Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Reseptör tirozin kinazlar, lösemi ve katı tümörlerin her ikisi de dahil olmak üzere birçok kanser gelişimi ve ilerlemesi implike edilmiştir, ve çekici druggable tedavi hedeflerdir. Burada akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörleri (TKIs) klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir dört aşamalı bir strateji tarif eder. Başlangıçta, western blot analizi kültürlenmiş lösemi hücrelerinde hedef inhibisyon doğrulamak için kullanılır. Fonksiyonel aktivite bu metilselüloz ya da yumuşak agar kültürlerde klonojenik tahliller kullanılarak değerlendirilir. Hücre kültürü deneylerinde etkisini gösteren deney bileşikleri, insan lösemi hücre hatları ile ortotopikal NOD-SCID-gamma (NTG) fare kullanılarak in vivo olarak değerlendirilir. İlk in vivo farmakodinamik çalışmalar kemik iliğinden izole lösemik patlamalarda hedef önlenmesini değerlendirecek. Bu yaklaşım, etkin bir hedef inhibit için gerekli uygulama doz ve programın saptanması için kullanılıriyon. Daha sonraki çalışmalar, bu şekilde, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama lösemi yükü ve terapötik yanıtın değerlendirilmesi non-invazif biyolüminesans izleme sağlayan, lusiferazı ifade eden lösemi hücreleri kullanılarak in vivo TKIs etkinliğini değerlendirmek. Bu strateji, in vitro ve in vivo olarak TKIs değerlendirilmesi için etkili olmuştur ve tedavi edici potansiyele sahip moleküler hedefli maddelerin tanımlanması için veya birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırılması ve öncelik için uygulanabilir.

Introduction

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) çocuklarda 1,2 en sık görülen hastalıktır. Pediatrik B-soy ALL (B-ALL) için genel sağkalım oranı yaklaşık% 85 olduğunu, ancak T-soy ALL (T-ALL) dahil olmak üzere belirli biyolojik alt tipleri, hatta güncel tedavi protokolleri ile hala kötü prognoz var. Nükseden ALL ileri tedavi bir meydan okuma 3 kalır. Akut lösemili erişkin hastaların çoğunluğu yukarı ön kemoterapi ile remisyon elde olmasına rağmen, birçok hasta hala nüks 4 muzdarip. Akut lösemi tedavisinde de mevcut kemoterapötik rejimler toksisite ile ilişkili kısa ve uzun süreli yan etkilere neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, özel olarak da normal dokular üzerinde minimal etkisi ile kanser hücrelerini hedefleyen, daha az toksik tedaviler büyük ihtiyaç vardır. Son yıllarda, vurgu roman, kanser hücreleri için spesifikliği olan moleküler olarak hedeflenen ajanlar, sıklıkla tekrarlı kimya kullanılarak geliştirilmesi üzerinde yerleştirilmiştirdaha sonra karşılaştırıldı ve 5, öncelikli edilmesi gereken birden çok aktif bileşikler üretir. Bu makale ilaç gelişimini kolaylaştırmak amacıyla, tek bir bileşiğin değerlendirilmesi için ya da birden fazla bileşiklerinin doğrudan karşılaştırmak için kullanılabilir akut lösemi tedavisi için TKIs klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Burada sunulan yöntem dört adımdan oluşur. İlk olarak, biyokimyasal (1) ve anti-lösemi (2), bileşik (ler) in aktiviteleri hücre kültürü içinde değerlendirilir, daha sonra hedef inhibisyonu hayvan modellerinde, (3) olarak doğrulanmıştır ve TKİ (lar) ın son olarak tedavi edici etkisi olduğu Ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir (4). Bu çalışmalar için, en yaygın biyolojik alt tiplerinin temsilcileri uygun hücre hatları, seçmek önemlidir. Hücre çizgileri biyolojik etkiler med olup olmadığını araştırmak için, her ikisi de, ilgi konusu hedef ifade ilgilenilen hedef eksikliği olan seçilmelidirhedef inhibisyonu ile iated. Bu anti-tümör aktivitesi için önemli olabilir hedef dışı etkiler küçük molekül inhibitörleri, geliştirilmesi için özellikle uygundur. Bu tür proliferasyonu veya hayatta kalma gibi işlevsel etkileri için hedefe bağlı olan bir hücre hattını seçmek için de gereklidir. Hedefi inhibe RNA girişimi ya da diğer özel araçlar kullanılarak (bu madde kapsamı dışında) ön hedef geçerlilik çalışmaları, hedef bağımlı hücre çizgilerini belirlemek için kullanılabilir. Bu hücre kültürü sonuçlar daha doğrudan in vivo deneyler için tercüme olabilir, öyle ki, murin ksenograftları oluşturabilir hücre çizgilerini seçmek için de arzu edilir.

Lösemi hücrelerinde TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal etkinliğin değerlendirilmesi için, reseptör fosforilasyon bir azalma hedef inhibisyonunun bir göstergesi olarak kullanılabilir. Western blot analizi, veya ELISA tahlilleri antikorların mevcudiyetine ve özelliğine göre, kullanılabilecektir.Hedef için yeterli özgüllüğü olan antikorlar bulunmaktadır, bunlar daha nicel ve verimli olarak, ELISA deneyleri, tercih edilir. ELISA için yeterli özgüllüğü olan antikorlar mevcut değildir durumlarda, western blot analizi gerekli olabilir. Bu durumda, lizat büyük bir miktarda immüno-çökeltme düşük bolca hedeflerin saptanması için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, çevresel uyarılara cevap olarak sinyal hızlı değişiklikler için izin vermek için çok kısa bir yarı ömre sahip olabilir, fosfo-proteinlerin, ölçümü için özellikle uygundur. Bazı fosforilatlanmış proteinler, son derece kararsız fosfatazlar ile kompleks oluşumunun bir sonucu olarak çok muhtemeldir. Bu fosforile edilmiş proteinler, sağlam ve sürekli saptanması için, aynı zamanda önceki bütün hücre lizatları hazırlanmasına fosfo-proteinin stabilize edilmesi için, pervanadate, geri dönüşü olmayan bir protein-tirosin fosfataz inhibitörü 6 hücreleri tedavi etmek de mümkün olabilir.

Karşıbiyokimyasal aktivitesi anti-tümör etkilere neden olup olmadığını belirlemek, hedefe bağlı biyolojik süreçlerin hücre bazlı deneylerde izlenebilir. Lösemi hücre hatları için, TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi metilselüloz ya da yumuşak agar 7 gerçekleştirilen koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak değerlendirilebilir. Bu TKİ ile tekrar tedavinin gerekli ise manipülasyon için daha uygun olan bir katı ortam olduğu gibi yumuşak agar tercih edilebilir. , Birçok akut myloid lösemi (AML) hücre çizgileri yumuşak agar içinde koloni oluşturacak birlikte, en önemlisi hücre hatları, sadece yan-katı ortam olduğu, metilselüloz koloniler oluşturacaktır. Bu metilselüloz kültürlerde orta ve / veya TKIs yenilemek için mümkün olmakla birlikte, sadece küçük miktarlar kullanılır ve sınırlı bir frekans ile olabilir. Benzer şekilde, metilselüloz bunları bozmadan koloniler leke daha zordur. Ön çalışmalar, metilselüloz ve / veya yumuşak agar ve t koloni oluşturmak için uygun hücre çizgilerinin yeteneğini tanımlamalıdıro kültür içindeki hücrelerin optimum yoğunluk koloniler örtüşmeyen ve yeterli sayıda (35 mm tabak başına genellikle 50-200 koloni) istatistiksel olarak ilgili veri elde etmek için bu tür.

In vitro deneyler, sağlam ve uygun maliyetli olan ve var ise bütün hayvan deneylerinde, terapötik bileşikler arasında ilerlemesi daha az etik sorunlar, hayvan modellerinde etkinlik ve güvenlik kanıtı gerektirir. İn vivo çalışmalar, insan akut lösemi hücre çizgileri orthotopically I tm1Wjl / SzJ (NTG) fareler ve TKIs kolaylıkla enjeksiyon ya da ağızdan sonda ile tatbik edilebilir l2rg NOD.Cg-Prkdc SCID transplante edilebilir. Bazı hücre hatları ksenogratflardır kurmak için sırayla radyasyonun düşük hücre hattı bağımlı doz NSG farelerin maruz gerektirebilir ve bu durumda fareler 5-10 günde iyileşme dönemi sonrası ışınlama olmaksızın ağızdan sonda tahammül edebilir. Bu el yazması kullanılarak B-ALL ve T-ALL xenogreftler nesil açıklarama örnekler ksenograftlarının gibi özel hücre çizgileri (697 ve Jurkat) hücre hatlarının geniş bir yelpazede kullanarak NTG farelerde kurulabilir. Diğer hücre çizgileri daha uygun olması durumunda ise, ışınlama için gereksinim, organ nakli ve hastalık başlangıcı ve ilerlemesini zamanlama hücrelerin optimum sayısı deneysel olarak tespit edilmelidir. İdeal olarak, bu modelleri (hastalığa bağlı ideal olarak 20-30 gün çalışma tedavi ve kaldırma başlangıcı arasında) tam bir penetrans (nakledilen her hayvan lösemi geliştirir), tutarlı kinetiği (lösemi bütün hayvanlarda benzer şekilde ilerler) ve uygun bir tedavi penceresi olacak . Nakledilen hücre sayısı penetrans ve kinetik tutarlılığını arttırmak için artan veya gerekirse tedavi penceresi geliştirmek için azaltılabilir.

TKIs in vivo hedef inhibisyonu aracılık olmadığını belirlemek için, numuneler TKİ veya yalnızca taşıyıcı ile tedavi sonrası lösemi ksenograftları olan farelerden toplanır. İdeal olarak, bir dozBu deneyler için uygulama d programı sık sık ticari laboratuarlar tarafından gerçekleştirilen ve bu makalenin kapsamı dışında olabilir farmakokinetik çalışmalar, tarafından yönlendirilir. Eğer farmakokinetik veriler, mevcut ise, TKİ tek bir dozundan sonra, hücre kültürü içinde etkili hedef inhibisyonu ve maksimum serum konsantrasyon için gerekli olan bileşik konsantrasyonu hayvan çalışmaları için bir başlangıç ​​dozu tanımlamak için kullanılabilir. Farmakokinetik çalışmalar, aynı zamanda, farmakodinamik çalışmalarda ve tatbikat yolu için örnek toplama sonrası tedavi zamanlaması bilgilendirebilir. Hedef inhibisyonu etkilenen herhangi bir organda değerlendirilebilir fakat en kolay toplanır ve işlenir doku tercih edilir. Özel organlar etkilenir, ancak en akut lösemi hücre hatları, karaciğer, kemik iliği, dalak, periferal kan ve merkezi sinir sisteminde kurmak ve bu organlarda bütünleşme ölçüde modelleri arasında değişir. Burada sunulan protokol phosph değerlendiriyoro-protein western blot analizi kullanılarak kemik iliğinde önlenmesi, ama sağlam organ sürekli hasat için daha kolay ve örnek toplama ve işleme sırasında fosfo proteinlerin indirgenmesi için daha az olanak sağlayan, dondurulmadan önce az ya da hiç işlem gerektirebilir. İmmünohistokimya aynı zamanda, katı tümörler ya da lösemi etkilenen organların değerlendirmek için de kullanılabilir.

Son olarak, TKİ (ler) in terapötik etkinliği ortotopik lösemi ksenograft modellerinde belirlenir. Bu çalışmalar için, tedavi başladıktan zamanlaması hastalığın daha az ya da oluşturulacak şekilde, çeşitli olabilir. Tedavi başlangıç ​​çalışmaları için naklinden hemen sonra başlayabilir ve daha sonra önemli bir hastalık yükü daha yakından tanı tedavi modeli yaklaştığı tespit edilinceye kadar sonraki çalışmalarda gecikecektir. İdeal olarak, bu hayvan modelleri de hastalık yükünün non-invaziv ölçümü için kapasitesine sahiptir. Biz ateşböceği lucifer tanıtımı için yöntemler optimizeHastalık başlangıcı ve kemik iliği ve solid organ hastalık yükünün ilerlemesi ve değerlendirilmesi non-invaziv, boyuna analiz için izin virüs benzeri partikülleri kullanarak lösemi hücre hatlarının içine ase gen. Bu yaklaşım için kritik poliklonal hücre çizgilerinin kullanımı ile ilgili lusiferaz sentezleyen lösemi gelişiminde değişkenliği önlemek için monoklonal lusiferaz etiketli hücre çizgilerinin kullanımı ve TKİ 8 ile muamele ilgisi yoktur.

Birlikte ele alındığında, bu adımlar tek bir TKİ değerlendirilmesi için veya birden fazla TKIs doğrudan karşılaştırılması ve sıralama için kullanılabilir. Burada yer alan protokolleri TKIs gelişimi üzerinde odaklanırken, bu yöntemler başka hedeflere göre uyarlanabilir ve deney geliştirme için düşünceler tarif edilmiştir. Böylece, bu strateji, akut lösemi tedavisi için daha geniş bir uygulama moleküler olarak hedeflenen ajanlar klinik öncesi değerlendirme olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanları içeren tüm deneyler Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan yönetmelik standartlarını izledi. Gösterdi protokol Colorado Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Phospho-protein Western Blot

  1. Lizatlarının Hazırlanması
    1. Ilgi konusu reseptör tirosin kinazını ifade eden kültür hücre hatları. Hasat hücreleri ve plaka 3-5 x 10, bir 48-yuvalı doku kültürü çanağı içinde 400 ul büyüme ortamında 6 hücre / örnek. 2-3 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Büyüme ortamı içinde 5x TKİ çözeltisi 100 ul ilave edin ve 60 dakika boyunca inkübe edin.
    3. 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA,% 10 (v / v) gliserol,% 1 (v / v) Triton X-100 ve protez önleyicileri ile liziz tamponu hazırlayın. Kültürler hasattan önce pervanadate ile tedavi olmaz ise, fosfataz inhibitörleri (1 mM sodyum orthova eklemekliziz tamponu için nadate ve 0.1 mM sodyum molibdat).
    4. Kullanımdan hemen önce pervanadate (PV) fosfataz inhibitörü çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde koyu bir tüp (% 30 stok çözeltisinden 1:100 seyreltme) soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde hidrojen peroksit (DİKKAT) içinde bir% 0.3 çözelti hazırlayın. 0.2 M sodyum ortovanadat, 5 dakika boyunca (OV, DİKKAT) stok çözeltisi bir kısım kaynatın. Oda sıcaklığında (RT) 20 mM OV çözelti elde etmek için PBS içinde 1:10 seyreltin. % 0.3 hidrojen peroksit ve 20 mM OV 01:01 karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
    5. Tam bir ortam (60 ul + 940 ul PV ortamı) PV seyreltin. Iyi seyreltilmiş PV / 100 ul ekleyin. 3 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra buz üzerinde plaka yerleştirilir.
    6. 5 dakika boyunca 2500 rpm'de mikrofuj tüpleri içerisinde soğuk hücreleri hasat. Aspire edilen süpernatan ve liziz tamponu içinde 120 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 3 dakika boyunca 6,000 rpm'de bir mikrofüj içinde soğuk bir lizat açıklığa kavuşturulacaktır. Supe TransferiBir taze soğuk tüpe rnatant. -80 ° C'de saklayın
  2. İmmunopresipitasyon
    1. 1 dakika boyunca 1000 rpm'de mikrofuj içinde protein G sefaroz boncuklar aşağı spin. Süpernatantı ve boncuklar 1 ml soğuk PBS ile 2x yıkayın. % 50'lik bir bulamaç yapmak için PBS eşit hacim. Her bir örnek için birincil antikor ve 20 ul% 50 Protein G boncuk ekleyin. O / N 4 ° C'de bir karıştırıcı üzerine - 2 saat boyunca inkübe edilir.
    2. 9.000 rpm'de soğuk mikrofüjde boncuk aşağı Darbe. Süpernatantı ve boncuk 150 ul soğuk lizis tamponu ile 2x yıkayın. 1 dakika 1.000 rpm'de soğuk mikrofüjde Spin. 2-merkaptoetanol (DİKKAT) ile 20 ul 2X SDS Örnek Tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. -80 ° C'de hemen veya mağaza kullanın
    3. Bir SDS-PAGE Tris-glisin jel üzerinde 5 dakika ve çalıştırmak için kaynatın örnekleri. Bir nitroselüloz zara transfer proteinleri ve western blot ile bir protein fosfo-algılar.
    4. , Su ile yıkayın ve daha sonra leke,% 2 SDS içinde 62.5 mM Tris (pH 6.8), 0 inkübe edin.50 ° C'de 30 dakika boyunca 1 M β-merkaptoetanol (DİKKAT) , Su ile yıkayın ve daha sonra 2x çözeltisi sıyırma kaldırmak için TBS-T 5-6 değişiklikler 60-90 dakika boyunca yıkayın.
    5. Western blot ile total protein tespit.

2. Metilselüloz Deneyi

  1. Steril bir büyük delik künt uç iğne kullanarak 50 ml konik tüpler içine metilselüloz insan taban ortamının Kısım 4 ml. (Not:. Metilselüloz kullanım öncesinde RT O / N ° C'de çözülme parçalara ayrılmış ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir)
  2. 10 saniye boyunca girdap metilselüloz ve 4 ml büyüme ortamı içinde 10x TKİ veya aracın 500 ul ekleyin.
  3. Hasat ve sayım hücreler. Nihai hücre konsantrasyonu 10 kat daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Metil karışımına 500 ul hücre süspansiyonu ekleyin. 10 saniye için Vortex ve kabarcıklar çıkarmak için 10 dakika bekletin.
  4. 5 ml'lik bir şırınga ve steril bir larg kullanılarak metil 4 ml hazırlayınE künt uç iğne deliği. Kabarcıklar yukarı çizim kaçının. Üç adet 35 mm doku kültürü plakaları merkezine metilselüloz karışımının 1 ml dağıtın. Alt tamamen metilselüloz ile kaplıdır kadar bulaşıkları çalkalanır.
  5. Her bir plaka için metilselüloz, nemli bir ortam sağlamak için, steril su ile doldurulmuş iki ek 35 mm doku kültürü plakaları bir steril 10 cm doku kültürü plakası hazırlanır. Su içinde yer kültürler 10-14 gün boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de kuluçka ceketli.
  6. 1-2 hafta sonra kolonileri sayın. Koloniler, 20 den fazla değildir ve üst üste hücre olmalıdır. Koloniler, bir ızgara ile bir mikroskop aşaması ile donatılmış içbükey bir mikroskop kullanarak ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak sayılabilir. TKİ ile tedaviye yanıt olarak koloni büyüklüğü ve morfoloji açısından değişiklikler de değerlendirilmelidir. (4,5-Dimetil-2-tiyazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid sol - (3 60-100 ul ekleyerek koloni sayacı, leke koloni tarafından tespit geliştirmekution (MTT, -20 ° C'de 2 H, O, mağaza içinde 5 mg / ml, ışık, DİKKAT koruma) damla damla her plakanın yüzeyi üzerinde ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 8 saat boyunca inkübe.

3. Yumuşak Agar Tahlili

  1. Alt katman, üst tabaka için% 0.7 asil agar ve 2x büyüme ortamı için% 1 asil agar hazırlayın. Bir 42 ° C su banyosu içinde 2 x büyütme ortamı dengelenmesi. Isı% 1 ve bir mikrodalga (yaklaşık 1 min/100 ml)% 0.7 agar asil ve 42 ° C su banyosunda dengeye. % 1 agar ve orta ve 2x 50 ml conicals ayrı olarak,% 0.7 agar ve 2x ortamının eşit parçaya karıştırın. Her bir katman için yumuşak agar karışımı, / altı oyuklu plakanın Plan 10 mi.
  2. Etiket 6 oyuklu doku kültürü plakaları. 1.5 ml% 1, yumuşak agar karışımı ile de her doldurun. Kaplama sırasında kabarcıkları kaçının. 30 dakika süreyle steril kaput kapakları kapalı olarak kuru plakalar.
  3. Hücreleri saymak. Nihai hücre konsantrasyon derecesinden daha 500x daha yüksek olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamı içinde bir hücre süspansiyonu hazırlamaküzerinde. % 0.7 agar karışımına hücre süspansiyonu ekleyin, iyice karıştırın ve% 1 agar tabakasının üstüne agar hücre karışımı, 1.5 ml dağıtmak. Üst tabaka 30 dakika boyunca katılaşmaya edelim.
  4. TKİ veya araç kontrolü içeren 1x büyüme ortamı hazırlayın. Üst agar tabakasının üstüne TKİ istenen konsantrasyonuna sahip orta 2 ml ilave edilir.
  5. % 5 37 ° C'de 10 gün boyunca inkübe kültürler CO2. Her 3 günde bir çıkarın ve kaplanacağı orta yerine.
  6. Koloniler çıplak gözle, aspire bindirilirken orta görülebilir ve (4 ° C, H 2 O, mağaza 1 mg / ml NBT ışık, DİKKAT korumak) 200 ul nitro-tetrazolyum mavi çözüm eklediğinizde. 24-48 saat için inkübatör dönmek. Sayılmadan önce en az 2 saat boyunca 4 ° C'ye kadar gider. Lekeli plakalar bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bir mikroskop ya da otomatik bir koloni sayacı kullanılarak kolonileri sayın.

4. In vivo olarak, Phospho-protein önlemesinin değerlendirilmesi

  1. C toplayınarşın 5 dakika boyunca 1500 rpm'de bir masa üstü santrifüj içinde log fazında büyüyen. Steril bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve uygun bir konsantrasyonda PBS içinde tekrar süspansiyon (tipik olarak 1-5 x 10 7 hücre / ml). Bir 28 G insülin şırıngası kullanılarak kuyruk damarının içine damardan enjeksiyonu ile 6-12 haftalık NTG farelere 100 ul bir hacim içinde nakli hücreler. Damarları genişletmek için sıcak su bir beher içinde kuyruk ısı ve enjeksiyondan önce bir klorheksidin çubukla kuyruk temizlemek, süzgeç hayvan yerleştirin. Enjeksiyonundan sonra, kanama durana kadar steril gazlı bez ile enjeksiyon yerinde baskı uygulamak. Transplant en az 3 hayvan / grup. 1 mg / ml gentamisin sülfat içeren su fareler koruyun.
  2. On dört gün post-transplant, hedef inhibisyonu analizi için TKİ veya sadece araç ve hasat örnekleri ile hayvanları tedavi. Hayvanlar tartılır ve uygun bir doz TKİ veya aracın (vücut ağırlığının mg / kg) ile tedavi edilir. 5 ml / k hacminde tedavi yönetmeoral gavaj ile intraperitoneal (ip) enjeksiyon ya da 10 ml / kg vücut ağırlığı ile g vücut ağırlığı. Ip enjeksiyon için, el ile tutmaya ve fare bir 29 G iğne kullanılarak karnın sağ alt kadranda enjekte edilir. Oral gavaj için, elle fareyi dizginlemek ve dik hayvan tutun. Dil üzerinde ve ağız arkasına ağız gavaj tüpü yerleştirin. Yemek borusu yoluyla ve mideye tüp geçmek için hafif bir baskı uygulayın. Tedavi yönetmek için şırınga pistonu basınız. Piston kolayca bastırın etmezse gavaj iğne çıkarılır ve tekrar yerleştirilmelidir. Kullanımdan hemen önce TKİ formülasyonları hazırlayın.
  3. Pervanadate tedavi isteniyorsa, (aşama 1.1.4) yukarıda tarif edildiği gibi, hasattan önce PV çözelti 20 dakika hazırlamak ve 1 uM MgCl2 ve 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul ortam) ile ortam içine seyreltin. Not: PV seyreltildikten sonra en az 1 saat boyunca stabildir.
  4. Ap CO 2 narkoz tarafından hayvanların Kurbanpropriate süresi (ler) tedavi sonrası. Kemikleri tamamen maruz böylece tüm bacak kürk, deri ve kas kaldırarak femur teşrih. Sadece kalça eklemi altında ve yine diz eklemi üzerinde diseksiyon makas ile kırpma ile femur çıkarın. Bir şırınga ve bir 27 G iğne kullanılarak 1 ml soğuk PBS veya seyreltilmiş PV çözeltisi ile bir Petri kabı ve floş kemik iliği transferi. PV ile muamele halinde, 10 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edilir.
  5. Lizatlarını hazırlayın ve (adımlarla 1.1.6-1.2.5) yukarıda belirtildiği gibi phospho-protein ve total protein düzeyleri analiz.
  6. Densitometrisi kullanılarak her numune için göreli fosfo-protein ve toplam protein seviyelerini belirlemek. Araç ile muamele edilen hayvanlar için ortalama phospho-protein/total-protein değerine phospho-protein/total-protein göreli olarak hesaplayın.

5. ALL Ksenograft Modeller TKIs anti-lösemi Aktivitesinin Değerlendirilmesi

  1. Gerekirse, bir RS-2000 irradyatör bir gün prio radyasyonun 200 cGy fareler ortayanakli için r. (Adım 4.1) yukarıda tarif edildiği gibi lösemi hücre hatları ile farenin Transplant. Grup başına nakli en az 6 farenin. Kulak zımba tarafından fareler tanımlayın. Seçenek olarak ise, siyah bir işaretleyici kuyruklarını karma işaretleri fareler belirlemek için kullanılabilir. Çalışma sırasında kafes arkadaşı saldırganlık potansiyelini azaltmak için kafeslerine zenginleştirme ekleyin.
  2. (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi tek bir TKİ veya araç ile tedavi fareler. Fizik muayene ve kilo tespiti üzerinden günlük farelerin sağlık durumunu izlemek. Lösemi Beklenen semptomlar (aktivite düzeyi, kilo kaybı, arka bacak felci ve göz enfeksiyonları azalır). Kilo kaybı% 10'dan fazla% 15, genellikle iki gün içinde fare ölümü ile ilişkili olan ve tipik olarak standart IACUC şartlara uygun olarak ölüm için bir vekil uç nokta olmasıdır.
  3. Haftalık 2 kata varan bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi ile uyumunu ve lösemi gelişimini izleyin. Steri bir 200x D-lusiferin stok solüsyonu (30 mg / ml) hazırlayınle su. D-lusiferin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile yavaşça karıştırın. -20 ° C'de kullanarak, hemen ya da kısım ve donma Önce oda sıcaklığında D-luciferase alikotları çözülme ve 15 mg / ml ve filtre bir 0.2 mikron filtre içinden sterilize bir son konsantrasyona PBS içinde 1:02 seyreltilmiş, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak bio-ışıldama görüntüleme için.
  4. Oksijen% 1.5 inhale izofluran ile görüntüleme önce fareler anestezi. Kas gevşemesi, hareket kaybı ve ayak tutam uyarılmasına tepki kaybı ile karakterize yeterli anestezi, izleyin.
  5. Görüntülemeden hemen önce, ip enjeksiyonu (vücut ağırlığı 15 mg / ml lusiferin / g 10 ul) ile 150 mg / kg vücut ağırlığı D-luciferase yönetmek.
  6. Ardışık 30, 60 ve 90 sn pozlama ve 120 sn pozlama ile bir nihai görüntü ile görüntülerin 2 serisi yakalamak için bir in vivo biyoparlaklık görüntüleme sistemi kullanın. Görüntüleme sonra kafeslere fareler dönmek ve anestezi kurtarma için monitör. Bağlı olarak,biyoluminesans yoğunluğu, maruz kalma süreleri değiştiirlebilir. Optimal etki süreleri belirli bir model için önceden belirlenmiş ve bireysel zaman noktaları için sinyal yoğunlukları, tüm çalışma boyunca karşılaştırılabilir olduğunu tutarlı gibi tutulmalıdır.
  7. Yaşayan Image 3.2 toplama ve analiz yazılımı kullanarak her bir fare için biyoışıldama yoğunluğunu belirlemek. İkinci Her fare üzerinde aynı boyutta ilgi (ROI) bölgeleri çizerek fotonlar / ölçülen toplam akı değerlerini belirleyin.
  8. % 15 den daha fazla kilo kaybı durumunda, felç sergileyen, can çekişen veya çalışmanın sonunda ise CO2 maruz kalma ve servikal dislokasyon ile fareler kurban. Fareler ve kayıt gözlemler (; kemik iliği soluk dalak, karaciğer, lenf düğümleri ya da örneğin büyütme) teşrih. 27 G iğne kullanılarak femur ve soğuk PBS ile yıkayın kemik iliği teşrih.
  9. 5 dakika boyunca 2500 rpm'de bir mikrofüj içinde hücreleri toplamak. 2% FBS içeren PBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür, 1:1000) ve FITC-konjuge α-hCD45 (1:100) veya fare IgG 1 izotip kontrol antikoru (1:100) ile hücreler ve leke toplayın . Akım sitometri kullanarak lösemi engrafmanda değerlendirin. Canlı nüfus Kapısı (DAPI negatif) ve CD45 + hücrelerin (% kemik iliği blast) yüzdesini belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan deneyler, TKIs tarafından aracılık edilen biyokimyasal ve fonksiyonel etkisini değerlendirmek ve in vitro ve in vivo hedef inhibisyon derecesi göre yeni bileşikler sıralama için kullanılabilir, koloni oluşumunun azaltılması ve NTG farelerde lösemi gecikmesi, lusiferaz-transplante lösemi hücrelerini etiketledi.

Bağışıklık beneklenme analizi TKIs ile tedavi sonrası lösemi hücrelerinde hedef proteinin aktif fosforilatlanmış biçimde önlenmesini belirlemek için kullanılmıştır. TKIs ile tedavi. 1 TKİ C en etkili olmak üzere akut lösemi hücre hattı içinde üç farklı TKIs, hedef fosforilasyon inhibisyonunu göstermektedir fosforlu protein miktarı doza bağımlı bir azalma ile sonuçlanmıştır, TKİ B daha az etkili olan, ve TKİ A no etkiye sahip. Bu nedenle, bu deney, bir hücre bazlı bir model sistemde biyokimyasal etkinliğinin etki gücüne göre bileşiklerin sıralaması sağlar. Gösterilen örneklerdeŞekil 1, çökeltme ve fosfataz inhibitörü pervanadate kullanılmasıyla antijenin zenginleştirme tefsir edilebilir sonuçlar elde etmek için gerekli idi. Bunun sebebi, bu tirosin kinazın aşırı protein fosforilasyon kararsız olduğundan, olabilir.

Akut lösemi hücrelerinin onkojenik özelliklerine TKIs etkisini incelemek için, koloni oluşumu deneyleri kullanılmıştır. Biz, metilselüloz bazlı (ALL) ortam içinde ve yumuşak agar (AML) olarak koloni oluşturmak için hedef bağımlı lösemi hücrelerinin yeteneği araştırıldı. Şekil 2A'da, koloni sayısı istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olarak gösterilen örnekte, bir TKİ ile muamele edildikten sonra bir ALL hücresi çizgisinde gözlendi. Benzer sonuçlar, yumuşak agar içinde TKIs ile muamele edildikten sonra AML hücre hatlarında gözlemlenmiştir. Şekil 2B, TKİ ile tedavi ve cevaben azaldığı koloni sayısına yönelik bir eğilim vardır azalma doza bağımlı görünür, ama fark st değilçoğaltır arasında değişkenlik sonucu atistically önemli. Şekil 2A Şekil 2B, göreceli olarak büyük bir standart hataları edin. Yan-katı ortam ve kuyu ya da plakalar halinde, yarı katı ortam içinde eşit dağılım halinde, hücrelerin Geniş karıştırma klonojenik deneylerde tekrarlanmış arasındaki tutarlılık için çok önemlidir. Kaplama öncesi canlı hücre sayımı doğru. Şekil 2C, koloni düzgün olmayan bir dağılımı ile bir plaka gösterir, yumuşak agar içinde kabarcıklar ve eksik plakadaki yumuşak ağarda (sağ panel) yayılması ve aynı zamanda deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için önemlidir Karşılaştırma (sol panel) için yeterli kaplama ile bir tabak. Metilselüloz kuluçka döneminde kurumasına değil emin olmak için her yemeğin içinde steril su plakaları dahil etmek de önemlidir. Metilselüloz ortamının kurutma yoğunluğunu değiştiren ve böylece potansiyel olarak, koloni oluşturan hücrelerin yeteneğini azaltanyararlı sonuç oluşumunun önlenmesi.

TKIs in vivo olarak hedef proteini inhibe edip edemeyeceğini belirlemek için, western blot analizi, akut lösemi hücre hattı ile nakli NTG farelerden izole edilmiş kemik iliği patlamalarda fosfo-protein ve toplam protein seviyelerini incelemek için kullanılmıştır. Şekil 3'te gösterilen örnekte, farmakodinamik analizi sadece araç ile tedavi edilen fareler için TKİ nisbetle ile tedavi edilen farelerden izole edilen lösemik patlamalarda fosfo-protein seviyelerinde bir azalma ortaya çıkardı. Bu çalışmalar, bu bileşiklerin, kemik iliği ulaşmak ve etkili bir hedefi inhibe onaylayan, in vivo TKIs ile tedavi sonrası lösemi hücrelerinde oto-fosforilasyon inhibisyonunu göstermektedir. TKİ D bu deneyde TKİ e daha az etkindi. Örneğin, hedef fosfo-proteini stabilize etmek ve tespit edilmesi için izin vermek için gerekli pervanadate kullanımı gösterilmektedir.

NSG mi akut lösemi ortotopik fare ksenogreft modelice bir lusiferaz sentezleyen ALL hücre çizgisi vivo onkojenik potansiyeli üzerinde TKİ ile tedavinin etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır ile enjekte edilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, TKİ ile muamele edilmiş farelerin sadece araç ile tedavi edilen fareler için düşürülmüş lösemi yük göreli gösteren, biyolüminesans önemli ölçüde daha düşük düzeyde kaldı. Tedavinin 10 gün sonra, her farenin araç ve TKİ ile tedavi edilen hayvanlarda ile muamele edilen hayvanlar arasında belirgin bir fark olduğunu biyolüminesensin düşük düzeyde kaldı. TKİ yüksek bir doz ile tedavi edilmiş fareler daha düşük sinyal yoğunluğu vardı aksine, 19 gün sonra-muamele, araç ile tedavi edilmiş fareler, (86.12 ± 19.17 foton / saniye) önemli ölçüde daha yüksek bio-ışıldama yoğunluğu oldu (29.64 ± 9.04 foton / saniye) .

Şekil 1
Şekil 1. TKIs, in vitro olarak hedef proteinin fosforilasyonunu inhibe eder. Hücre kültürleri, 1 saat boyunca TKİ A, TKİ B veya C TKİ belirtilen konsantrasyonları ile muamele edildi. Pervanadate hedef proteinin fosforile edilmiş formunu stabilize etmek için 3 dakika boyunca hücre kültürlerine eklendi. Hedef protein hücre lisatlanndan immünopresipite ve fosfor protein ve total protein western blot ile tespit edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. TKİ metilselüloz ve yumuşak agar içinde akut lösemi hücre hatları içinde koloni oluşumunu azaltır. ALL hücreleri metilselüloz (A) ve AML hücrelerinde kaplandı s kaplanmıştırBir TKİ ya da DMSO (araç kontrol) varlığında sıkça agar (B). Koloniler kültüründe 2 hafta sonra sayıldı. Ortalama değerleri ve standart hatalar üç nüsha plakalarından elde edilmiştir. (C) kolonilerinin optimal dağılımı (sol panel) veya koloniler eşitsiz dağılımı ve kısmen müstakil yumuşak agar (sağ panel) ile Temsilcisi yumuşak agar plakaları gösterilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. TKİ ile tedavi in vivo fosfo-protein seviyesini düşürür. Bir NTG farenin bir ALL hücresi hattı ile nakli sadece lösemi geliştirme sonra tek TKİ D doz TKİ E, ya da araç ile muamele edilmiştir. Kemik mok hücreleri uyluk toplanmış ve önce bütün hücre lizatları hazırlanmasına pervanadate ile tedavi edildi. Hedef protein, ve western blot ile fosfor-ve toplam proteinlerin tespiti immünopresipitasyonu yapıldı. B Sinyal yoğunluğu, yoğunluk ve araçla tedavi edilmiş hayvanlarla fosfatlanmış hedef protein nisbetle hesaplandı fraksiyonu ile nicelendirildi. büyük resim görüntülemek için .

Şekil 4,
Şekil 4. TKİ ile tedavi, bir lusiferaz sentezleyen insan ALL hücre hattı ile transplante edilmiş farelerde hastalığın ilerleyişini geciktirir. NTG farenin kuyruk içine enjeksiyon ile lusiferaz transdüksiyona ALL hücrelerinin monoklonal bir nüfusu ile aktarılmıştırven. D-lusiferin ip olarak enjekte edildi ve bioluminesans görüntüleri (nı tekbir: 8, FOV 19.6, f / 1 stop pozlama süresi 120 sn), haftada iki kez alındı. A Pseudocolor görsel lösemi hücreleri ile transplante edilmiş farelerde, zamanla artmış, biyoışıldama yoğunluğu ve TKİ ile tedavi edilen hayvanlarda biyoışıldama yoğunluğu doza bağımlı bir azalma gösteren gösterilmiştir. Her çalışma grubu için ortalama biyoışıldama yoğunluğu ve standart hata B kantitasyonu. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makale, akut lösemi tedavisinde yeni tirozin kinaz inhibitörlerinin değerlendirilmesi için etkili bir strateji tarif etmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, biyokimyasal ve anti-lösemi etkinlikleri in vitro hücre bazlı deneylerde ilk olarak değerlendirilir ve daha sonra in vivo ksenograft modellerinde edilir. Bağışıklık beneklenme analizi başarılı TKIs ile tedavi sonrasında lösemi hücrelerinde hedef tirosin kinazın engellenmesini göstermek için doğrudan hücrelerde çok sayıda bileşiklerin gücünü karşılaştırmak için kullanılmıştır. Burada yer alan protokol, pervanadate fosfo-proteini stabilize etmek için kullanıldı ve hedef protein, immüno-çökeltme ile konsantre edilmiştir. Bu ölçümler western blot ile tespit edilmesi için izin vermek için yeterli olursa, fosfo-protein seviyeleri ile ya da olmaksızın ya da pervanadate, ligand ilavesiyle arttırılabilir. Benzer şekilde, ligand farmakodinamik çalışmaları için, kemik iliğini temizlemek için kullanılan bir çözeltiye ilave edilebilir. Ligand saflaştırılabilir ya da, bazı durumlarda, fetal sığır serumu bir parçası olarak sağlanabilir. Bu mümkün olduğunda, doğrudan hedef proteinin aktivitesini değerlendirmek için tercih edilmekle birlikte, bu yöntemler, otomatik fosforile tirosin kinazın tespiti için izin vermez durumunda, alt-hedefler de, hedef inhibisyonu değerlendirmesi için kullanılabilir. Birçok hücresel proteinleri etkiler seçici olmayan bir fosfataz inhibitörü pervanadate kullanarak deneylerin sonuçlarını yorumlarken notun, dikkatli kullanılmalıdır. Bu nedenle, alt pervanadate sinyal bileşenleri değişimlerin saptanması için kullanılmamalıdır.

Hayvan modellerinde çalışma önce, lösemi hücrelerinde TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi onaylamak istenebilecektir. Bu çalışmalar için biz metilselüloz ya da yumuşak agar ortamı içinde klonojenik deneylere dayanmaktadır. Diğer deneyler, aynı zamanda kültür anti-tümör etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir olsa da, koloni oluşumu deneyler, genellikle daha pr vardırsıvı kültür içinde çoğalmayı ve / veya hayatta kalmasını değerlendirmek için daha geleneksel deneylerde in vivo etkinliği, göreceli edictive. Bununla birlikte, bu deneyler, TKIs tarafından aracılık edilen anti-lösemi aktivitesi mekanizmasını ve aynı zamanda ilgi konusu bir hücre hattı koloniler oluşturmayan durumunda yararlı olabilir koloni oluşum deneyleri ile birlikte kullanılabilir. Özel olarak, bu yarılmış / aktif kaspaz seviyelerini belirlemek için akış sitometrik analizleri kullanılarak TKIs ile tedaviye yanıt olarak apoptoz indüksiyonunu değerlendirmek için yararlı olabilir, hücre yüzeyine Annexin V artan bağlama veya YOPRO-1-iyodür diferansiyel alımı . Benzer şekilde, aynı zamanda anti-lösemi aktivitesi katkıda proliferasyonu veya farklılaşmasını etkileme azalmıştır. Bu nedenle, büyüme eğrileri çoğalması ve hücre morfolojisi ve farklılaşma evresini belirlemek için incelenebilir hücre yüzeyi markerlerinin ifadesi değişiklikleri değerlendirmek için TKİ varlığında ve yokluğunda oluşturulabilir. Kolojenik kullanımıtahlilleri iyi ilaç geliştirme alanında kurulmuş ve TKIs değerlendirilmesi için bir maliyet etkin bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, (büyüme faktörleri ve diğer ilave, serum bileşim içinde varyasyonlar ve TKİ çözeltinin pH farklılıklar eklenmesi de dahil olmak üzere) kültür koşullarında sistemli değişiklikler koloni büyüme ve kemosensitiviteyi 9,10 hem de etkisi olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, kültür koşullarında tutarlılık bu deneyde yeniden üretilebilirlik için çok önemlidir. Hücrelerin veya TKİ dengesiz dağılımı da deneysel tedavilerin (Şekil 2C) etkinliğinin mischaracterization yol açabilir. İlaç maruz kaldıktan sonra koloni sayımı ya da kaplama için birden fazla zaman noktasında değerlendirilmesinde ek anti-proliferatif etkilere aracılık ancak tedavi edici potansiyele sahip 7 ilaçlar arasında ayrım yapmak için yardımcı olabilir.

Burada anlatılan in vivo çalışmalar clinica doğru yolda kritik bir adımı temsilBir TKİ l uygulama. Hedef engellenmesini göstermek için farmakodinamik çalışmalarda etkinliğini değerlendirmek için daha sonraki çalışmalar için uygun doz ve uygulama sıklığını belirlemek için önemlidir. Çoğu durumda bu hedef proteinin tam ve sürekli olarak engellenmesini elde etmek ve bu daha fazla günde bir kez daha bir tedavi gerektirebilir tercih edilir. Buna ek olarak, ksenograft modellerinde lösemi ve artan hayatta kalma inhibisyonu kemik iliğinde eksiksiz ve sürekli biyokimyasal inhibisyonu için gerekli olandan daha yüksek bir TKİ dozu gerektirebilir. Lösemi birden fazla yerden kurar ve TKIs maruz beyin de dahil olmak üzere, farklı anatomik yerlerde heterojen olabileceğinden, bu oluşabilir, ya da (aktif hedef proteinin sınırlı kalan miktarda tespit etmek için bir başarısızlıkla sonuçlanan tahlilin duyarlılığı sınırlamalar yansıtabilir örneğin, eksik hedef inhibisyon). Bununla birlikte, bunların en fazla tatbik edilmektedir geleneksel sitotoksik terapilere aksinedozu tolere, daha fazla tümör seçici moleküler hedefli maddeleri hedef proteinin biyokimyasal engellenmesi için yeterli olan fakat anlamlı toksisite ile bağlantılı olmayan daha düşük dozlarda aynı derecede etkili olabilir. Böylece, maddeleri sınıfı için, lösemi ksenograft modellerinde ilerlemesi üzerinde bir TKİ etkilerini değerlendirmek için yapılan ilk çalışmalar, genellikle hedefin tam ve sürekli olarak engellenmesini elde etmek için gerekli olan asgari dozu kullanmaktadır. Lösemi ilerlemesi veya hayatta kalması üzerinde bir etkisi görülmektedir ise toksisite görülmektedir kadar, doz arttırılabilir. Bu modeller, aynı zamanda bu şekilde bir sonraki klinik geliştirme bilgilendirme protokolleri, standart lösemi tedaviler ile kombinasyon halinde uygulanabilir bir TKİ etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Lusiferaz sentezleyen hücreler kullanılarak akut lösemi ksenograft modelleri kurulması daha geleneksel ksenograft modelleri üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir ve önemli ölçüde hızlandırma potansiyeline sahipîlaç araştırma ve geliştirme 11 süreci. Biyoparlaklık görüntüleme böylece çalışmaları için ihtiyaç duyulan hayvan sayısının azaltılması, lösemi yükünün non-invaziv uzunlamasına belirlenmesi için olanak sağlar, ve ayrıca hastalığın anatomik konumu hakkında bilgi verebilir. Buna ek olarak, TKIs potansiyel klinik yarar üzerine genişletmek için bir çaba olarak, bio-ışıldama görüntü yeniden üretilebilir primer insan lusiferaz etiketli hasta numunelerinin 12 transplantasyonundan sonra elde edilebilir. Bununla beraber bio-ışıldama görüntü yorumlanması nedeniyle ışık yayan hücrelerin konumsal belirsizlik zor ve bu nedenle in vivo görüntüleme biyolüminesans sadece aynı koşullar altında 13 ile aynı hayvan takip için yarı niceliksel bir araç olarak kullanılmalıdır olabilir.

Birden fazla Rankin bileşikler için de kullanılabilir Burada tarif edilen deneylerde, ek kriterlerinde önemli ve benzer aktiviteye sahip olduğu şanslı halindebileşiklerin g göreli bileşiği, sentez kolaylığı, çözünürlük, biyo-sağlanabilirlik, oral derecesi, farmakokinetik özelliklerini ve toksikoloji çalışmaları içerir. Birlikte ele alındığında bu veriler, klinik araştırma için ilerlemesi için en uygun bileşiğin tanımlanmasına olanak tanımaktadır ve klinik çalışmalar etkinleştirmek için Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ile bir Investigational New Drug (IND) başvurunun desteklemek için gerekli olan gerekir. Kliniğe içine bu yeni ajanların ilerlemesi için gerekli bu kritik ön-klinik verileri üretildikten sonra, Sağlık Kanser Tedavisi Değerlendirme Programı (CTEP) Ulusal Enstitüsü kullanımı düşünülmelidir. Bu programda klinik çalışmalarda yorumsal araştırmalar özel bir vurgu ile, yeni bir anti-kanser maddeleri değerlendirmek için sponsor. Care korunmada patent uygulamaları sunulması ile, yeni bileşiklerin yapıları ve sentez tanımı da dahil olmak üzere klinik öncesi verilerin halk tanıtımı, koordine etmek alınmalıdırfikri mülkiyet haklarını t. Madde kompozisyonu ve kullanım yöntemleri koruyucu patent başvurusu dosyalanmıştır kadar Genel olarak, veri kamuya sunulan olmamalıdır.

Sonuç olarak, akut lösemi tedavisi için terapötik maddeler olarak yeni TKIs potansiyelini araştırmak ve değerlendirmek için etkili bir strateji olduğunu göstermiştir. Lösemi hücrelerinde hedef inhibisyonu, kültür ve insan lösemi ksenograftları olan farelerin kemik iliğinden izole edilen iki, immunoblotting ile değerlendirilebilir. Hedef inhibisyon fonksiyonel önemi biyolüminesans görüntüleme ile klonojenik tahlilleri ve ortotopik sıçangil ksenograft modelleri kullanılarak değerlendirilebilir. Tüm bu deneyler, klinik olarak, bu yeni translasyon maddelerin gelişimi için gerekli olan önemli bir klinik öncesi veriler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

In vivo görüntüleme Colorado Kanser Merkezi'nde Üniversitesi IVIS Paylaşılan kaynak (hibe P30-CA046934 tarafından desteklenen) kullanılarak gerçekleştirildi. Flow sitometri Sitometrisi paylaşılan kaynak, Colorado Kanser Merkezi'nde Üniversitesi (hibe P30CA046934 tarafından desteklenen) gerçekleştirildi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DKG için RO1CA137078) tarafından kısmen desteklenmiştir. ABLS Amerikan Pediatri Akademisi, Amerikan Pediatri Derneği, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (K12-HD000850) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü hibe tarafından desteklenen Pediatrik Scientist Kalkınma Programı, bir üyesidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332 
2-Mercaptoethanol  Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410  
ColonyGel Human Base Medium  ReachBio #1101  
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341  
Difco Noble Agar  BD Biosciences #214883  
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302 
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796  
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542  
FITC CD45  BD Bioscience #347463  
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2  
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04  
Protease Inhibitors  Roche #11836153001  
DNase Sigma #D4263  
Protein G Beads Invitrogen #10-1242  
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60  
  Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA  
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm   Nunclon #D8429-1CS  
6-well plates BD Bioscience #353046  
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956  
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646  
GelCount automated colony counter Oxford Optronix  
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200  
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202  
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR  
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02  
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800  
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042  
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38  
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628  
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465  
Extra fine bonn scissors FST #14084-08  
Student fine scissors FST #91460-11  
Moria ultra fine forceps FST #11370-40  
Extra fine graefe forceps FST #11150-10  
Scalpel handle FST #10003-12  
Scalpel blades FST #10011-00  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
  2. Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
  3. Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
  4. Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
  5. Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
  6. Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
  7. Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
  8. Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
  9. Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
  10. Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
  11. Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
  12. Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
  13. Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics