Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für

Immunology and Infection

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Summary

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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Abstract

Die Untersuchung der intrazellulären Proteinspiegel von Bakterienarten von Bedeutung für das Verständnis der pathogenen Mechanismen von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Proteinextraktion aus Burkholderia-Arten, basierend auf mechanischen Lysis mit Glaskügelchen in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure und Phenylmethylsulfonylfluorid in phosphatgepufferter Salzlösung. Dieses Verfahren kann für verschiedene Burkholderia-Arten verwendet werden, für die verschiedenen Wachstumsbedingungen, und es ist wahrscheinlich für die Verwendung in proteomischen Untersuchungen von anderen Bakterien. Nach Proteinextraktion wird eine zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese Proteom Technik beschrieben, um globale Veränderungen im Proteom dieser Organismen zu studieren. Dieses Verfahren besteht aus der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, gefolgt von der Trennung auf der Basis des Molekulargewichtsdurch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Visualisierung der getrennten Proteine ​​wird durch Silberfärbung durchgeführt.

Introduction

Die Gattung Burkholderia umfasst mehr als 62 Arten, Gram-negative Organismen aus einer Vielzahl von Nischen isoliert, und es ist in zwei Hauptcluster 1,2 unterteilt ist. Der erste Cluster umfasst menschliche, tierische und phytotrophic Organismen, und die meisten Studien haben sich auf die pathogenen Arten dieser Gruppe aufgrund ihrer klinischen Bedeutung konzentriert. Die meisten Mitglieder sind pathogene B. pseudomallei und B. mallei (die Melioidose Rotz und bewirkt, dass jeweils) 3,4 und opportunistische Infektionen (die 17 Arten der Burkholderia cepacia-Komplex, BCC) 5, die Krankheit bei zystischer Fibrose (CF) und chronische Granulomatose (CGD) führen ein. Der zweite Cluster mit mehr als 30 nicht-pathogenen Spezies enthält Bakterien mit Pflanzen oder mit der Umgebung verbunden und werden als potentiell nützlich, um den Host-2.

Zahlreiche Komplikationen entstehen from bakterielle Infektion mit dem pathogenen Mitgliedern der Gattung Burkholderia, wie die Übertragung des Erregers zwischen Patienten, Ausbreitung der Krankheit und Therapieversagen wegen der intrinsischen oder erworbene Resistenz gegenüber Antibiotika schwer zu machen in den meisten Fällen 6-9 beseitigen. Daher gewinnt ein besseres Verständnis der Grundlagen zur Erstellung von bakteriellen Infektion ist entscheidend für die Behandlung von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Um Einblick in die Etablierung der Infektion zu gewinnen, sind umfangreiche Untersuchungen der bakteriellen Komponenten mit Pathogenese verbunden nötig. Studien mit Schwerpunkt auf der Proteom-Analyse von Burkholderia Organismen unter Verwendung Proteom-Ansätzen beschriebenen Proteine, die in bakteriellen Pathogenese impliziert worden sind sowie Veränderungen in ihrem Proteom-Profile 10-16.

Protein-Extraktionsverfahren mit Ultraschall und gefrieraufgetaut Zyklen in Lyse-Puffer mit hoher konzentration Harnstoff, Thioharnstoff ist in Kombination mit Reinigungsmittel und Ampholyte in Burkholderia proteomische Studien 10-13 angewendet. Obwohl Harnstoff ist sehr effizient für die Denaturierung von Proteinen, kann es ein Gleichgewicht in wässriger Lösung mit Ammonium Isocyanat, die mit Amino-Gruppen reagieren können, zu schaffen, wodurch Artefakte (Carbamylierung Reaktion) 17. Daher ist es empfehlenswert, Trägerampholyten, die als Radikalfänger wirken, umfassen Cyanat und vermeiden Sie Temperaturen über 37 ° C 17. Weiterhin jede chemische Störungen Lysepuffer mit Proteinquantifizierung zu verhindern, können die gleichen Lyse-Puffer verwendet, um die Standardkurve zu erzeugen, so dass die Proben und die Standards, die gleiche Hintergrund 10 werden. Andere Methoden beinhalten die Verwendung von alkalischen Puffer-und Reinigungsmittel mit Wärme Inkubationszeiten 17,18, aber diese Bedingungen könnten Veränderungen im Proteom induzieren und einige Reinigungsmittel sind nicht kompatibel mit proteomics Anwendung, es sei denn anschließenden Reinigungsausbauschritte enthalten 17,18.

Nach ausreichender Extraktion und Quantifizierung können globale Proteinexpression jedes einzelnen Proteins unter Verwendung Proteomics wie zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese untersucht werden. Diese Technik wurde zuerst von O'Farell 19 beschrieben und besteht in der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, und dann nach ihrem Molekulargewicht durch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Aufgrund der Auflösung und Empfindlichkeit, ist diese Technik ein mächtiges Werkzeug für die Analyse und Detektion von Proteinen aus komplexen biologischen Quellen 19,20. Dieses Trennverfahren ist in Protein-zentrierte Ansätze mit dem großen Vorteil zur Lösung von Protein-Isoformen durch posttranskriptionelle Modifikationen oder proteolytische Verarbeitung verursacht verfügbar. Quantitative Veränderungenkann durch Vergleich der Intensität des entsprechenden Punkt nach Färbung des Gels 20 detektiert werden. Jedoch ist diese Technik nicht für die Ermittlung von sehr großen Proteine, Membranproteine ​​extrem basischen und sauren oder hydrophoben Proteine ​​geeignet, und ist etwas mühsam und zeitaufwendige Technik 20. Neue Peptid-zentrierten Ansätzen (nicht Gel-Basis), die robuster und Ziel sind verfügbar und können zur quantitativen Vergleich von Differential stabilen Isotopenmarkierungsmethoden wie Cystein Kennzeichnung von isotopencodierten Affinität Tagging (ICAT) 21, und Amino-Gruppe verwendet werden Kennzeichnung von Isotop-Tagging für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) 22. Die Verwendung eines einzigen Proteom Technik könnte nicht genügend Informationen erhalten, so dass die Verwendung von zwei komplementären Proteomics notwendig ist für die meisten vollständig Beurteilung von Veränderungen im Proteom. Dennoch ist 2-D-Gelelektrophorese verbreiteten und routinemäßig für Mengen angewendet werdentive Expression mehrerer Proteine ​​in verschiedenen Organismen.

Hier beschreiben wir eine Ganzzellproteinextraktion und 2-D-Gelelektrophorese Verfahren für Burkholderia Spezies, die angepasst und optimiert wurden aus den GE Healthcare 2-D-Elektrophorese-Grundlagen und Methoden-Handbuch 80-6429 60AC-2004 ( www.amershambiosciences.com ). Die Proteingewinnung wurde mit einer Kugelmühle mit Glasperlen in Gegenwart von PBS mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die Quantifizierung von Proteinen mit minimalen Abbau und änderbare für proteomische Ansätze wie bereits berichtet 15,23,24. 2-D-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung von 24 cm immobilisierte pH-Gradienten von 4-7 und Proteinen durchgeführt wurden entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt abgetrennt. Proteine ​​wurden dann entsprechend ihrer Mole getrenntdere Gewicht durch SDS-Polyacrylamid-Gel. Außerdem beschrieben wir eine Silberfärbung Verfahren zur Visualisierung von Punkt Proteinen und einer Silberfärbung Methode, die für die Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist. Zusammen können diese Verfahren die Identifizierung von wichtigen Proteinen aus Burkholderia-Arten, die in der Pathogenese beteiligt sein könnten ermöglichen.

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Protocol

1. Kultur Growth (Tage 1 +2)

  1. Wachsen Sie ein Starter-Kultur: 3 ml Luria Bertani (LB)-Brühe in einem Snap Top-15-ml-Tube, bei 37 ° C über Nacht Rotator. Verdünnte Wachstum über Nacht bis zu einer OD 600 von 0,6. 1 ml dieser Verdünnung auf 100 ml LB-Brühe in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Bei 37 ° C bei 250 rpm für 16 Stunden in die stationäre Phase (SP) Schütteln, um eine bessere Näherungswerte, in Batch-Kultur, Infektionsbedingungen und die bakterielle Virulenzfaktoren unter der Kontrolle der stationären Phase Signalfaktoren wie rpoS und Beschlussfähigkeit sichern Sensor, ausgedrückt werden. Alternativ können Bakterien in einem frühen oder mittleren SP-oder späten logarithmischen Phase gezüchtet, um Informationen auf dem bakteriellen Adaptionsphase zu gewinnen.
  2. Nach 16 h gemessen, und die OD 600 der Kultur gewährleisten SP durch Vergleich mit einer zuvor konstruierten Wachstumskurve unter identischen Bedingungen erreicht.

2. Proteinextraktion (Tag 3)

  1. Bereiten Sie frischen 0,1 M Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 174.19 g / mol)-Lösung in Aceton durch Auflösen von 0,0174 g PMSF ("VORSICHT" PMSF ist giftig und ätzend, Verwendung Masken und Handschuhen) in 1 ml Aceton ("VORSICHT" Aceton toxischen und brennbaren, verwenden Sie Schutzmasken und Handschuhen).
  2. Bilden eine PBS / EDTA / PMSF-Lösung: 0,1 ml 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA und 9,8 ml PBS. Überprüfen die OD der 16-Stunden-Kultur ist ungefähr dort, wo es sein sollte SP.
  3. Nehmen 35 ml der Bakterienkultur und Transfer auf ein Oakridge-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Kultur bei 4500 × g für 20 min bei 4 ° C
  4. Überstand entfernen, um einen Abfallbehälter und35 ml gekühlte PBS und Resuspendieren des Pellets. Zentrifugieren bei 4.500 × g für 20 min bei 4 ° C.
  5. Überstand entfernen und Resuspension in 1 ml kaltem PBS gewaschen. Übertragen, um sterile 2 ml Eppendorf-Zentrifuge 1 min auf hoch in der Mikrozentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C. Stand entfernen und entsorgen.
  6. 1 ml PBS / EDTA / PMSF-Lösung, das Pellet und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr (mit O-Ring) mit ~ 0,5 ml Glasperlen (vorsterilisierten). Fügen Sie den resuspendierten Pellets in die Röhrchen mit den Glasperlen und Perlen bash sie bei 4 ° C für 1 min im Kühlraum. Tun Sie dies 3x, indem die Probe auf Eis nach jedem bash.
  7. Zentrifugieren bei 14000 × g für 1 min in der Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und steckte es in eine sterile 5 ml Polystyrolröhrchen.
  8. Um die Ausbeute zu erhöhen 1 ml PBS / EDTA / PMSF Lösung derselben Röhre enthalten Glasperlen wieder. Wulst schlag die Röhrchen bei 4 ° C für 1 min. Tun Sie dies, indem 2x die Probe auf Eis after bash. Zentrifuge bei 14.000 xg für eine Minute auf der Zentrifuge und den Überstand und in den Überstand aus Schritt 2.8. Verwenden eine 1 ml Spritze und einer 0,20 um Filterüberstand vom Polystyrolröhrchen zu einem neuen sterilen 2 ml-Eppendorf-Röhrchen.
  9. An diesem Punkt sollten die Proben für die Proteinmenge untersucht werden, unter Verwendung des Pierce MicroBCA Protein-Extraktions-Kits und Aliquots von 200 &mgr; sollte eingefroren werden, bis -80 ° C erforderlich.

3. Probenvorbereitung (Tag 4)

  1. Bereiten Sie 25 ml Rehydrierung Stammlösung (8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 2% IPG-Puffer, 0,002% Bromphenolblau) und Speicher in 2,5 ml Aliquots bei -20 ° C. In 7 mg Dithiothreitol (DTT, 154,2 g / mol) gerade vor auf eine 2,5 ml Aliquot Rehydrierung Stammlösung zu verwenden.
  2. Prozess aufgetauten Proben aus Schritt 2.10 mit einer 2-D-Kit mit Abgleich letzten Resuspension in 450 ul Rehydrierung Stammlösung in Schritt 3.1 vorbereitet.

4. ErsteDimension-Isoelektrische Fokussierung (IEF) (Tag 4)

Alle Schritte in diesem Abschnitt werden mit dem Ettan IGPhor IEF-System.

  1. Bis die erste Dimension IPG-Streifen Set: saubere Bandhalter mit Bandreinigungslösung und dann waschen mit Milli-Q-Wasser, lassen Sie den Kopf, um zu trocknen. Weisen Sie jede Probe zu einem Gel Streifenhalter Nummer.
  2. Legen Sie die Probe aus Rehydratisierungsschritt in der zweiten größeren Bereich von der (-)-Ende. Verwenden Sie saubere Pinzette Gel-Streifen aus der Verpackung ziehen. Nehmen Sie Schutzschicht aus Gel-Streifen. Linienstreifen raue Seite nach unten in einer langsamen, gleitenden Bewegung, um die Streifen nass auf dem Weg von zu bekommen (-) Ende (+)-Ende.
  3. Setzen feuchten Löschpapier mit sterilisiertem Wasser auf der Oberseite der Elektrode und unter den Gel-Streifen, um Burnout zu verhindern. Pinzette Spülen in-zwischen den Runden mit gereinigtem Wasser und Ethanol. Entfernen Sie alle Luftblasen, überlagern dünn mit Mineralöl zu trockenen outs zu verhindern. Richten Sie die Gel-Streifenhalter auf der Maschine.
  4. Führen Sie 12 Stunden bei 20 ° C für rehydRation, 1 h bei 200 V, 1 h bei 500 V, 1 h bei 1000 V, 0,5 Stunden bei 4000 V, 12 h bei 8000 V, 24 h Halten bei 300 V und kann zu diesem Zeitpunkt eingenommen werden.
  5. Nach IEF beendet ist, wird empfohlen, die zweite Dimension SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchzuführen, es sei denn, die IPG-Streifen werden bei -80 ° C in Saran Wrap für zukünftige Analysen mit Mineralöl beschichtet froren. Alternativ, um Streifenbildung auf Grund Punkt DTT Zugriff zu vermeiden ist es möglich, einen zweiten Schritt der Äquilibrierung der IPG-Streifen vor dem zweiten Dimension mit einem Puffer, Iodacetamid enthält umfassen.

5. Zweiten Dimension SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Tag 5)

Alle Schritte in diesem Abschnitt werden mit dem Ettan DALTsix Elektrophorese-Vorrichtung.

  1. Um das Gel Zaubergerät zu montieren, gründlich reinigen und alle Komponenten sicher, dass Gel-Caster ist eben und die graue Gummi-Bindung ist mit Silikon-Gel geschmiert. Setzen Sie die schwarze reibengliedsdreieckigen Anschlag auf der Unterseite. Dann abwechselnd legen Sie das Trennzeichen und die Glasplatten mit der kürzeren Glasplatte nach vorne. Stellen Sie sicher, die Separatoren sind auf der Rückseite und der Vorderseite. Füllen Sie den verbleibenden Platz mit den Füllstoffen (ca. 5 Blatt), so dass die Oberseite ist flach. Setzen Sie die Frontplatte auf die rote Spitze auf der Außenseite. Verwenden Schellen, jede Seite festziehen und die unteren Schrauben festziehen.
  2. Vorbereitung des Gels: Fügen 297,3 ml Duracryl, (ist "Vorsicht" Duracryl giftig Verwendung Masken und Handschuhen), 147 ml Tris-Puffer 1,5 M pH 8,8 und 143,3 ml Milli-Q-Wasser in einen Kolben mit Vakuum-Spitze enthält eine Rührstab. Setzen Sie Deckel auf und mischen Lösung bei mäßiger Geschwindigkeit mit dem Vakuum für 20 min. Das Vakuum wird verwendet, um de-Gas die Lösung. Stellen Sie eine frische 10% Ammoniumpersulfat-Lösung (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS bis 2 ml Milli-Q-Wasser.
  3. Zugabe des Gemisches zu dem Gel Gel Nachlauf: Wenn Vakuum getan 6 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS, 228.38 g / mol)auf der Seite des Kolbens zu vermeiden, dass Luftblasen mehr in der Lösung. APS hinzufügen, umrühren, 0,25 ml N, N, N ', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED, 116.20 g / mol) ("VORSICHT" TEMED ist brennbar Verwendung Masken und Handschuhen) und umrühren.
  4. Gießen Gel-Mischung in ein Gel Nachlauf durch einen Trichter an der Rückseite der Vorrichtung eingesetzt ist. Gießen Sie bis zu einem Zoll unter der Kurzschild. 1,5 ml wassergesättigtes Butanol an die Spitze des Gels und wickeln Sie oben mit Frischhaltefolie um Austrocknung zu vermeiden. Warten Sie 1 Stunde voll Polymerisation zu gewährleisten.
  5. Überprüfen Sie das Gel: Wenn das Gel durchgeführt (die Flasche zu prüfen), zerlegen das Gel Caster von einem Waschbecken. Überprüfen Sie für Gel-Integrität beim Spülen der Glasplatten mit warmem Wasser, kein Wasser auf die Platte geben. Gießen Sie das Butanol und spülen Sie die Top-Gel zweimal mit Wasser ab, um Butanol zu bekommen. Füllen Sie den oben wieder mit Wasser und lassen Sie sich, wenn die Gele nicht sofort verwendet werden.
  6. Vorbereitung der Streifen: Bereiten Äquilibrierungspufferlösung aus derGefrierfach (6 M Harnstoff, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% Bromphenolblau). Dies kann bei -20 ° C vorbereiteten und in 10 ml Aliquots gelagert werden Man löst 0,1 g DTT auf eine 10 ml Äquilibrierungspuffer Lösung. Ein Rohr für zwei IPG-Streifen verwendet werden. Legen Sie die Gele des Streifens Gesicht nach unten auf den Puffer und lassen Sie sich für 30 min. Denken Sie daran, welche Seite welche ist.
  7. Herstellung des Elektrophorese-Einheit (2-D-Trennvorrichtung): In 4,5 l 1x Elektrophorese-Puffer (25 mM Tris-Base [121,1 g / mol], 192 mM Glycin [288,38 g / mol] und 0,1% w / v SDS [288,38 g / mol]) in den Tank läuft. Dieser Puffer kann bis zu 3-fach verwendet werden. Drehen Sie den Elektrophorese-Einheit auf. Wasserstand im Wasserkühlmaschine und füllen es mit Wasser, wenn sie niedrig ist. Schalten Sie das Gerät, drücken Sie Modus, um die bestimmte Temperatur, die 10 ° C sein sollten überprüfen
  8. Stellen Sie 1 l 2x Laufpuffer und 1 l 1x Laufpuffer und speichert sie bei 4 ° C Machen Agarose-Dichtungslösung: Gewicht 0,25 g agarose und in 50 ml 1x Laufpuffer auflösen. Impuls für jede 15 Sekunden.
  9. Einrichten der Elektrophorese-Einheit: mit einer Pinzette herausnehmen jeden Streifen und entfernen Sie das überschüssige Puffer auf beiden Seiten mit sauberen Papiertuch. Berühren Sie NICHT die Streifen. Gießen Sie das Wasser auf dem Gel und säumen den Gel-Top mit 1x Laufpuffer. Verwenden Sie saubere Pinzette und legen die Streifen auf der Oberseite des langen Platte, mit der Gel-Seite gegen Sie vor. In 1x Puffer zu den Streifen, um es zu schmieren. Slide-Streifen weiter nach Verwendung von Kunststoffstreifen. Entferne alle Luftblasen zwischen dem Band und dem Gel.
  10. Hinzufügen Agarose-Versiegelungslösung auf die Oberseite des Bandes, um es abzudichten. Wiederholen, für den Rest der Streifen. Legen Sie die Glasplatten mit den Gelen in Gel-und Unterschale in das Gel Tank. Sicherstellen, dass der Puffer 1x Ebene in der äußeren Kammer ist auf der unteren Zeile bezeichnet, bevor die obere Kammer auf.
  11. Legen Sie den Rahmen für die obere Pufferkammer auf der Oberseite der Glasplatten und gewährleisten, dass sie alle way nach unten, indem Sie den Boden nach unten. Verwenden Sie einen Trichter und fügen Sie die 2x Laufpuffer in die obere Kammer bis zur Mittellinie. Verwenden Sie einen Trichter und hinzufügen 1x Laufpuffer in die äußere Kammer, bis er die obere Linie erreicht. Zeigen Deckel auf und schalten Sie die Elektrophorese-Einheit und dem Netzteil.
  12. Führen Sie über Nacht bei 52 V, 96 mA, 5 W. Prüfen Sie, ob der Strom geht durch die Suche nach Blasen auf dem Silberdraht in der Nähe der Spitze. Führen Sie das Gel, bis die führende Linie ist 1 cm von der Unterseite.
  13. Proteine ​​können auch mit Hilfe von Geräten und Reagenzien von anderen Unternehmen wie BIORAD oder Hoefer analysiert werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers.

6. Silberfärbung der Gele für Gel-Visualisierung (Tag 5-6)

  1. Bereiten Sie eine Lösung Lösung 1 (800 ml Ethanol, 200 ml Essigsäure und 1000 ml Milli-Q-Wasser in Abzug in einem Plastikeimer). Lösung ist gut für 6 Gele. Schalten Sie alle Maschinen aus und nehmen Sie das gesamte Mittelteil des Elektrophorese-Einheit und puwerde es in der Wanne. Auch die weiße Stand in der Spüle. Ziehen Sie den Ober Fach mit dem 2x-Laufpuffer.
  2. Demontieren Sie das Gerät und entfernen Sie die Gele von den Glasplatten in ein fix Lösung. Gele können durch Abschneiden Ecken, wenn sie von den Glasplatten entfernt werden, identifiziert werden, die Anzahl der Ecken schneiden, die dem Gel, um in den Zaubernden.
  3. Das Gefäß mit der Fixierlösung und die Gele auf einem Schüttler für mindestens 1 h bis über Nacht bei 4 ° C.
  4. Übertragen der Gele zu Lösung 2 zu fixieren (20 ml 50% Glutaraldehyd, 600 ml Ethanol, 5 g Kaliumtetrathionat (302.46 g / mol), 136 g Natriumacetat (82.03 g / mol) und Milli-Q-Wasser auf 2.000 ml) und auf einer Wippe für 1 Stunde.
  5. Waschen Sie die Gele 4x 15 Minuten jeder in Milli-Q-Wasser.
  6. Färben die Gele in Silbernitratlösung (4 g Silbernitrat (169,87 g / mol), 500 &mgr; l Formaldehyd und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 30 min oder bis zu 48 Stunden.
  7. Waschen Gel 1min in Milli-Q-Wasser.
  8. Übertragen, um Entwicklerlösung (60 g Natriumcarbonat (105.99 g / mol), 300 ul Formaldehyd, 15 mg Natriumthiosulfat (158.11 g / mol) und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 5-30 min, bis die Gel gefärbt.
  9. Stellen die Gele in Stopplösung (100 g Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml Essigsäure und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 10 min.
  10. Für die Lagerung, übertragen Sie die Gele auf Glycerin-Lösung (40 ml Glycerin oder 400 ml, wenn langfristige Lagerung erwünscht ist, und 1.600 ml Milli-Q-Wasser) für 10 min und dann trocknen Sie sie mit einem Gel-Trockner.
  11. Gele können nach Färbung mit bildgebenden Systemen wie einem Scanner / Densitometer, fotografiert mit Licht-Transilluminator oder Gel-Imager sichtbar gemacht werden. Bildanalyse-Software wie PDQuest 2-D-Analyse von BIORAD können dann verwendet werden, um quantitative und qualitative Informationen aus Proteine ​​in einer Probe zu erhalten.

7. Gel Silberfärbung für Massenspektrometrie-Analyse

  • Beheben die Gele in 50% Methanol und 5% Essigsäure für 1 Stunde.
  • In 50% Methanol und für mindestens 10 min bis über Nacht.
  • In destilliertem Wasser 3x Waschen für 10 min.
  • Sensibilisierung mit 0,02% Natriumthiosulfat (158.11 g / mol) 2x 15 min.
  • 3x Waschen in destilliertem Wasser CHILLED 3x für 10 min.
  • Gel tauchen in gekühltes 1% Silbernitrat-Lösung (169.87 g / mol) für mindestens 20 min bis 1 h bei 4 ° C
  • Wash 2x für 1 min mit destilliertem Wasser. Ändern Fach / Eimer.
  • Entwickeln Sie in 0,04% Formaldehyd in 2% Natriumcarbonat wasserfrei (105.99 g / mol) und entsorgen, wenn es gelb wird ziemlich schnell, haben drei Chargen und bereit sein, alle 5 min.
  • In 5% Essigsäure waschen speichern dann in 1% Essigsäure.
  • Spülen Sie 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (zum Halten bekommen Stelle Ausschnitte) mit USP-Qualität Ethanol und Luft trocknen vor der Verwendung.
  • Sauberen Pinzette, Rasierklingen und Flächen mit 100% Methanol.
  • Spray Handschuhe und Oberflächen mit Ethanol.
  • Verbrauchstellen in einem Flow-Haube oder saubere Luft Bereich. Spots können auch mit Hilfe eines automatisierten Spot Cutter ausgeschnitten werden.
  • Setzen Sie sie in Eppendorf-Röhrchen und Schiff auf Eis oder im Kühlschrank aufbewahren.
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    Representative Results

    Vergleichende Analyse der Proteinprofile von der gleichen Bakterienkultur bei zwei verschiedenen Gelegenheiten extrahiert zeigten ähnliche Muster Streifenbildung, die einen erfolgreichen Protein-Extraktionen. Molekulargewicht Proteine ​​extrahiert reichten von 10 bis 150 kDa. Abbildung 1 zeigt, Vertreter Coomassie-Blau-Färbung Gel der Ganzzellproteinextraktion aus Burkholderia multivorans (Mitglied des BCC) klinische Isolate in LB oder Hefe / Mannit (YEM) Brühe und gewachsen aus der stationären Phase geerntet.

    Für 2-D-Gelelektrophorese-Analyse wurden 200 &mgr; g des Gesamtproteins aus Burkholderia pseudomallei verwendet wurde (Fig. 2). Da diese Erreger als biologischer Kampfstoff B-Typ von den US Centers for Disease Control and Prevention 25 erkannt, vorbereitende Maßnahmen Protein wurden in Bio Sicherheitsstufe 3 Contain Labor mit Standardarbeitsanweisungen durchgeführt und entsprechend.Proteine ​​wurden in Rehydratationslösung resuspendiert und auf eine 24 cm lange immobilisierten pH-Gradienten von 4-7 und die Proteine ​​wurden nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) getrennt aufgebracht. Anschließend wurden Streifen auf einem SDS-Polyacrylamidgel und Proteine ​​platziert wurden nach ihrem Molekulargewicht (MW) getrennt. Anschließend Gel wurde Silber für die Proteinspot Visualisierung gefärbt. Ergebnisse zeigten die Häufigkeit von mehr als 500 Proteinspots, die einzeln durch Massenspektrometrie identifiziert werden können.

    Figur 1
    Fig. 1 ist. Gesamtproteinprofile von Burkholderia multivorans isoliert. SDS-PAGE-Analyse von Protein an die stationäre Phase von D-2214 und D-2094-Isolate in LB oder Hefe / Manitol (YEM) Brühe in zwei verschiedenen Gelegenheiten gewachsen extrahiert (1 und 2). 4 ug Protein wurden in jeder Spur einer 12,5%-Gel geladen und gefärbt with Coomassie Blau. Lane M, Protein-Marker.

    Figur 2
    2. 2-D-Gelelektrophorese Analyse von Burkholderia pseudomallei 1234B isolieren. Vertreter silbergefärbten 2D-Gel zeigt Proteintrennung in der pI 4 bis 7-Range-Streifen. Ganzzellproteinextrakte (200 &mgr; g) in der stationären Phase wurden auf einem 15% SDS-PAGE-Gels verwendet und getrennt.

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    Discussion

    Verfahren zur Herstellung Proteinen wurde beschrieben, dass die Mehrzahl von Burkholderia Proteine ​​mit guter Reproduzierbarkeit zu extrahieren. Dies wird durch Erhalten der gleichen Proteinprofil von zwei unabhängigen Präparaten in unterschiedlichen Tagen unter Verwendung des gleichen Bakterienkultur in LB-Brühe oder YEM wie in Fig. 1 gezeigt, durchgeführt gezeigt. Extraktion war effizient für Bakterien in Flüssigmedien gewachsen, allerdings haben wir diese Methode nicht getestet für Bakterien auf Platten angewachsen. Diese Methode wurde auch für weitere Proteincharakterisierung verwendet mit Proteom-Tools, hat unsere Gruppe erfolgreich Proteom-Veränderungen untersucht unter Verwendung von 2-D-Gelelektrophorese und Isotopen-Tagging für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Proteom-Techniken 15,23,24. Bei letzterem wurden die Proteine ​​in einem Puffer, enthaltend 0,5 M EDTA in PBS, um Störungen von PMSF mit den Experimenten 15 iTRAQ vermeiden extrahiert.

    Es ist wichtig, remArche, dass während der Proteinextraktion und 2-D-Gelelektrophorese, alle Schritte sollte bei 4 ° C oder in der Kälte mit Eis Eimer, um den Proteinabbau zu minimieren, als auch eingesteckt Tipps nutzen und Nitril-Handschuhe tragen und alle decken durchgeführt werden Haut Keratin Verunreinigung jeglicher Flecken zu vermeiden schnitten zur späteren Identifizierung mittels Massenspektrometrie. Bei der Durchführung Proteinextraktionen, ist es auch wichtig zu beachten, dass die PMSF hat eine kurze Halbwertszeit in wässriger Lösung, je nach Hersteller, damit die 0,1 mM Stammlösung in Aceton sollte unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden. Alternativ können auch andere Serin-Protease-Inhibitoren oder Inhibitoren, die besser löslich und stabil und weniger toxisch sind, eingesetzt werden, obwohl wir sie nicht in unseren Experimenten getestet.

    Der Lysepuffer in diesem Verfahren verwendet wird, nicht Harnstoff, die für die Solubilisierung sowohl wässrige (cytosolischen) Proteine ​​und weniger löslich Prot-Extrakt enthalteneins, darunter auch einige Membranproteine ​​17. Aber während der Probenvorbereitung für die erste Dimension der isoelektrischen Fokussierung (Schritt 3 des Protokolls), Proben werden in Rehydrationspuffer, die Harnstoff enthält suspendiert. Andere Proteom-Techniken beinhalten auch eine ähnliche Behandlung 26. Bevor mit der folgenden Rehydratisierungsschritt, so scheint es, dass die Entfernung von störenden Materialien oder niedermolekularen Verunreinigungen ist entscheidend für hohe Auflösung, empfehlen wir, die 2-D-Sauber-up Kit in jeder Proteinproben verwenden, wie Ergebnisse verbessert. Zuvor Laden der Proben für die erste Dimension isoelektrische Fokussierung Trennung, stellen Sie sicher, bereit Streifen Löschpapier die richtige Größe der Streifenhalter haben, denn dies ist problematisch, die richtige Größe für aseptische Weise auf der Stelle abgeschnitten (3,4 für den Schritt von dieser Protokoll).

    Vor der Ausführung eines 2-D SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, ist es notwendig, sicherzustellen, dass das Gel-Prozentsatz passt die erwarteten Größen von Interesse (120,5% Prozent Gel kann Protein im Bereich von 14-100 kDa zu lösen). Nach der zweiten Dimension Gelelektrophorese abgeschlossen ist, kann die Visualisierung von Proteinen durch Coomassie-Blau oder Silberfärbung erzielt werden, die letztere Färbung ist mit empfindlicher Nachweisgrenze liegt bei nur 0,1 ng / Protein / Spot-20. Proteinspots mit Silberfärbung sichtbar sind geeignet für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie. Jedoch ist es wichtig zu erwähnen, dass Silberfärbung Lösung nicht enthalten Glutaraldehyd, da dieses Mittel mit Proteinen vernetzt, es ist daher nicht mit weiteren Massenspektrometrie-Analyse 20 kompatibel. Alternativ zu detektieren und zu quantifizieren differentiell exprimierten Proteine ​​kann ein anderes Gel-Ansatz wie Zweidimensionale Differenz-In-Gelelektrophorese (2D-DIGE) zusammen mit automatisierten Software verwendet werden. Dieser Ansatz beschäftigt unterschiedlichen fluoreszierenden Tags (z. B. Cy 3, 5 und 2), die Label-Proben und einer universellen interner Standard verwendet werden, prIOR zweite Dimension der Elektrophorese überwinden, zu einem gewissen Grad, die Nachteile der Variation und Reproduzierbarkeit der 2-D-Elektrophorese-27. Zusätzlich können Gele nach der zweiten Dimension mit SyproRuby, die eine metallorganische Rutheniumchelat Fleck für Proteom-Anwendungen ausgelegt ist gefärbt werden. Es kann Proteinspots mit ähnlich empfindlich auf diesem Silberfärbung zu erkennen, aber mit größerer Empfindlichkeit als Coomassie-Blau. Nach der Färbung Gele können mit Laserscanner oder 28 Transilluminator fotografiert werden.

    Abschließend beschreibt das Video ein Ganzzell bakterielle Protein-Extraktionsverfahren und 2-D-Gel-Elektrophorese-Methode, die die Untersuchung der globalen Veränderungen im Proteom in Burkholderia Spezies ermöglichen können.

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    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

    Acknowledgements

    Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von der University of British Columbia (BV) und Zuschüsse von Mukoviszidose Kanada und Canadian Institutes of Health Research (DPS) unterstützt. Wir danken Jacqueline Chung für die erste Erstellung von Protokollen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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    References

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