कुल प्रोटीन निष्कर्षण और 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन तरीके के लिए

Immunology and Infection

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Summary

Burkholderia जीनस के सदस्य नैदानिक ​​महत्व के रोगजनकों हैं. हम यांत्रिक विघटन, और बाद में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग, कुल बैक्टीरियल प्रोटीन निकासी के लिए एक विधि का वर्णन.

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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Abstract

बैक्टीरियल प्रजातियों के intracellular प्रोटीन के स्तर की जांच के लिए इन जीवों से होने वाली बीमारी के रोगजनक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम फॉस्फेट बफर खारा में ethylenediamine tetraacetic एसिड और phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड की उपस्थिति में ग्लास मनकों का उपयोग मैकेनिकल सेल पर आधारित Burkholderia प्रजातियों से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. इस विधि अलग विकास की स्थिति के लिए, अलग Burkholderia प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह अन्य जीवाणुओं की प्रोटिओमिक अध्ययन में इस्तेमाल के लिए संभावना उपयुक्त है. प्रोटीन निकासी के बाद, एक दो आयामी (2 डी) जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटिओमिक तकनीक इन जीवों की proteomes में वैश्विक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए वर्णित है. इस विधि आणविक वजन के आधार पर अलग होने के द्वारा पीछा प्रथम आयाम में ध्यान केंद्रित समविद्युतविभव द्वारा उनके isoelectric बिंदु के अनुसार प्रोटीन की जुदाई के होते हैं,दूसरा आयाम में acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा. अलग हो प्रोटीन के दृश्य चांदी धुंधला द्वारा किया जाता है.

Introduction

जीनस Burkholderia 62 से अधिक प्रजातियों, आलों की एक विस्तृत श्रृंखला से अलग ग्राम नकारात्मक जीवों शामिल हैं, और यह दो मुख्य समूहों 1,2 में बांटा गया है. पहले क्लस्टर मानव, पशु और phytotrophic जीव भी शामिल है, और सबसे अधिक अध्ययन की वजह से उनके नैदानिक ​​महत्व के लिए इस समूह की रोगजनक प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित किया है. सबसे रोगजनक सदस्यों बी हैं pseudomallei और बी (क्रमशः melioidosis और ग्लैंडर्स कारण बनता है) mallei 3,4 और सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) और पुरानी granulomatous रोग (सीजीडी) में रोग का कारण जो अवसरवादी रोगजनकों 5 (Burkholderia cepacia जटिल, बीसीसी की 17 परिभाषित प्रजाति), 1. 30 से अधिक nonpathogenic प्रजातियों के साथ दूसरे क्लस्टर, पौधों के साथ या वातावरण के साथ जुड़े बैक्टीरिया भी शामिल है, और मेजबान 2 के लिए संभावित लाभदायक माना जाता है.

कई जटिलताओं fr उभरनेऐसी क्योंकि मामलों 6-9 से ज्यादातर में उन्मूलन के लिए कड़ी मेहनत कर रही एंटीबायोटिक दवाओं के लिए आंतरिक या अधिग्रहण प्रतिरोध के रोगियों, रोग के प्रसार और उपचार विफलता के बीच रोगज़नक़ के प्रसारण के रूप में Burkholderia जीनस के रोगजनक सदस्यों के साथ ओम जीवाणु संक्रमण. इसलिए, जीवाणु संक्रमण की स्थापना के लिए आधार का एक स्पष्ट समझ पाने के लिए इन जीवों से होने वाली बीमारी के उपचार के लिए महत्वपूर्ण है. संक्रमण की स्थापना में जानकारी हासिल करने के लिए, रोगजनन के साथ जुड़े जीवाणु घटकों पर व्यापक जांच की जरूरत है. प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग Burkholderia जीवों की प्रोटिओमिक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित अध्ययन बैक्टीरियल रोगजनन में फंसा साथ ही उनके proteome में परिवर्तन 10-16 प्रोफाइल गया है कि प्रोटीन का वर्णन किया.

उच्च सान्द्र युक्त lysis बफर में sonication और फ्रीज thawed चक्र का उपयोग प्रोटीन निष्कर्षण तरीकोंयूरिया की entration, डिटर्जेंट और ampholytes साथ संयोजन में Thiourea Burkholderia प्रोटिओमिक पढ़ाई 10-13 में लागू किया गया है. यूरिया प्रोटीन विकृतीकरण के लिए काफी कुशल है, यह इस तरह (carbamylation प्रतिक्रिया) 17 कलाकृतियों के गठन, अमीनो एसिड समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं जो अमोनियम आइसोसाइनेट, साथ जलीय घोल में एक संतुलन स्थापित कर सकते हैं. इसलिए, यह cyanate मैला ढोने वालों के रूप में कार्य जो वाहक ampholytes, शामिल हैं और 37 डिग्री सेल्सियस 17 से ऊपर तापमान से बचने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, प्रोटीन मात्रा का ठहराव के साथ lysis बफर के किसी भी रासायनिक हस्तक्षेप को रोकने के लिए, एक ही lysis बफर नमूने और मानकों में एक ही पृष्ठभूमि 10 इतनी है कि मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य तरीके में गर्मी ऊष्मायन अवधि 17,18 साथ क्षारीय buffers और डिटर्जेंट का उपयोग शामिल है, लेकिन इन स्थितियों proteome में परिवर्तन उत्पन्न हो सकता है और कुछ डिटर्जेंट जनसंपर्क के साथ संगत नहीं हैंoteomics आवेदन बाद में डिटर्जेंट हटाने कदम 17,18 शामिल किए गए हैं जब तक.

पर्याप्त निकासी और मात्रा का ठहराव के बाद, प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन की वैश्विक प्रोटीन अभिव्यक्ति इस तरह के दो आयामी (2 डी) जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. यह तकनीक पहले O'Farell 19 से वर्णित है और दूसरा आयाम में acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रथम आयाम में ध्यान केंद्रित समविद्युतविभव द्वारा उनके isoelectric बिंदु के अनुसार प्रोटीन की जुदाई, और फिर उनके आणविक वजन के हिसाब में शामिल किया गया था. इसकी वजह से संकल्प और संवेदनशीलता के लिए, इस तकनीक जटिल जैविक स्रोतों 19,20 से प्रोटीन का विश्लेषण और पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस जुदाई तकनीक बाद transcriptional संशोधनों या proteolytic प्रसंस्करण की वजह से प्रोटीन isoforms के समाधान के महान लाभ के साथ प्रोटीन केंद्रित दृष्टिकोण में वर्तमान में उपलब्ध है. मात्रात्मक परिवर्तनजेल में 20 की धुंधला के बाद इसी स्थान की तीव्रता की तुलना से पता लगाया जा सकता है. हालांकि, इस तकनीक बहुत बड़े प्रोटीन, झिल्ली प्रोटीन, बेहद बुनियादी और अम्लीय या हाइड्रोफोबिक प्रोटीन की पहचान के लिए अनुकूल है, और कुछ हद तक एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली तकनीक 20 है नहीं है. और अधिक मजबूत और उद्देश्य हैं कि नई पेप्टाइड केंद्रित दृष्टिकोण (गैर जेल आधारित) उपलब्ध हो जाते हैं और इस तरह के (ICAT) 21 टैगिंग आइसोटोप कोडित आत्मीयता से सिस्टीन लेबलिंग, और एमिनो समूह के रूप में अंतर स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तरीकों से मात्रात्मक तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation (iTRAQ) 22 के लिए आइसोटोप टैगिंग द्वारा लेबलिंग. एक एकल प्रोटिओमिक तकनीक का उपयोग अपर्याप्त जानकारी दे सकता है, इसलिए दो पूरक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग proteome में सबसे पूरी तरह से आकलन करने में परिवर्तन के लिए आवश्यक है. फिर भी, 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है और नियमित तौर पर क्वान के लिए लागू किया जा सकता हैविभिन्न जीवों में कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति titative.

यहाँ हम अनुकूलित और अनुकूलित जीई हेल्थकेयर 2 डी वैद्युतकणसंचलन सिद्धांतों से और तरीकों हैंडबुक 80-6429-60AC 2004 (गया कि Burkholderia प्रजातियों के लिए एक पूरे सेल प्रोटीन निष्कर्षण और 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रक्रियाओं का वर्णन www.amershambiosciences.com ). प्रोटीन निष्कर्षण 5 मिमी EDTA (ethylenediamine tetraacetic एसिड) और 1 मिमी PMSF (phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड युक्त) पीबीएस की उपस्थिति में ग्लास मोतियों के साथ एक मनका डिब्बा का उपयोग किया गया था. यह प्रक्रिया कम से कम गिरावट के साथ प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है और जैसा कि पहले बताया 15,23,24 के रूप में प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के लिए संशोधनीय है. 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन 24 सेमी लंबे समय से स्थिर पीएच 4-7 ढाल और प्रोटीन का उपयोग किया गया था उनके isoelectric बिंदु के अनुसार अलग हो गए थे. तो प्रोटीन उनके molec के अनुसार अलग हो गए थेएसडीएस polyacrylamide जेल से ular वजन. इसके अतिरिक्त, हम हाजिर प्रोटीन के दृश्य, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए संगत है कि एक चांदी दाग ​​विधि के लिए एक चांदी धुंधला विधि का वर्णन किया. साथ में इन प्रक्रियाओं के रोगजनन में शामिल किया जा सकता है कि Burkholderia प्रजातियों से महत्वपूर्ण प्रोटीन की पहचान की अनुमति कर सकते हैं.

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Protocol

1. संस्कृति के विकास (दिन 1 +2)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात रोटेटर पर, एक तस्वीर शीर्ष 15 मिलीलीटर ट्यूब में Luria Bertani (पौंड) शोरबा के 3 मिलीलीटर: एक स्टार्टर संस्कृति बढ़ें. एक आयुध डिपो 0.6 की 600 रातोंरात वृद्धि पतला. एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में लेग शोरबा के 100 मिलीलीटर के लिए इस कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें. , बेहतर करने के लिए लगभग, स्थिर चरण (सपा) में 16 घंटे के लिए 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते बैच संस्कृति में, संक्रमण की स्थिति और इस तरह rpoS और कोरम के रूप में स्थिर चरण संकेत कारकों के नियंत्रण में है कि बैक्टीरियल विषैलापन कारकों को विश्वास दिलाता हूं संवेदन व्यक्त कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, जल्दी सपा या मध्य या देर लघुगणक चरण में विकसित बैक्टीरिया बैक्टीरिया का अनुकूलन चरण के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. 16 घंटा 600 आयुध डिपो को मापने और यह सुनिश्चित करने के बाद संस्कृति समान परिस्थितियों में एक पहले का निर्माण विकास की अवस्था की तुलना द्वारा सपा पहुँच गया है.

2. प्रोटीन निष्कर्षण (3 दिन)

  1. ताजा 0.1 एम phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड PMSF ('चेतावनी' PMSF, उपयोग चेहरा ढाल और दस्ताने विषाक्त और संक्षारक है) है ('चेतावनी' एसीटोन एसीटोन के 1 मिलीलीटर में की .0174 छ भंग करके एसीटोन में (PMSF, 174.19 छ / mol) समाधान तैयार विषाक्त और ज्वलनशील,) चेहरा ढाल और दस्ताने का उपयोग करें.
  2. 0.1 मिलीलीटर 0.1 एम PMSF, 0.5 एम EDTA के 0.1 मिलीलीटर, और पीबीएस के 9.8 मिलीलीटर: एक पीबीएस / EDTA / PMSF समाधान अप करें. यह सपा में होना चाहिए जहां 16 घंटा संस्कृति के आयुध डिपो में लगभग है की जाँच करें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4,500 × जी पर एक Oakridge अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र संस्कृति को जीवाणु संस्कृति और स्थानांतरण की 35 मिलीलीटर ले लो
  4. बर्बादी कंटेनर के लिए सतह पर तैरनेवाला निकालें औरठंडा पीबीएस के 35 मिलीलीटर जोड़ने और गोली resuspend. अपकेंद्रित्र फिर 20 मिनट के लिए 4500 × छ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर
  5. ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें. 2 मिलीलीटर Eppendorf और 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 × छ पर microcentrifuge में उच्च पर अपकेंद्रित्र 1 मिनट बाँझ पर स्थानांतरण निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  6. पीबीएस / EDTA / PMSF समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, एक 2 मिलीलीटर गोली और स्थानांतरण ~ 0.5 मिलीलीटर कांच के मोती (presterilized) युक्त (O-अंगूठी के साथ) टोपी ट्यूब पेंच resuspend. कांच के मोती और मोती ठंड कमरे में 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें मार युक्त ट्यूब को फिर से निलंबित गोली जोड़ें. प्रत्येक पार्टी की योजना बनाई के बाद बर्फ पर नमूना डाल, यह 3x करो.
  7. Microcentrifuge में 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक बाँझ 5 एमएल polystyrene ट्यूब में डाल दिया.
  8. उपज ही ट्यूब पीबीएस / EDTA / PMSF समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने बढ़ाने के लिए फिर से कांच के मोती होते हैं. मनका मार 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब. इस 2x बर्फ वायुसेना पर नमूना डाल करोआतंकवाद की मार. अपकेंद्रित्र पर एक मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने और 2.8 कदम से सतह पर तैरनेवाला में जोड़ें. एक नए बाँझ 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब polystyrene ट्यूब से 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 0.20 माइक्रोन फिल्टर सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें.
  9. इस बिंदु पर नमूने पियर्स MicroBCA प्रोटीन निष्कर्षण किट और 200 ग्राम की aliquots का उपयोग कर, प्रोटीन मात्रा के लिए assayed किया जाना चाहिए पर जमे हुए किया जाना चाहिए -80 डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक है.

3. नमूना तैयार करना (4 दिन)

  1. 25 मिलीलीटर रिहाइड्रेशन शेयर समाधान तैयार (8 एम यूरिया, 2% CHAPS, 2% IPG बफर, नीले 0.002% bromophenol) -20 डिग्री सेल्सियस पर और 2.5 मिलीलीटर aliquots में दुकान रिहाइड्रेशन शेयर समाधान के 2.5 एमएल विभाज्य करने के लिए उपयोग करने के लिए बस से पहले 7 मिलीग्राम dithiothreitol (डीटीटी, 154.2 छ / mol) जोड़ें.
  2. प्रक्रिया कदम 3.1 में तैयार रिहाइड्रेशन शेयर समाधान के 450 μl में अंतिम मेजबान के साथ किट एक 2 डी क्लीन अप का उपयोग कर कदम 2.10 से नमूने thawed.

4. पहलेध्यान केंद्रित आयाम समविद्युतविभव (आईईएफ) (4 दिन)

इस खंड में सभी कदम Ettan IGPhor आईईएफ सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं.

  1. IPG प्रथम आयाम स्ट्रिप्स स्थापनाः पट्टी सफाई समाधान के साथ साफ पट्टी धारकों और फिर सूखे के लिए उल्टा छोड़, मिल्ली क्यू पानी से धो लें. एक जेल पट्टी धारक संख्या को प्रत्येक नमूना निरुपित.
  2. (-) अंत से दूसरा व्यापक क्षेत्र में रिहाइड्रेशन कदम से नमूना लोड. पैकेजिंग के बाहर जेल स्ट्रिप्स खींचने के लिए स्वच्छ संदंश का प्रयोग करें. जेल स्ट्रिप्स से सुरक्षात्मक परत बाहर ले जाओ. (+) को समाप्त करने के अंत (-) रेखा से जिस तरह से साथ गीला स्ट्रिप्स पाने के लिए एक धीमी, फिसलने गति में नीचे किसी न किसी पक्ष स्ट्रिप्स.
  3. Burnout को रोकने के लिए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर और जेल स्ट्रिप्स के तहत निष्फल पानी से नम सोख्ता कागज रख दिया. शुद्ध पानी और इथेनॉल के साथ दौर के बीच में चिमटी कुल्ला. सभी बुलबुले निकालें ड्राई बहिष्कार को रोकने के लिए खनिज तेल के साथ बारीकी उपरिशायी. मशीन पर जेल पट्टी धारकों लाइन.
  4. Rehyd के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा भागोराशन, 200 वी पर 1 घंटे, 500 वी में 1 घंटा, 1000 वी पर 1 घंटा, 4000 वी पर 0.5 घंटे, 8000 वी पर 12 घंटे, 300 वी और 24 घंटे इस आयोजन के समय पर बाहर ले जाया जा सकता है.
  5. आईईएफ के समाप्त होने पर IPG पट्टी भविष्य के विश्लेषण के लिए खनिज तेल के साथ लेपित सरन लपेट में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा रहा है, जब तक यह दूसरा आयाम एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करने की सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, कारण डीटीटी का उपयोग करने के लिए बिंदु streaking से बचने के क्रम में यह IPG iodoacetamide होता है कि एक बफर के साथ पहले दूसरा आयाम करने के लिए स्ट्रिप्स के एक दूसरे संतुलन कदम शामिल करने के लिए संभव है.

5. दूसरा आयाम एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (5 दिन)

इस खंड में सभी कदम Ettan DALTsix वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग कर रहे हैं.

  1. जेल ढलाईकार तंत्र को इकट्ठा करने के लिए, अच्छी तरह से सभी घटकों को साफ करने और यह सुनिश्चित करें कि जेल ढलाईकार स्तर है और बाध्यकारी ग्रे रबर सिलिकॉन जेल के साथ lubricated है. काले रगड़ डालोतल पर त्रिकोणीय डाट बेर. फिर, बारी - बारी से गिलास सामने का सामना करने की छोटी प्लेट के साथ विभाजक और गिलास प्लेट जगह है. विभाजक वापस और सामने पर कर रहे हैं. Fillers (लगभग 5 शीट) के साथ शेष अंतरिक्ष भरें ताकि शीर्ष फ्लैट है. बाहर की दुनिया में लाल टिप के साथ पर पैनल के सामने रख दिया. इस्तेमाल की हर पक्ष को मजबूत करने और नीचे शिकंजा कसने के लिए clamps.
  2. जेल तैयारी: Duracryl के 297.3 मिलीलीटर जोड़ें, Tris बफर के 147 मिलीलीटर 1.5 एम पीएच 8.8, और वैक्यूम टिप को रोकने के साथ एक फ्लास्क में मिल्ली क्यू पानी के 143.3 मिलीलीटर ('चेतावनी' Duracryl विषाक्त उपयोग चेहरा ढाल और दस्ताने है) एक हलचल पट्टी. शीर्ष पर ढक्कन लगा और 20 मिनट के लिए वैक्यूम के साथ मध्यम गति से समाधान मिश्रण. वैक्यूम समाधान गैस डे के लिए प्रयोग किया जाता है. मिल्ली क्यू पानी के 2 मिलीलीटर के लिए ए पी एस की 0.2 ग्राम: अमोनियम persulfate समाधान (ए पी एस, 218.8 छ / mol) की एक ताजा 10% है.
  3. जेल ढलाईकार को जेल मिश्रण को जोड़कर: वैक्यूम किया जाता है 10% सोडियम सल्फेट dodecyl के 6 मिलीलीटर (एसडीएस, 228.38 छ / mol) जोड़नेकुप्पी की ओर करने के लिए समाधान में अधिक बुलबुले डालने से बचने के लिए. , ए पी जोड़ें हलचल, 'n' tetramethylethylenediamine (TEMED, 116.20 छ / mol) 0.25 एमएल एन, एन, एन जोड़ ('चेतावनी' TEMED ज्वलनशील उपयोग चेहरा ढाल और दस्ताने है) और हलचल.
  4. तंत्र के पीछे डाला एक कीप के माध्यम से जेल ढलाईकार में जेल मिश्रण डालो. छोटी प्लेट के नीचे एक इंच तक डालो. जेल के ऊपर से पानी संतृप्त butanol के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और निर्जलीकरण से बचने के लिए सरन की चादर के साथ शीर्ष पर लपेट. पूरा polymerization सुनिश्चित करने के लिए 1 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें.
  5. जेल जाँच हो रही है: जेल (कुप्पी जाँच) किया जाता है, एक सिंक से जेल ढलाईकार जुदा. गर्म पानी के साथ गिलास प्लेट rinsing जबकि जेल अखंडता के लिए जाँच करें, पानी थाली में प्रवेश करने की अनुमति नहीं देते हैं. Butanol बाहर डालो और butanol से छुटकारा पाने के लिए पानी के साथ दो बार जेल की शीर्ष कुल्ला. फिर पानी के साथ शीर्ष भरें और जैल सही दूर नहीं किया जाता है, तो बैठते हैं.
  6. स्ट्रिप्स की तैयारी: से संतुलन बफर समाधान तैयारफ्रीजर (6 एम यूरिया, 75 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.8, 29.9% एसडीएस, नीले 0.002% bromophenol). यह -20 डिग्री सेल्सियस पर preprepared और 10 मिलीलीटर aliquots में संग्रहित किया जा सकता संतुलन बफर समाधान की एक 10 मिलीलीटर डीटीटी का 0.1 ग्राम भंग. एक ट्यूब दो IPG स्ट्रिप्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बफर पर नीचे पट्टी अंकित की जैल प्लेस और 30 मिनट के लिए बैठते हैं. जो है, जो अंत याद रखें.
  7. वैद्युतकणसंचलन इकाई (2 डी जुदाई तंत्र) की तैयारी: 1x वैद्युतकणसंचलन बफर (25 मिमी Tris बेस [121.1 छ / mol], 192 मिमी ग्लाइसिन [288.38 छ / mol], और 0.1% w / वी एसडीएस [288.38 के 4.5 एल जोड़ें छ / mol]) चल रहा है टैंक के लिए. इस बफर 3x अप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैद्युतकणसंचलन इकाई चालू करें. पानी ठंडा करने की मशीन में पानी के स्तर की जाँच करें और यदि यह कम है पानी के साथ भरने. 10 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए जो नामित तापमान, जाँच करने के लिए प्रेस मोड, पर मशीन चालू करें
  8. 2x चल बफर के 1 एल और बफर चलाने का 1x का 1 एल बनाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान वजन agaros के 0.25 छ: agarose सील समाधान करेंई और 1x चल बफर के 50 मिलीलीटर में भंग. 15 सेकंड के लिए प्रत्येक नाड़ी.
  9. वैद्युतकणसंचलन इकाई की स्थापना: का प्रयोग करें चिमटी प्रत्येक पट्टी बाहर ले और स्वच्छ कागज तौलिया के साथ दोनों पक्षों पर अतिरिक्त बफर दूर करने के लिए. स्ट्रिप्स मत छुओ. जेल के शीर्ष पर पानी डालो और 1x चल बफर के साथ जेल शीर्ष पंक्ति. स्वच्छ चिमटी का प्रयोग करें और जेल की ओर आप की ओर का सामना करना पड़ के साथ, लंबी प्लेट के ऊपर स्ट्रिप्स जगह है. यह चिकना करने के लिए स्ट्रिप्स के लिए 1x बफर जोड़ें. स्लाइड स्ट्रिप्स आगे नीचे प्लास्टिक स्ट्रिप्स का उपयोग करके. पट्टी और जेल के बीच में सभी बुलबुले निकालें.
  10. इसे सील करने के लिए पट्टी के ऊपर से agarose सील समाधान जोड़ें. स्ट्रिप्स के आराम के लिए दोहराएँ. जेल टैंक में ग्लास जेल पालने में जैल युक्त प्लेटें और कम रखें. बाहरी कक्ष में 1x बफर स्तर पर ऊपरी सदन डालने से पहले नामित लब्बोलुआब यह ऑन है.
  11. गिलास प्लेट के ऊपर ऊपरी बफर चैम्बर के लिए फ्रेम जगह है और यह सब वा है सुनिश्चितनीचे नीचे दबाकर Y नीचे. एक चिमनी का प्रयोग और मध्य लाइन अप करने के लिए ऊपरी सदन में 2x चल बफर जोड़ें. एक चिमनी का प्रयोग करें और यह शीर्ष लाइन तक पहुँच जाता है, जब तक बाहरी चैम्बर के लिए 1x चल रहा है बफर जोड़ें. शीर्ष पर ढक्कन प्लेस और वैद्युतकणसंचलन इकाई और पावर पैक पर बारी.
  12. , 52 वी में रातोंरात 96 मा, 5 डब्ल्यू मौजूदा शीर्ष के पास चांदी के तार पर बुलबुले के लिए देख कर रहा है, तो जांच चलाने. अग्रणी पंक्ति नीचे से 1 सेमी है जब तक जेल चला.
  13. प्रोटीन भी निर्माता के निर्देशों के अनुसार, उपकरण और अन्य कंपनियों ने इस तरह BioRad या Hoefer से अभिकर्मकों का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.

6. जेल दृश्य के लिए जैल की चांदी धुंधला दिवस (5-6)

  1. (एक प्लास्टिक की बाल्टी में 800 मिलीलीटर इथेनॉल, 200 मिलीलीटर एसिटिक एसिड, और धूआं हुड में मिल्ली क्यू पानी के 1000 मिलीलीटर) एक तय 1 समाधान तैयार करें. समाधान 6 जैल के लिए अच्छा है. बंद सभी मशीनों मुड़ें और वैद्युतकणसंचलन इकाई और पु के पूरे मध्य अनुभाग बाहर लेसिंक में यह करूँगा. इसके अलावा सिंक में सफेद स्टैंड डाल दिया. 2x चल बफर युक्त शीर्ष ट्रे बाहर खींचो.
  2. तंत्र जुदा और ठीक समाधान 1 में गिलास प्लेट से जैल हटा दें. जैल वे गिलास प्लेट से हटा रहे हैं जब कोनों को काटने से पहचाना जा सकता है, कोनों की संख्या ढलाईकार में जेल क्रम को इसी काटा.
  3. कम से कम 1 घंटा के लिए रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर के लिए एक घुमाव पर ठीक समाधान और जैल के साथ कंटेनर रखें
  4. (50% glutaraldehyde, इथेनॉल के 600 मिलीलीटर, 5 पोटेशियम tetrathionate जी (302.46 छ / mol), 136 सोडियम एसीटेट (82.03 छ / mol) के जी, और मिल्ली क्यू पानी के लिए 20 मिलीलीटर समाधान 2 ठीक करने के लिए जैल स्थानांतरण 2,000 मिलीग्राम) और 1 घंटे के लिए एक घुमाव पर जगह.
  5. जैल मिल्ली क्यू पानी में 15 मिनट प्रत्येक के लिए 4x धो लें.
  6. 30 मिनट या 48 घंटे के लिए सिल्वर नाइट्रेट समाधान (2,000 मिलीग्राम चांदी नाइट्रेट (169.87 छ / mol), formaldehyde के 500 μl, और मिल्ली क्यू पानी की 4 ग्राम) में जैल दाग.
  7. 1 के लिए जेल धो लेंमिनट मिल्ली क्यू पानी में.
  8. 5-30 मिनट के लिए (2,000 मिलीग्राम सोडियम कार्बोनेट के 60 ग्राम (105.99 छ / mol), formaldehyde के 300 μl, सोडियम thiosulfate (158.11 छ / mol) के 15 मिलीग्राम, और मिल्ली क्यू पानी) डेवलपर समाधान करने के लिए जमा होने तक जेल दाग है.
  9. 10 मिनट के लिए (2,000 मिलीलीटर Tris बेस (121.14 छ / mol), एसिटिक एसिड के 40 एमएल की 100 ग्राम, और मिल्ली क्यू पानी) स्थान पर समाधान में जैल रखो.
  10. (लंबी अवधि के भंडारण वांछित है ग्लिसरॉल के 40 एमएल या 400 मिलीलीटर, और मिल्ली क्यू पानी के 1600 मिलीलीटर) भंडारण के लिए, ग्लिसरॉल समाधान के लिए जैल हस्तांतरण 10 मिनट के लिए और फिर एक जेल ड्रायर का उपयोग कर उन्हें सूखी.
  11. जैल जैसे प्रकाश transilluminator या जेल इमेजर का उपयोग कर फोटो खिंचवाने एक स्कैनर / densitometer, के रूप में इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर धुंधला के बाद से देखे जा सकते हैं. ऐसे BioRad से PDQuest 2 डी विश्लेषण के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर तो एक नमूना में प्रोटीन से मात्रात्मक और गुणात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

7. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए जेल चांदी धुंधला

  • 50% मेथनॉल में जैल फिक्स, और 1 घंटे के लिए 5% एसिटिक एसिड.
  • रात भर में कम से कम 10 मिनट के लिए 50% मेथनॉल में धो लें.
  • 10 मिनट के लिए आसुत जल 3x में धो लें.
  • 15 मिनट के लिए 0.02% सोडियम thiosulfate (158.11 छ / mol) 2x साथ संवेदनशील बनाना.
  • 10 मिनट के लिए ठंडा आसुत जल 3x में 3X धो.
  • 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए ठंडा 1% चांदी नाइट्रेट समाधान (169.87 छ / mol) में जेल डूब
  • आसुत जल के साथ 1 मिनट के लिए धो 2x. ट्रे / बाल्टी बदलें.
  • 2% सोडियम कार्बोनेट निर्जल (105.99 छ / mol) में 0.04% formaldehyde में विकसित करने और यह काफी जल्दी पीले रंग बदल जाता है जब त्यागें, तीन बैचों है और हर 5 मिनट बदलने के लिए तैयार हो.
  • 5% एसिटिक एसिड में धो डालें तो 1% एसिटिक एसिड में स्टोर.
  • खासियत ग्रेड इथेनॉल और हवा शुष्क उपयोग करने के लिए पूर्व के साथ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों (स्पॉट कटौती बहिष्कार पाने धारण करने के लिए) कुल्ला.
  • साफ संदंश, 100% मेथनॉल के साथ रेज़र ब्लेड और सतहों.
  • इथेनॉल के साथ दस्ताने और सतहों स्प्रे.
  • एक प्रवाह हुड या स्वच्छ वायु क्षेत्र में आबकारी स्पॉट. स्पॉट भी एक स्वचालित मौके कटर का उपयोग excised किया जा सकता है.
  • बर्फ पर Eppendorf ट्यूब और जहाज में रखो या फ्रिज में रखें.
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    Representative Results

    दो अलग अलग अवसरों पर ही जीवाणु संस्कृति से निकाले प्रोटीन प्रोफाइल का तुलनात्मक विश्लेषण सफल प्रोटीन एक्सट्रेक्शन का संकेत भी इसी पैटर्न बैंडिंग दिखाया. निकाले आण्विक वजन प्रोटीन 10-150 केडीए से बताया गया. Burkholderia multivorans से पूरे सेल प्रोटीन एक्सट्रेक्शन 1 शो प्रतिनिधि Coomassie नीले रंग धुंधला जेल (बीसीसी की एक सदस्य) चित्रा लेग या खमीर / manitol (YEM) शोरबा और में उगाई चिकित्सीय आइसोलेट्स स्थिर चरण से काटा.

    2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के लिए, Burkholderia pseudomallei से कुल प्रोटीन की 200 ग्राम (चित्रा 2) का इस्तेमाल किया गया था. इस रोगज़नक़ रोग नियंत्रण और रोकथाम 25 के लिए अमेरिकी केंद्र द्वारा एक बी प्रकार जैविक युद्ध के एजेंट के रूप में पहचाना जाता है, प्रोटीन तैयारी प्रक्रियाओं जैव सुरक्षा स्तर 3 रोकथाम प्रयोगशाला में किए गए और तदनुसार मानक संचालन प्रक्रियाओं के साथ थे.प्रोटीन रिहाइड्रेशन घोल में resuspended और उनके isoelectric बिंदु (पीआई) के अनुसार अलग हो गए थे लंबे पीएच 4-7 ढाल और प्रोटीन immobilized एक 24 सेमी करने के लिए लागू किया गया. फिर स्ट्रिप्स एक एसडीएस polyacrylamide जेल और प्रोटीन पर रखा गया था उनके आणविक वजन (मेगावाट) के अनुसार अलग हो गए थे. इसके बाद जेल प्रोटीन मौके दृश्य के लिए दाग चांदी था. परिणाम अलग - अलग मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है कि 500 ​​से अधिक प्रोटीन धब्बे की बहुतायत से पता चला है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. Burkholderia multivorans की कुल प्रोटीन प्रोफाइल आइसोलेट्स. डी 2214 और डी 2094 पौंड या दो अलग अलग अवसरों में खमीर / manitol (YEM) शोरबा में उगाई आइसोलेट्स से स्थिर चरण में निकाली प्रोटीन की एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (1 और 2). प्रोटीन की 4 ग्राम वाई 12.5% ​​जेल की प्रत्येक गली में भरा और दाग रहे थेCoomassie नीले वें. लेन एम, प्रोटीन मार्कर.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. Burkholderia pseudomallei 1234B के 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण अलग. 7 दूरी की पट्टी को पीआई 4 में प्रतिनिधि चांदी से सना हुआ 2 डी जेल दिखा प्रोटीन जुदाई. स्थिर चरण में पूरे सेल प्रोटीन अर्क (200 ग्राम) एक 15% एसडीएस पृष्ठ जेल पर इस्तेमाल किया और अलग हो गए थे.

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    Discussion

    प्रोटीन की तैयारी के लिए एक विधि अच्छा reproducibility के साथ Burkholderia प्रोटीन का बहुमत निकाल सकते हैं कि वर्णित किया गया है. यह चित्र 1 में दिखाया के रूप में लेग या YEM शोरबा में उगाए वही जीवाणु संस्कृति का उपयोग अलग अलग दिनों में प्रदर्शन दो स्वतंत्र तैयारी से ही प्रोटीन प्रोफाइल प्राप्त करने के द्वारा प्रदर्शन किया है. हालांकि हम प्लेटों पर हो बैक्टीरिया के लिए इस विधि का परीक्षण नहीं किया है, निष्कर्षण तरल मीडिया में हो बैक्टीरिया के लिए कुशल था. यह विधि भी प्रोटिओमिक उपकरण का उपयोग कर आगे प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया था, हमारे समूह सफलतापूर्वक (iTRAQ) प्रोटिओमिक तकनीक 15,23,24 सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन और आइसोटोप टैगिंग का उपयोग proteome परिवर्तन का अध्ययन किया गया है. बाद के लिए, प्रोटीन iTRAQ प्रयोगों 15 के साथ PMSF के किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए पीबीएस में 0.5 एम EDTA युक्त एक बफर में निकाले गए थे.

    यह रेम के लिए महत्वपूर्ण हैप्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया और 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान, सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस या प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए, साथ ही खामियों को दूर युक्तियों का उपयोग और Nitrile दस्ताने पहनते हैं और सभी को कवर करने के लिए बर्फ बाल्टी का उपयोग ठंड की स्थिति में बाहर किया जाना चाहिए कि सन्दूक किसी भी स्पॉट की केरातिन प्रदूषण को रोकने के लिए त्वचा मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद में पहचान के लिए काट दिया. प्रोटीन एक्सट्रेक्शन प्रदर्शन करते हैं, तो यह PMSF इसलिए एसीटोन में 0.1 मिमी शेयर समाधान का उपयोग करने से पहले तुरंत किया जाना चाहिए, निर्माता के अनुसार, जलीय समाधान में एक कम आधा जीवन का समय दिया है कि विचार करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. हम अपने प्रयोगों में उन्हें परीक्षण नहीं किया है, हालांकि वैकल्पिक रूप से, अधिक घुलनशील और स्थिर, और कम विषाक्त कर रहे हैं कि अन्य सेरीन inhibitors या protease inhibitors, इस्तेमाल किया जा सकता है.

    इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया lysis बफर जलीय (साइटोसोलिक) प्रोटीन और कम घुलनशील prot दोनों को निकालने के लिए solubilization के लिए महत्वपूर्ण है जो यूरिया, शामिल नहीं हैकुछ झिल्ली प्रोटीन 17 सहित Eins,. लेकिन, (इस प्रोटोकॉल के चरण 3) ध्यान केंद्रित प्रथम आयाम समविद्युतविभव के लिए नमूना तैयार करने के दौरान, नमूने यूरिया होता है कि पुनर्जलीकरण बफर में resuspended हैं. अन्य प्रोटिओमिक तकनीक भी इसी तरह इलाज 26 शामिल है. रिहाइड्रेशन कदम के साथ पालन करने से पहले, यह दखल सामग्री या कम आणविक भार अशुद्धियों को हटाने के उच्च संकल्प के लिए महत्वपूर्ण है कि लगता है, हम परिणामों में सुधार के रूप में प्रत्येक प्रोटीन के नमूने में 2 डी क्लीन अप किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं. इस मौके पर सड़न रोकनेवाला फैशन में सही आकार में कटौती करने के लिए समस्याग्रस्त है के रूप में पहले प्रथम आयाम समविद्युतविभव ध्यान केंद्रित अलग होने के लिए नमूने लोड हो रहा है, (, सोख्ता कागज पट्टी धारकों के सही आकार के लिए तैयार स्ट्रिप्स है करने के लिए सुनिश्चित करें कि इस के 3.4 कदम के लिए प्रोटोकॉल).

    एक 2 डी एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने से पहले, यह जेल प्रतिशत एक 12 (ब्याज की उम्मीद आकार फिट बैठता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैकी .5% प्रतिशत जेल) 14-100 केडीए की रेंज में प्रोटीन को हल कर सकते हैं. दूसरा आयाम जेल वैद्युतकणसंचलन पूरा हो जाने के बाद, प्रोटीन के दृश्य Coomassie नीले या चांदी धुंधला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, बाद धुंधला सीमा का पता लगाने के साथ और अधिक संवेदनशील है 0.1 एनजी / प्रोटीन / स्पॉट के रूप में 20 के रूप में कम है. चांदी धुंधला के साथ कल्पना प्रोटीन स्पॉट मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. हालांकि, यह इस एजेंट प्रोटीन के साथ crosslinks के बाद से चांदी दाग समाधान glutaraldehyde शामिल नहीं होना चाहिए कि उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए इसे आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण 20 के साथ संगत नहीं है. वैकल्पिक रूप से, विभिन्न व्यक्त प्रोटीन का पता लगाने और यों, इस तरह के एक साथ स्वचालित सॉफ्टवेयर के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी DIGE) में दो आयामी-अंतर के रूप में एक और जेल आधारित दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण अलग फ्लोरोसेंट टैग लेबल नमूनों और एक सार्वभौमिक आंतरिक मानक जनसंपर्क के लिए उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए Cy 3, 5 और 2) रोजगारआईओआर दूसरा आयाम वैद्युतकणसंचलन काबू पाने के लिए, कुछ हद तक, 2 डी वैद्युतकणसंचलन 27 की भिन्नता और reproducibility के नुकसान. इसके अतिरिक्त, जैल प्रोटिओमिक अनुप्रयोगों के लिए बनाया गया एक organometallic दयाता कीलेट दाग है जो SyproRuby, साथ दूसरा आयाम बाद कलंकित किया जा सकता है. ऐसा लगता है कि चांदी धुंधला करने के लिए इसी तरह की संवेदनशीलता के साथ प्रोटीन स्पॉट का पता लगाने, लेकिन Coomassie नीले रंग की तुलना में अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथ कर सकते हैं. धुंधला जैल लेजर स्कैनर या transilluminator 28 के साथ फोटो खिंचवाने जा सकता है के बाद.

    अंत में, यह वीडियो एक पूरे सेल बैक्टीरियल प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया और Burkholderia प्रजातियों में proteome में वैश्विक परिवर्तन के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते हैं कि 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन विधि का वर्णन करता है.

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

    Acknowledgements

    यह काम एक (BV) के लिए ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय से छात्रवृत्ति और (डीपीएस) के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा और कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. हम प्रोटोकॉल का प्रारंभिक तैयारी के लिए जैकलिन चुंग धन्यवाद.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
    2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. (2011).
    3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
    4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
    5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
    6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
    7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
    8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
    9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
    10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
    11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
    12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
    13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
    14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
    15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
    16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
    17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
    18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
    19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
    20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
    21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
    22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
    23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
    24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
    25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
    26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
    27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
    28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

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