全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための

Immunology and Infection

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Summary

バークホルデリアメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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Abstract

細菌種の細胞内タンパク質レベルの調査は、これらの生物によって引き起こされる疾患の発症機序を理解するために重要である。ここでは、リン酸緩衝生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸及びフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下でガラスビーズを用いた機械的溶解に基づいて、 バークホルデリア種からタンパク質抽出のための手順を記述している。この方法は、異なる増殖条件のために、異なるバークホルデリア種のために使用することができ、それは、他の細菌のプロテオミクス研究に使用するのに適している可能性が高い。タンパク質抽出に続いて、二次元(2-D)ゲル電気泳動プロテオーム技術がこれらの生物のプロテオームのグローバル変化を研究するために記載されている。この方法では、分子量に基づいて分離を行い一次元で等電点電気泳動による等電点に応じてタンパク質の分離、で構成されています第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動による。分離されたタンパク質の可視化は銀染色によって実施される。

Introduction

バークホルデリア以上 62種、ニッチの広い範囲から単離されたグラム陰性菌を含み、それは、2つの主要なクラスター1,2に分割される。最初のクラスタは、ヒト、動物およびphytotrophic生物を含み、ほとんどの研究は、それらの臨床的重要性は、この群の病原性種に焦点を当てている。最も病原性のメンバーはBである。疽菌B (それぞれ類鼻疽及び鼻疽を引き起こす) 鼻疽菌 3,4および嚢胞性線維症(CF)および慢性肉芽腫症(CGD)の病気を引き起こす日和見病原体5(バークホルデリア·セパシア複合体、BCCの17定義された種)、1。 30以上の非病原性の種と第二のクラスタは、植物が、環境に関連する細菌が含まれており、ホスト2に対して潜在的に有益であると考えている。

数多くの合併症はFRをemergeこのような理由例6-9のほとんどで根絶するのは難しいことの抗生物質に固有または獲得抵抗性の患者、病気の蔓延や治療の失敗の間に病原体の伝達などのバークホルデリア病原性メンバーとOM細菌感染。そのため、細菌感染の確立のための基礎をより明確に理解を得ることは、これらの生物によって引き起こされる疾患の治療に不可欠である。感染の確立への洞察を得るために、病因に関連する細菌成分について鋭意検討が必要とされている。プロテオミクスアプローチを用いてバークホルデリア生物プロテオーム解析に焦点を当てた研究は、細菌病因に関与ならびにそれらのプロテオームの変化は10-16プロファイルされているタンパク質を記載している。

高濃を含む溶解緩衝液中で超音波処理および凍結融解サイクルを用いてタンパク質抽出法尿素のentration、洗剤および両性電解質と組み合わせた尿素は、 バークホルデリアプロテオミクス研究10-13に適用されている。尿素は、タンパク質変性のための非常に効率的であるが、それによって(カルバミル化反応)アーティファクト17を形成し、アミノ酸基と反応することができるイソシアン酸アンモニウムを用いて水溶液中で平衡を確立することができる。したがって、シアン酸捕捉剤として機能するキャリア両性電解質を含み、かつ37℃で17以上の温度を避けることをお勧めします。さらに、タンパク質の定量化と溶解緩衝液の任意の化学的干渉を防止するために、同一の溶解緩衝液は、試料および標準は、同じ背景10を有するように、標準曲線を作成するために使用することができる。他の方法は、熱の潜伏期間17,18とアルカリ性の緩衝液や洗剤の使用を含む、しかし、これらの条件は、プロテオームの変化を誘発する可能性があり、いくつかの界面活性剤は、PRと互換性がありませんoteomicsアプリケーションは、その後の界面活性剤除去工程は、17,18が含まれている場合を除きます。

適切な抽出および定量化の後、各々のタンパク質の全体的なタンパク質発現は、二次元(2-D)ゲル電気泳動のようなプロテオミクスアプローチを用いて研究することができる。この技術は、第一、第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらの分子量に応じてその後O'Farell 19で説明した第一の次元で等電点電気泳動による等電点に係るタンパク質の分離にある、とした。 、その分解能と感度に、この技術は、複雑な生物学的供給源19,20からのタンパク質の分析と検出するための強力なツールです。この分離技術は、転写後の修正またはタンパク質分解処理によって引き起こされるタンパク質のアイソフォームを解決する大きな利点をもつタンパク質中心のアプローチでは、現在提供されています。量的変化ゲル20の染色後、対応するスポットの強度を比較することによって検出することができる。しかし、この技術は、非常に大きいタンパク質、膜タンパク質、極端に塩基性および酸性または疎水性タンパク質の同定に適していない、やや面倒で時間のかかる技法20である。より堅牢かつ客観利用可能になると、このようなタグ付け同位体コード親和性(ICAT)21によるシステイン標識、及びアミノ基のような差動安定同位体標識法によって定量的比較のために使用することが可能である新規ペプチド中心のアプローチ(非ゲルベース)相対と絶対定量(のiTRAQ)22用のタグ付け同位体で標識する。シングルプロテオミクス技術の使用は、十分な情報を与えるかもしれない、したがって二つの相補的なプロテオミクスアプローチの使用は、プロテオームの中で最も完全な評価の変更が必要である。それにもかかわらず、2-Dゲル電気泳動は、広く使用され、日常的に定量するために適用することができる異なる生物においていくつかのタンパク質の発現をtitative。

ここでは、全細胞タンパク質の抽出およびGEヘルスケア2次元電気泳動原則と方法ハンドブック80から6429-60AC 2004から適応し、最適化したバークホルデリア属のための2次元ゲル電気泳動の手順を説明します( www.amershambiosciences.com )。タンパク質抽出を、5mMのEDTA(エチレンジアミン四酢酸)及び1mMのPMSF(フッ化フェニルメチル)を含有するPBSの存在下でガラスビーズをビーズビーターを用いて行った。この手順では、最小限の劣化によるタンパク質の定量化を可能にし、これまでに報告15,23,24などのプロテオミクスアプローチの修正可能です。 2-Dゲル電気泳動を24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配およびタンパク質を用いて行ったが、その等電点に従って分離した。その後、タンパク質は、それらのmolecに従って分離されたSDS-ポリアクリルアミドゲルによってウラル重さ。さらに、我々は、タンパク質スポットを視覚化するための銀染色法、および質量分析のために互換性のある銀染色法を記載した。一緒に、これらの手順は、病因に関与し得るバークホルデリア種から重要なタンパク質の同定を可能にすることができる。

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Protocol

1。培養増殖(日1 2)

  1. 一晩37℃の回転装置で、スナップトップ15ミリリットルチューブにルリア·ベルターニ(LB)ブロス3ミリリットル:スターターカルチャーを育てる。 OD 0.6の600に一晩成長を希釈します。 250mlのエルレンマイヤーフラスコ中のLBブロス100mlにこの希釈液1mlを加える。バッチ培養においては、より良好な近似のために、固定相(SP)内に16時間、250rpmで振盪しながら37℃でインキュベートし、感染条件等のrpoS、クォーラムのような固定相信号因子の制御下で、その細菌の病原性因子を確実にするために検出、発現される。あるいは、初期のSPまたは中期又は後期対数期で増殖させた細菌は、細菌の適応期についての情報を得るために使用することができる。
  2. 16時間後、OD 600を測定し、文化が同一条件下で以前に構築成長曲線と比較することによって、SPに達していることを確認してください。

2。タンパク質抽出(3日目)

  1. 新鮮な0.1Mのフッ化フェニルPMSF( '注意'のPMSFは、ユースフェイスシールドと手袋、有毒で腐食性のある)である( '注意'アセトンアセトン1ml中の0.0174グラムを溶解することにより、アセトン(PMSF、174.19グラム/モル)の溶液を調製毒性や可燃性)フェイスシールドと手袋を使用しています。
  2. 0.1ミリリットルの0.1MのPMSF、0.5M EDTAを0.1ミリリットル、およびPBSを9.8ミリリットル:PBS / EDTA / PMSFソリューションを構成する。 16時間の文化のODをチェックし、それが、SPであるべき場所程度である。
  3. 細菌培養の35ミリリットルを取り、4℃で20分間4500×gでオークリッジ遠心管と遠心分離機に文化を転送
  4. 廃棄物容器に上清を除去し、冷却されたPBSを35ミリリットルを加え、ペレットを再懸濁。 4℃で20分間4500×gで再び遠心分離
  5. 冷PBS 1mlに再懸濁上清を取り除きます。 4℃で14,000×gで微量で高い上2ミリリットルエッペンドルフ遠心1分を無菌への転送削除し、上清を捨てる。
  6. PBS / EDTA / PMSF溶液1 mLを加え2 mlのペレットを、転送が約0.5 mlのガラスビーズ(滅菌済み)を含む(Oリング付き)スクリューキャップ付試験管に懸濁する。冷室で1分間、4℃でガラスビーズとビーズのbashこれらを含むチューブに再懸濁ペレットを追加します。各BASH後に氷上でサンプルを入れて、この3回行います。
  7. 微量での1分間の14,000×gで遠心分離する。上清を除去し、滅菌5ミリリットルのポリスチレンチューブに入れて。
  8. 収率は同じチューブにPBS / EDTA / PMSF溶液1mlを加え高めるために再びガラスビーズを含んでいる。 1分間4℃でビーズBASHチューブ。この2Xは氷のAFにサンプルを入れてくださいTERの強打。遠心分離器に1分間14,000×gで遠心分離し、上清を除去し、ステップ2.8から上清に追加。ポリスチレンチューブから新しい滅菌2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに上清を1ミリリットルの注射器および0.20μmのフィルターを使用してください。
  9. この時点でサンプルが必要になるまでは200μgのピアースマイクロBCAタンパク質抽出キット、アリコートが-80℃で凍結する必要があります使用して、タンパク質の量についてアッセイされるべきである。

3。サンプル調製(4日目)

  1. 25ミリリットル補水のストック溶液を調製(8 M尿素、2%CHAPS、2%IPGバッファー、ブルー0.002%ブロモフェノール)-20℃および2.5ミリリットル分量を保存する7mgのジチオスレイトール(DTT、154.2グラム/モル)を再水和のストック溶液2.5mlアリコートに使用直前に追加します。
  2. プロセスは、ステップ3.1で作成補水原液を450μLの最後の再懸濁したキットを2次元クリーンアップ使用してステップ2.10からサンプルを解凍した。

4。最初のフォーカシング次元等電点電気泳動(IEF)(4日目)

このセクションのすべての手順がたEttan IGPhor IEFシステムを使用している。

  1. ストリップ洗浄液できれいなストリップ保有した後、ミリQ水で洗浄し、乾燥させるために上下逆さまのまま:IPG最初の次元のストリップを設定します。ゲルストリップホルダー番号に各サンプルを割り当てます。
  2. ( - )から2番目のより広い領域での再水和ステップからサンプルをロードします。パッケージの外にゲルストリップを引っ張ってきれいな鉗子を使用してください。ゲルストリップから保護層を取り出します。 (+)端から端 - ()の行は、からの道に沿って湿ったストリップを得るために、ゆっくりとスライド運動でダウン粗い面を取り除きます。
  3. バーンアウトを防ぐために、電極の上に、ゲルストリップの下に滅菌水で湿らせた吸い取り紙を置きます。精製水とエタノールとのラウンドの間に、ピンセットを洗浄します。すべての気泡を除去するドライアウトを防止するためにミネラルオイルを薄く重ねる。マシン上のゲルストリップホルダーを並べる。
  4. rehyd 20℃で12時間を実行配給、8000 Vで4000 Vで200 Vで1時間、500 Vで1時間、千Vで1時間、0.5時間、12時間は、24時間は300 Vで保持し、この時点で取り出すことができる。
  5. IEFが終了した後IPGストリップは、将来の分析のためにミネラルオイルで被覆されたサランラップで-80℃で凍結されていない限り、それは、二次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことが推奨される。代替的に、DTTによるアクセスポイントへのストリーキングを回避するために、それはIPGはヨードアセトアミドを含有する緩衝液で前に第二次元にストリップの第二の平衡工程を含むことが可能である。

5。二次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(5日目)

このセクションのすべての手順がたEttan DALTsix電気泳動装置を使用しています。

  1. ゲルキャスター装置を組み立てるために、徹底的にすべてのコンポーネントをきれいにしていることを確認したゲルキャスターレベルであり、結合灰色のゴムはシリコンゲルで潤滑されている。黒の摩擦を入れる底部の三角形のストッパーBER。その後、交互に正面を向いてガラスの短い板をセパレータとガラス板を配置します。セパレータは表裏にあることを確認してください。フィラー(約5枚)で、残りのスペースを埋めるため、トップが平坦である。外側に赤いチップを用いてフロントパネルを置く。各側面を締めと下のネジを締めクランプを使用してください。
  2. ゲルの準備:含む真空先端をフラスコに、( '注意' Duracryl有毒用フェイスシールドと手袋である)、トリス緩衝液、1.5MのpHは8.8、およびミリQ水143.3ミリリットルの147ミリリットルをDuracrylの297.3ミリリットルを追加します。攪拌棒。上部のふたを入れて、20分間の真空で、中程度の速度で溶液を混合する。真空は、溶液を脱ガスするために使用される。ミリQ水2mlに、APSの0.2グラム:過硫酸アンモニウム溶液(APS、218.8グラム/モル)の新鮮な10%​​にする。
  3. ゲルキャスターにゲル混合物を添加する:真空が完了したら、10%ドデシル硫酸ナトリウムを6ml(SDS、228.38グラム/モル)を添加フラスコの側に溶液中でより多くの気泡を入れないようにします。 、APSを追加炒め、0.25ミリリットル、N、N、Nを追加 '、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、116.20グラム/モル)('注意 'TEMEDが可燃用フェイスシールドと手袋です)と攪拌する。
  4. 装置の背面に挿入された漏斗を通してゲルキャスターにゲル混合物を注ぐ。ショートプレートの下インチまで注ぐ。ゲルの上に水飽和ブタノール1.5ミリリットルを加え、脱水症状を避けるために、サランラップでトップを包む。フル重合を確実にするために1時間を待ちます。
  5. ゲルが終了したら(フラスコを確認してください)​​、シンクによってゲルキャスターを分解:ゲルのチェック。温水でガラス板を洗浄しながら、ゲルの整合性をチェックし、水がプレートを入力することができません。ブタノールを注ぐ、ブタノールを取り除くために水で2回ゲルの上部をすすぐ。再び水でトップを満たし、ゲルはすぐに使用されていない場合は放置します。
  6. ストリップを製造する:から平衡化緩衝液を調製する冷凍庫(6 M尿素、75mMのトリス-HCl、8.8、29.9%SDS、0.002%ブロモフェノールブルー)。これは-20℃で予め調製し、10ミリリットルずつに保存することができ平衡化緩衝液10mlに0.1gのDTTを溶解する。一本のチューブは、2つのIPGストリップを使用することができる。バッファにダウンストリップ面のゲルを置き、30分間放置します。これはどちらの端を覚えておいてください。
  7. 電気泳動ユニット(2-D分離装置)を調製する:1×泳動緩衝液(25mMトリス塩基[121.1グラム/モル]、192 mMのグリシン[288.38グラム/モル]、および0.1重量/容量%SDS [288.38 4.5 Lを追加走行タンクへg /モル])。このバッファは、3回まで使用することができる。電気泳動装置の電源を入れます。水冷マシン内の水位を確認し、それが低ければ水でそれを埋める。 10℃であるべきである指定された温度をチェックするためにプレスモード、マシンの電源を入れ
  8. 2Xランニングバッファー1リットルとバッファを実行しているの1X 1リットルを加えて、4℃で保管しagarosの重量0.25グラム:アガロースシーリングソリューションを作るEおよび1Xランニングバッファー50mlに溶解する。 15秒ごとのパルス。
  9. 電気泳動装置の設定:各ストリップを取り出し、清潔な紙タオルで両側に余分なバッファを削除するためにピンセットを使用してください。ストリップに触れないでください。ゲルの上に水を捨て、1×ランニングバッファーでゲルトップを並べる。清潔なピンセットを使用し、ゲル側が手前に向けて、長いプレートの上部にストリップを配置。それを潤滑するストリップに1Xバッファーを追加します。さらに下にプラスチック製のストリップを使用して、ストリップをスライドさせます。ストリップとゲルの間にあるすべての気泡を除去。
  10. それを密封するためにストリップの上部にアガロースシーリングソリューションを追加します。ストリップの残りの部分についても同じ手順を繰り返します。ゲル槽にゲルクレードルと下にゲルを含有するガラス板を置きます。外室に1Xバッファレベルを確保するために、上部チャンバーに入れる前に指定された一番下の行にある。
  11. ガラス板の上に上部バッファーチャンバーフレームを置き、それがすべてのWAであることを確認一番下の押下により、Yダウン。漏斗を使用して、中央の行まで上室に2倍のランニングバッファーを追加します。漏斗を使用して、一番上の行に到達するまで、外室に1Xランニングバッファーを追加します。上部の蓋を置き、電気泳動装置とパワーパックをオンにします。
  12. 、52 Vで一晩96ミリアンペア、5 W.電流は上部近くの銀線上に気泡を探すことによって起こっているかどうかを確認して実行します。大手行が下から1cmになるまで、ゲルを実行します。
  13. タンパク質はまた、製造業者の説明書に従って、機器や他の企業、例えばBIORAD又はホーファーからの試薬を用いて分析することができる。

6。ゲルの可視化のためのゲルの銀染色(日5-6)

  1. (プラスチック製バケツに800ミリリットルのエタノール、200ミリリットルの酢酸、およびヒュームフード内のミリQ水1000ml)定着液1を準備します。溶液を6ゲルに適しています。すべてのマシンの電源をオフにして、電気泳動装置およびPUの全体中央部分を取り出すシンクでそれを事前にチェック!また、流しに白いスタンドを置く。ランニングバッファー2Xを含むトップトレイを引き出します。
  2. 装置を分解し、固定液1にガラス板からゲルを取り除く。ゲルは、それらがガラス板から除去されるときに角部を切断することによって同定することができる、角の数は、キャスター中のゲル順序に対応する切断。
  3. 少なくとも1時間に4℃で一晩のためにロッカー上定着液やジェルの入った容器を置きます
  4. 50%グルタルアルデヒド、600mlのエタノール、四チオン酸カリウム5gの(302.46グラム/モル)、酢酸ナトリウム(82.03グラム/モル)、およびミリQ水136 gの溶液2(20ミリリットルを固定するためにゲルを転写2000ミリリットル)、1時間ロッカー上に置きます。
  5. ゲルはミリQ水で15分間ずつ4倍洗う。
  6. 30分、または最大48時間、硝酸銀溶液(2000ミリリットルの硝酸銀(169.87グラム/モル)、ホルムアルデヒドを500μl、およびミリQ水の4グラム)でゲルを染色する。
  7. 1用の洗浄ジェル分Milli-Q水である。
  8. 5〜30分間(2,000 mlの炭酸ナトリウムを60g(105.99グラム/モル)、ホルムアルデヒド300μlを、チオ硫酸ナトリウム(158.11グラム/モル)の15 mgの、およびミリQ水)現像剤溶液に転送されるまでゲルを染色する。
  9. 10分間(2000ミリリットルにTris塩基(121.14グラム/モル)、酢酸40ミリリットルの100グラム、およびミリQ水)停止液にゲルを置く。
  10. (長期保存が所望される場合、グリセロールまたは400 mlの40ミリリットル、およびミリQ水1,600 ml)を記憶するために、グリセロール溶液にゲルを転写で10分間、次いでゲル乾燥機を使って乾燥させる。
  11. ゲルは、光トランスイルミ又はゲルイメージャーを用いて撮影されたスキャナ/濃度計などの撮像システムを用いて染色した後に可視化することができる。そのようなBIORADからPDQUEST 2-D解析などの画像解析ソフトウェアは、サンプル中のタンパク質の定量的および定性的情報を得るために使用することができる。

7。質量分析のためのゲル銀染色

  • 50%メタノール中でゲルを固定し、1時間5%酢酸。
  • 一晩に少なくとも10分間、50%メタノールで洗浄する。
  • 10分間蒸留水3Xで洗う。
  • 15分間、0.02%チオ硫酸ナトリウム(158.11グラム/モル)の2倍に増感する。
  • 10分間冷蔵蒸留水の3倍で洗って3倍。
  • 4℃で1時間、少なくとも20分間冷蔵1%硝酸銀溶液(169.87グラム/モル)でゲルを沈める
  • 蒸留水で1分間洗浄2X。トレイ/バケットを変更します。
  • 2%の炭酸ナトリウム、無水0.04%ホルムアルデヒド(105.99グラム/モル)で開発し、それは非常に迅速な黄色になる際に捨て、3つのバッチを持っており、5分毎に変更する準備ができて。
  • 1%酢酸に保管し、次いで5%酢酸で洗浄する。
  • 使用前にUSPグレードのエタノールと空気乾燥で1.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブ(スポットカットアウトを取得し保持する)をすすぐ。
  • 100%メタノールできれいに鉗子、かみそりの刃と表面。
  • エタノールで手袋の表面をスプレー。
  • 流フードやきれいな空気領域内の物品のスポット。スポットはまた、自動スポットカッターを用いて切除することができる。
  • 氷上でエッペンドルフチュー​​ブや船に入れたり、冷蔵庫に保管してください。
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    Representative Results

    2別の機会に同じ細菌培養から抽出したタンパク質プロファイルの比較解析が成功したタンパク質抽出を示す同様のパターンバンディングを示した。抽出された高分子量のタンパク質は、10〜150 kDaの範囲であった。 バークホルデリアmultivoransから全細胞タンパク質抽出の1に示す代表的なクマシーブルー染色ゲル(BCCの部材) 図1bまたは酵母/マンニトール(YEM)ブロスで成長した臨床分離株固定相から回収した。

    2-Dゲル電気泳動分析のために、 疽菌からの全タンパク質200μgの( 図2)を用いた。この病原体は、疾病管理予防のための25の米国センターによるB型生物兵器剤として認識されているので、タンパク質調製手順は、標準的な操作手順に応じてバイオセーフティレベル3の封じ込め実験室で実施した。タンパク質は、再水和溶液に再懸濁し、24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配及びタンパク質はそれらの等電点(pI)に従って分離して適用した。次いでストリップをSDS-ポリアクリルアミドゲルおよびタンパク質は、それらの分子量(MW)に従って分離した上に置いた。その後、ゲルを銀タンパク質スポットの可視化のために染色した。結果は、個々に質量分析によって同定することができる500以上のタンパク質スポットの存在を示した。

    図1
    図1。 バークホルデリアmultivoransの全タンパク質プロファイルが分離する。D-2214及びD-2094は、LBまたは2つの異なる機会における酵母/マンニトール(YEM)ブロス中で増殖させた単離物から、固定相で抽出されたタンパク質のSDS-PAGE分析(1および2)。タンパク質の4μgのは、Wiを12.5%ゲルの各レーンにロードし、染色したクマシーブルー番目。レーンM、タンパク質マーカー。

    図2
    図2。 疽菌 1234B単離物の2-Dゲル電気泳動分析。7レンジストリップのpI 4におけるタンパク質の分離を示す代表的な銀染色した2-Dゲル。固定相での全細胞タンパク質抽出物(200μgの)を使用し、15%SDS-PAGEゲル上で分離した。

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    Discussion

    タンパク質の調製のための方法は、再現性よくバークホルデリアタンパク質の大部分を抽出することができることが記載されている。これは、 図1に示すように、LB又はYEMブロス中で増殖させた同一の細菌培養物を使用して、異なる日に実施された2つの独立した調製物から同一のタンパク質プロファイルを得ることによって実証される。しかし我々はプレート上で増殖させた細菌のためにこの方法をテストしていません。抽出は、液体培地中で増殖させた細菌のための効率的であった。この方法は、プロテオミクスツールを使用して、さらなるタンパク質の特徴づけのために使用した、我々のグループは正常に(のiTRAQ)プロテオーム技術15,23,24相対的および絶対的定量のために2-Dゲル電気泳動および同位体タグを用いたプロテオームの変化を研究している。後者の場合、タンパク質は、15のiTRAQ実験でのPMSFの干渉を避けるために、PBS中の0.5 M EDTAを含む緩衝液中に抽出した。

    それは、REMにとって重要であるタンパク質抽出処理および2-Dゲル電気泳動の間、全ての工程は4℃で、またはタンパク質分解を最小にするために、並びに目封止ヒントを使用して、ニトリル手袋を着用し、すべて覆う氷のバケットを用いて低温条件下で実施されるべきであることを舟任意のスポットのケラチン汚染を防止するための皮膚は、質量分析によって、その後の識別のために切り出された。タンパク質抽出を行う場合にはPMSFは、水溶液中で短い半減期を有しており、製造業者によれば、従って、アセトン中の0.1 mMストック溶液を使用直前になされるべきであることを考慮することも重要である。我々の実験でそれらをテストしていないが、代わりに、より可溶性で安定し、かつ低毒性である他のセリンプロテアーゼ阻害剤又は阻害剤を使用することができる。

    この手順で使用される溶解緩衝液は、水性(サイトゾル)タンパク質及び難溶性のprotの両方を抽出するために可溶化するために重要である尿素を含まないいくつかの膜タンパク質17を含むアインズ、。しかし、(このプロトコールのステップ3)を集束一次元等電点電気泳動のためのサンプル調製の間、サンプルは尿素を含有する再水和緩衝液中に再懸濁する。他のプロテオミクス技術はまた、同様の処理26を含む。再水和の段階で次の前に、妨害物質または低分子量の不純物を除去することは、高解像度のために重要であると思われ、我々は結果が改善されたように、各タンパク質試料中の2-Dクリーンアップキットを使用することをお勧めします。これはその場で無菌の方法で適切なサイズにカットすることは問題があるように、以前に一次元等電点電気泳動分離のためのサンプルをロードし、(、吸い取り紙のストリップホルダーの適切なサイズの準備ストリップを持っていることを確認し、このステップ3.4用プロトコル)。

    2-D SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実行する前に、ゲル分率が12(関心対象の予想されるサイズに合うようにする必要があるの0.5パーセントの割合ゲル)が14から100 kDaの範囲のタンパク質を解決することができます。二次元ゲル電気泳動が完了した後、タンパク質の可視化は、クーマシーブルーまたは銀染色により達成することができ、後者の染色は検出限界より敏感であることが0.1ng /タンパク質/スポット20と低い。銀染色で可視化したタンパク質スポットは、質量分析によるさらなる分析に適している。しかし、この薬剤は、タンパク質と架橋するので銀染色液はグルタルアルデヒドを含むべきではないことを言及することが重要であるため、さらに質量分析20と互換性がありません。あるいは、示差的に発現するタンパク質を検出および定量化するために、そのような自動化されたソフトウェアと一緒にゲル電気泳動(2D-DIGE)において二次元の違いとして、別のゲルに基づくアプローチを使用することができる。このアプローチは、異なる蛍光タグ標識試料および内部標準ユニバーサル広報するために使用される( 例えば、Cyは3,5および2)を用いある程度、二次元電気泳動克服する2-D電気泳動27のばらつきや再現性の欠点をIOR。さらに、ゲルは、プロテオミクスアプリケーション用に設計された有機金属ルテニウムキレート染色であるSyproRuby、第2の次元後に染色することができる。それはその銀染色と同様の感度でタンパク質スポットを検出したが、クマシーブルーよりも高い感度を持つことができます。染色した後、ゲルをレーザースキャナー又はトランスイルミ28で撮影することができる。

    結論として、このビデオは、全細胞細菌タンパク質抽出手順と、 バークホルデリア種におけるプロテオームの全体的な変化の研究を可能にすることができる2-Dゲル電気泳動法を記載している。

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    Disclosures

    著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

    Acknowledgements

    この作品は、(BV)はブリティッシュコロンビア大学からの学生の身分および嚢胞性線維症カナダ、(DPS)は健康の研究のカナダの協会からの補助金によって支えられている。私たちは、プロトコルの初期準備のためにジャクリーンチョンに感謝します。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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    References

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