूकेमिया कोशिकाओं में लक्ष्य निषेध, संस्कृति में और मानव ल्यूकेमिया xenografts के साथ चूहों की अस्थि मज्जा से अलग, दोनों immunoblot द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. लक्ष्य निषेध के कार्यात्मक महत्व bioluminescent इमेजिंग के साथ clonogenic assays और orthotopic murine xenograft मॉडल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. एक साथ इन assays के क्लिनिक में इन उपन्यास translational एजेंटों की उन्नति के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण पूर्व नैदानिक ​​डेटा प्रदान करते हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

Vivo इमेजिंग में कोलोराडो कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय में IVIS साझा संसाधन (अनुदान P30-CA046934 द्वारा समर्थित) का उपयोग किया गया था. फ्लो फ्लो साझा संसाधन, कोलोराडो कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय (अनुदान P30CA046934 द्वारा समर्थित) पर प्रदर्शन किया गया था. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DKG को RO1CA137078) द्वारा समर्थित किया गया था. ABLS बाल रोग अमेरिकन अकादमी, अमेरिकन बाल चिकित्सा सोसायटी, और बाल स्वास्थ्य और मानव विकास (K12-HD000850) Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित बाल वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम, के एक साथी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332 
2-Mercaptoethanol  Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410  
ColonyGel Human Base Medium  ReachBio #1101  
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341  
Difco Noble Agar  BD Biosciences #214883  
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302 
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796  
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542  
FITC CD45  BD Bioscience #347463  
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2  
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04  
Protease Inhibitors  Roche #11836153001  
DNase Sigma #D4263  
Protein G Beads Invitrogen #10-1242  
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60  
  Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA  
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm   Nunclon #D8429-1CS  
6-well plates BD Bioscience #353046  
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956  
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646  
GelCount automated colony counter Oxford Optronix  
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200  
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202  
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR  
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02  
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800  
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042  
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38  
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628  
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465  
Extra fine bonn scissors FST #14084-08  
Student fine scissors FST #91460-11  
Moria ultra fine forceps FST #11370-40  
Extra fine graefe forceps FST #11150-10  
Scalpel handle FST #10003-12  
Scalpel blades FST #10011-00  

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References

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