Total protein Udvinding og 2-D gelelektroforese Metoder til

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Medlemmer af Burkholderia slægten er patogener af klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåde til den samlede bakterieprotein ekstraktion, ved hjælp af mekanisk sprængning og 2-D gelelektroforese til efterfølgende proteom analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Undersøgelsen af ​​de intracellulære proteinniveauer bakteriearter er af betydning for forståelsen af ​​de patogene mekanismer af sygdomme forårsaget af disse organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåde til proteinekstraktion fra Burkholderia arter baseret på mekanisk lysis ved hjælp af glasperler i nærvær af ethylendiamin-tetraeddikesyre og phenylmethylsulfonylfluorid i phosphatbufret saltvand. Denne metode kan bruges til forskellige Burkholderia arter for forskellige vækstbetingelser, og det er sandsynligt, egnet til brug i proteom studier af andre bakterier. Efter proteinekstraktion, er en to-dimensionel (2D) gelelektroforese proteomisk beskrevne teknik til at studere globale ændringer i proteomer af disse organismer. Denne metode består i adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimension, efterfulgt af adskillelse på basis af molekylvægtaf acrylamid gel elektroforese i den anden dimension. Visualisering af separerede proteiner udføres ved sølvfarvning.

Introduction

Slægten Burkholderia omfatter mere end 62 arter, gram-negative organismer, der er isoleret fra en bred vifte af nicher, og det er opdelt i to hovedgrupper 1,2. Den første klynge omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste undersøgelser har fokuseret på de patogene arter af denne gruppe på grund af deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (der forårsager melioidosis og snive henholdsvis) 3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerede arter af Burkholderia cepacia kompleks, BCC) 5, som forårsager sygdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sygdom (CGD) 1.. Den anden klynge, med mere end 30 nonpathogenic arter inkluderer bakterier forbundet med planter eller med miljøet, og betragtes som potentielt gavnlig for værten 2..

Talrige komplikationer dukke op frabout bakteriel infektion med patogene medlemmer af Burkholderia slægten, såsom transmission af patogenet mellem patienter, spredning af sygdommen og fiasko behandling på grund af den iboende eller erhvervet resistens over for antibiotika gør hårdt for at udrydde i de fleste tilfælde 6-9. Derfor få en klarere forståelse af grundlaget for etablering af bakteriel infektion er afgørende for behandling af sygdomme forårsaget af disse organismer. For at få indblik i etableringen af ​​infektion, er der behov for omfattende undersøgelser på de bakterielle komponenter, der er forbundet med patogenese. Undersøgelser med fokus på proteom analyse af Burkholderia organismer ved hjælp af proteom tilgange beskrevet proteiner, der har været impliceret i bakteriel patogenese samt ændringer i deres proteom profiler 10-16.

Proteinekstraktion metoder ved hjælp af lydbehandling og fryse-optøede cykler i lysis buffer indeholdende høj koncentration af urinstof, har thiourinstof i kombination med rengøringsmiddel og amfolytter blevet anvendt i Burkholderia proteom studier 10-13. Selv om urinstof er ganske effektiv til proteindenaturering, kan det oprette en ligevægt i vandig opløsning med ammonium-isocyanat, der kan reagere med amino-grupper, hvorved der dannes artefakter (carbamylering reaktion) 17. Derfor anbefales det, at bl.a. Carrier ampholytter, der fungerer som cyanat skraldemanden og undgå temperaturer over 37 ° C 17. For at forebygge enhver kemisk interferens lysisbuffer med protein kvantificering samme lysisbuffer kan anvendes til at generere standardkurven, således at prøverne og standarderne har samme baggrund 10. Andre metoder indebærer brug af alkaliske buffere og rengøringsmidler med varme inkubationsperioder 17,18, men disse forhold kan fremkalde ændringer i proteom og nogle rengøringsmidler er ikke kompatible med PRoteomics ansøgning, medmindre efterfølgende trin vaskemiddel fjernelse indgår 17,18.

Efter tilstrækkelig ekstraktion og kvantificering kan den globale protein udtryk enkelte protein blive undersøgt ved hjælp af proteom tilgange såsom todimensionale (2-D) gelelektroforese. Denne teknik blev først beskrevet af O'Farell 19 og består i adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimension, og derefter i henhold til deres molekylvægt af acrylamid gel elektroforese i den anden dimension. På grund af sin opløsning og følsomhed, denne teknik er et kraftfuldt værktøj til analyse og påvisning af proteiner fra komplekse biologiske kilder 19,20. Denne adskillelse teknik er i øjeblikket tilgængelig i protein-centreret tilgange med den store fordel at løse protein isoformer forårsaget af posttranskriptionel modifikationer eller proteolytisk forarbejdning. Kvantitative ændringerkan påvises ved at sammenligne intensiteten af den tilsvarende stedet efter farvning af gelen 20. Imidlertid er denne teknik ikke egnet til identifikation af meget store proteiner, membranproteiner, yderst basiske og sure eller hydrofobe proteiner, og det er en noget besværlig og tidskrævende teknik 20. Nye peptid-centreret tilgang (ikke gel-baseret), der er mere robust og mål bliver tilgængelige og kan anvendes til kvantitativ sammenligning af differentielle mærkning med stabile isotoper metoder såsom cystein mærkning af isotop-kodede affinitet tagging (ICAT) 21, og aminogruppe mærkning af isotop tagging for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) 22. Anvendelsen af ​​en enkelt proteomisk teknik kan give tilstrækkelige oplysninger, og derfor er det nødvendigt at anvende to komplementære proteom tilgange til de fleste fuldt ud at vurdere ændringer i proteomanalyse. Ikke desto mindre er 2-D gelelektroforese udbredte og kan rutinemæssigt anvendes til mængdertive ekspression af flere proteiner i forskellige organismer.

Her beskriver vi en hel-celle protein udvinding og 2-D gel elektroforese procedurerne for Burkholderia arter, der blev tilpasset og optimeret fra GE Healthcare 2-D elektroforese Principper og metoder Håndbog 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet Ekstraktionen blev udført ved anvendelse af en perle beater med glasperler i nærvær af PBS indeholdende 5 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid). Denne procedure giver mulighed for kvantificering af proteiner med minimal nedbrydning og er amendable for proteom tilgange som tidligere rapporteret 15,23,24. 2-D gelelektroforese blev udført under anvendelse af 24 cm lange immobiliserede pH 4-7 gradient og proteiner blev adskilt i overensstemmelse med deres isoelektriske punkt. Derefter proteiner blev separeret efter deres Molecular vægt ved SDS-polyacrylamidgel. Derudover beskrev vi en sølvfarvning fremgangsmåde til visualisering af spot proteiner og en sølvfarve metode, der er kompatible til massespektrometrianalyse. Sammen disse procedurer kan føre til identifikation af vigtige proteiner fra Burkholderia arter, som kan være involveret i patogenesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Kultur Vækst (dage 1 +2)

  1. Dyrk en starterkultur: 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon i et snuptag top 15 ml rør, ved 37 ° C rotator natten over. Fortynd vækst natten over til en OD600 på 0,6. Tilsæt 1 ml af denne fortynding til 100 ml LB-bouillon i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm i 16 timer i stationær fase (SP), for bedre at tilnærmelsesvis, i batch-kultur, infektion forhold og for at sikre, at bakterielle virulensfaktorer under kontrol af stationære fase signal faktorer såsom rpoS og quorum sensing, udtrykkes. Alternativt kan bakterierne dyrket ved tidlig SP eller midt-eller sen-logaritmisk fase anvendes til at indhente oplysninger om den bakterielle tilpasning fase.
  2. Efter 16 timer måle OD600 og sikre kulturen har nået SP ved sammenligning med en tidligere fremstillet vækstkurve under identiske betingelser.

2. Protein Extraction (dag 3)

  1. Forbered frisk 0,1 M phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 174,19 g / mol) opløsning i acetone ved at opløse 0,0174 g PMSF ('ADVARSEL' PMSF er giftigt og ætsende, brug ansigt skjolde og handsker) i 1 ml acetone ('ADVARSEL' acetone er giftigt og brandfarligt, brug ansigt skjolde og handsker).
  2. Udgør en PBS / EDTA / PMSF-opløsning: 0,1 ml 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA, og 9,8 ml PBS. Kontroller OD af den 16 timers kultur er ca hvor det skal være i SP.
  3. Tag 35 ml bakteriekulturen, og overførsel til en Oakridge centrifugerør og centrifugeres kulturen ved 4500 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
  4. Fjern supernatanten til en affaldsbeholder ogtilsættes 35 ml afkølet PBS, og pellet resuspenderes. Der centrifugeres igen ved 4500 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml kold PBS. Overførsel til sterile 2 ml Eppendorf og centrifugeres i 1 min på højt i mikrocentrifuge ved 14.000 x g ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten.
  6. Tilsæt 1 ml PBS / EDTA / PMSF løsning, pellet resuspenderes og overføres til en 2 ml rør med skruelåg (med o-ring), der indeholder ~ 0,5 ml glasperler (præsteriliserede). Tilsæt resuspenderede pellet til røret indeholdende glasperler og perle bash dem ved 4 ° C i 1 min i kølerummet. Gør dette 3x, sætte prøven på is efter hver bash.
  7. Centrifuger ved 14.000 x g i 1 min i mikrocentrifuge. Fjern supernatanten og sætte det i en steril 5 ml polystyren rør.
  8. At øge udbyttet tilsættes 1 ml PBS / EDTA / PMSF løsning på samme rør indeholder glasperler igen. Bead bash røret ved 4 ° C i 1 min. Må denne 2x sætte prøven på is AFter bash. Centrifuger ved 14.000 xg i et minut på centrifugen og supernatanten fjernes, og føje til supernatant fra trin 2.8. Brug en 1 ml sprøjte og et 0,20 um filter supernatanten fra polystyrenrør til et nyt sterilt 2 ml Eppendorf-rør.
  9. På dette tidspunkt bør analyseres prøverne for protein mængde, ved hjælp af Pierce MicroBCA proteinekstraktion kit og portioner af 200 mg bør fryses ved -80 ° C, indtil de skal.

3. Prøveforberedelse (dag 4)

  1. Forbered 25 ml rehydrering stamopløsning (8 M urinstof, 2% CHAPS, 2% IPG buffer, 0,002% bromphenolblåt) og opbevares i 2,5 ml alikvoter ved -20 ° C. Tilføj 7 mg dithiothreitol (DTT, 154,2 g / mol) lige før anvendelse til en 2,5 ml alikvot af rehydrering stamopløsning.
  2. Proces optøede prøver fra trin 2.10 ved hjælp af en 2-D Clean up kit med den endelige resuspension i 450 ul rehydrering stamopløsning fremstillet i trin 3.1.

4.. Første-Dimension Isoelektrisk fokusering (IEF) (dag 4)

Alle trin i dette afsnit bruger Ettan IGPhor IEF System.

  1. Opsætning af IPG første dimension strips: rene stribe holdere med strimmel rengøring løsning og derefter vaske med Milli-Q vand, lad hovedet for at tørre. Hver prøve til en gel strimmel holder nummer.
  2. Load prøven fra rehydratiseringstrinnet i den anden bredere område fra (-) ende. Brug rene pincet til at trække gelstrimler ud af emballagen. Tag beskyttende lag fra gelstrimlerne. Linje strimler ru side nedad i en langsom, glidende bevægelse for at få strimlerne våde undervejs fra (-) ende til (+) ende.
  3. Put fugtigt trækpapir med steriliseret vand på toppen af ​​elektrode og under de gelstrimler at forebygge udbrændthed. Skyl pincet i-mellem runderne med renset vand og ethanol. Fjern alle boblerne, overlay tyndt med mineralsk olie for at forhindre tørre outs. Line gelstrimlen holdere på maskinen.
  4. Kør i 12 timer ved 20 ° C i rehydration, 1 time ved 200 V, 1 time ved 500 V, 1 time ved 1000 V, 0,5 timer ved 4000 V, 12 timer ved 8000 V, 24 timers hold ved 300 V og kan tages ud på dette tidspunkt.
  5. Efter IEF er færdig, anbefales det at udføre den anden dimension SDS-polyacrylamidgelelektroforese, medmindre IPG strimlen bliver nedfrosset ved -80 ° C i Saran Wrap belagt med mineralolie for fremtidig analyse. Alternativt, for at undgå punkt striber på grund af DTT adgang er det muligt at indbefatte en anden ækvilibreringstrinet af IPG strips før den anden dimension med en buffer, der indeholder iodacetamid.

5.. Anden dimension SDS-polyacrylamidgelelektroforese (dag 5)

Alle trin i dette afsnit bruger Ettan DALTsix elektroforese apparat.

  1. For at samle gel caster apparatet, grundigt rene alle komponenter og sikre, at gel caster er plan og den grå gummi binding er smurt med silicium gel. Sæt den sorte rubber trekantede prop på bunden. Derefter skiftevis placere separatoren og glaspladerne med kortere plade af glas mod front. Sørg for, at de separatorer er på bagsiden og fronten. Fyld den resterende plads med fyldstoffer (ca. 5 ark) så toppen er flad. Sæt frontpanelet på den røde spids på ydersiden. Brug klemmer til at stramme hver side og spænd de nederste skruer.
  2. Klargøring af gel: Tilføj 297,3 ml Duracryl, ('ADVARSEL' Duracryl er giftigt brug ansigt skjolde og handsker), 147 ml Tris buffer 1,5 M pH 8,8, og 143,3 ml Milli-Q vand i en kolbe med vakuum spids, der indeholder en omrørerstav. Sæt låg på toppen og bland løsning ved moderat hastighed med vakuum på 20 min. Undertrykket anvendes til at afgasse opløsningen. Lav en frisk 10% af ammoniumpersulfatopløsning (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS til 2 ml Milli-Q vand.
  3. Tilføjelse gelblandingen til gelen hjul: Når vakuum er gjort Tilsæt 6 ml 10% natriumdodecylsulfat (SDS, 228,38 g / mol)på siden af ​​kolben for at undgå at sætte flere bobler i opløsningen. Tilføj APS, omrøres, tilsættes 0,25 ml N, N, N ', N'-(TEMED, 116,20 g / mol) ("PAS" TEMED er brændbart brug ansigt skjolde og handsker), og rør.
  4. Hæld gelen blandingen i gel hjul gennem en tragt sættes på bagsiden af ​​apparatet. Hæld op til en inch under den korte plade. Tilføj 1,5 ml vandmættet butanol til toppen af ​​gelen og wrap top med Saran wrap at undgå dehydrering. Vent i 1 time for at sikre fuld polymerisation.
  5. Kontrol af gel: Når gelen er færdig (tjek kolben), adskille gelen caster ved en vask. Check for gel integritet, samtidig med at skylle glaspladerne med varmt vand, ikke tillader vand at komme ind i pladen. Hæld butanol og skyl toppen af ​​gelen to gange med vand for at slippe af butanol. Fyld toppen med vand igen og lad sidde, hvis geler ikke anvendes med det samme.
  6. Forberedelse strimlerne: Forbered ækvilibreringspuffer opløsning frafryser (6 M urinstof, 75 mM Tris-HCI pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% bromphenolblåt). Dette kan være preprepared og opbevaret i 10 ml portioner ved -20 ° C. 0,1 g DTT opløses til en 10 ml ækvilibreringspuffer løsning. Et rør kan anvendes til to IPG strimler. Placer geler af strimlen nedad på buffer og lad det sidde i 30 minutter. Husk, hvilken ende er der.
  7. Klargøring af Elektroforese enhed (2-D adskillelse apparater): Add 4.5 L 1x elektroforese buffer (25 mM Tris-base [121,1 g / mol], 192 mM glycin [288,38 g / mol] og 0,1% vægt / vol SDS [288,38 g / mol]) til drift tank. Denne buffer kan anvendes i op til 3x. Tænd for elektroforese enheden. Kontrollér vandstanden i vand-kølemaskine og fylde det op med vand, hvis den er lav. Tænd for maskinen, skal du trykke på mode for at kontrollere den angivne temperatur, som bør være 10 ° C.
  8. Gør 1 L 2x løbebuffer og 1 l 1x køre buffer og opbevares ved 4 ° C. Make agarose-forsegling løsning: vægt 0,25 g agarose og opløses i 50 ml 1x løbebuffer. Pulse i 15 sekunder hver.
  9. Opsætning af elektroforese enhed: Brug en pincet til at tage ud hver strimmel og fjerne den overskydende buffer på begge sider med ren køkkenrulle. IKKE røre ved de strips. Hæld vand på toppen af ​​gelen og linje gel top med 1x løbebuffer. Brug rent pincet og placere strimlerne oven på den lange plade, med gel vendende mod dig. Tilføj 1x buffer til strimlerne for at smøre det. Slide strips længere ned ved hjælp af tape. Fjern alle bobler i mellem striben og gelen.
  10. Tilføj agarose forsegling opløsning til toppen af ​​strimlen til at forsegle den. Gentag for resten af ​​strimlerne. Placer glaspladerne indeholder geléer i gel vugge og lavere ind i gelen tank. Sørg for, 1x buffer niveau i det ydre kammer er på den udpegede bundlinjen, før du sætter det øverste kammer på.
  11. Placer rammen for øverste buffer kammer oven på glaspladerne og sikre, at det er alle de way ned ved at trykke bunden ned. Anvend en tragt og tilføje 2x løbende buffer i det øvre kammer til den midterste linje. Anvend en tragt, og tilføj 1x rindende puffer til det ydre kammer, indtil den når den øverste linje. Placer låget på toppen og tænd for elektroforese enhed og power pack.
  12. Kør natten over ved 52 V, 96 mA, 5 W. Tjek om strømmen går ved at kigge efter bobler på sølvtråd nær toppen. Kør gelen, indtil den førende linje er 1 cm fra bunden.
  13. Proteiner kan også analyseres ved hjælp af udstyr og reagenser fra andre selskaber som Biorad eller Hoefer, i henhold til producentens anvisninger.

6.. Sølvfarvning af gelerne til Gel Visualisering (dag 5-6)

  1. Forbered en fix løsning 1 (800 ml ethanol, 200 ml eddikesyre, og 1.000 ml Milli-Q vand i stinkskab i en plastik spand). Løsning er god for 6 geler. Vend alle de maskiner ud og tage ud i hele midterste del af elektroforeseenhedens pull det i vasken. Også sætte den hvide stå i vasken. Træk den øverste bakke, der indeholder 2x kører buffer.
  2. Skil apparatet og fjern geler fra glaspladerne ind fix løsning 1. Geler kan identificeres ved at skære hjørner, når de er fjernet fra glaspladerne, antallet af hjørner skåret svarende til gelen orden i hjulet.
  3. Placer beholderen med fix løsning og geler på en rocker i mindst 1 time til natten over ved 4 ° C.
  4. Overfør gelerne at fastsætte Løsning 2 (20 ml 50% glutaraldehyd, 600 ml ethanol, 5 g kalium tetrathionat (302,46 g / mol), 136 g natriumacetat (82,03 g / mol) og Milli-Q-vand til 2.000 ml) og sted på en rocker i 1 time.
  5. Vask geler 4x i 15 min hver i Milli-Q vand.
  6. Plette geler sølvnitratopløsning (4 g sølvnitrat (169,87 g / mol), 500 pi formaldehyd og Milli-Q-vand til 2.000 ml) i 30 minutter eller op til 48 timer.
  7. Vask gel til 1min i Milli-Q-vand.
  8. Overførsel til udvikleren Solution (60 g natriumcarbonat (105,99 g / mol), 300 pi formaldehyd, 15 mg natriumthiosulfat (158,11 g / mol) og Milli-Q-vand til 2.000 ml) i 5-30 minutter, indtil gel er plettet.
  9. Sæt geler Stop Solution (100 g Tris-base (121,14 g / mol), 40 ml eddikesyre og Milli-Q-vand til 2.000 ml) i 10 min.
  10. Til opbevaring overføres gelerne til Glycerol Solution (40 ml glycerol eller 400 ml, hvis der ønskes langtidsopbevaring, og 1.600 ml Milli-Q-vand) i 10 minutter og derefter tørre dem ved hjælp af en gel tørretumbler.
  11. Gels kan visualiseres efter farvning bruge billedbehandling systemer såsom en scanner / densitometer, fotograferet ved hjælp af lys transilluminator eller Gel imager. Kan derefter anvendes Image Analysis software som PDQuest 2-D-analyse fra BIORAD at opnå kvantitativ og kvalitativ information fra proteiner i en prøve.

7.. Gel Silver Staining for massespektrometri Analyse

  • Lave gelerne i 50% methanol og 5% eddikesyre i 1 time.
  • Vask i 50% methanol i mindst 10 min til natten over.
  • Vask i destilleret vand 3x 10 min.
  • Sense med 0,02% natriumthiosulfat (158,11 g / mol) 2x 15 min.
  • Wash 3x i afkølet destilleret vand 3x 10 min.
  • Nedsænkes gelen i afkølet 1% sølvnitratopløsning (169,87 g / mol) i mindst 20 min til 1 time ved 4 ° C
  • Wash 2x i 1 min med destilleret vand. Skift bakke / spand.
  • Udvikle i 0,04% formaldehyd i 2% natriumkarbonat vandfri (105,99 g / mol) og kassér, når det bliver gult ganske hurtig, har tre partier og være klar til at ændre hver 5 min.
  • Vask i 5% eddikesyre og derefter gemme i 1% eddikesyre.
  • Skyl 1,5 ml Eppendorf-rør (til at holde få spot udskæringer) med USP kvalitet ethanol og lufttørre inden brug.
  • Rene pincet, barberblade og overflader med 100% methanol.
  • Spray handsker og overflader med ethanol.
  • Forbrugsafgifter pletter i et flow hætte eller ren luft område. Steder kan også udskæres under anvendelse af en automatiseret stedet cutter.
  • Sæt dem i Eppendorf rør og skib på is eller holde køleskabet.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Komparativ analyse af protein-profiler udvundet fra den samme bakteriekultur ved to forskellige lejligheder viste lignende mønstre banding indikerer vellykket protein ekstraktioner. Proteiner med molekylvægt ekstraheret varierede fra 10 til 150 kDa. Figur 1 viser repræsentative Coomassie blåfarvning gel af helcelle-protein udtræk fra Burkholderia multivorans (et medlem af BCC) kliniske isolater dyrket i LB eller gær / mannitol (YEM) bouillon og høstet fra stationær fase.

    For 2-D gelelektroforese analyse blev 200 ug af total proteiner fra Burkholderia pseudomallei anvendes (figur 2). Da dette patogen er anerkendt som en B-typen biologisk krigsførelse agent af den amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse 25 blev protein forberedelsesprocedurer udført i Bio Safety Level 3-indeslutning laboratorium og i overensstemmelse hermed med standardprocedurer.Proteiner blev resuspenderet i rehydreringsopløsning og påføres på en 24 cm lang immobiliserede pH 4-7 gradient og proteiner blev adskilt i overensstemmelse med deres isoelektriske punkt (pI). Derefter strimler blev anbragt på en SDS-polyacrylamidgel og proteinerne blev adskilt i henhold til deres molekylvægt (MW). Efterfølgende blev gelen farvet med sølv for proteinet stedet visualisering. Resultaterne viste overflod af mere end 500 protein spots, der kan identificeres individuelt ved massespektrometri.

    Figur 1
    Figur 1. Total protein profiler af Burkholderia multivorans isolater. SDS-PAGE-analyse af protein ekstraheret ved den stationære fase fra D-2214 og D-2094-isolater dyrket i LB eller gær / mannitol (YEM) bouillon i to forskellige lejligheder (1 og 2). 4 ug protein blev lagt i hver bane af en 12,5% gel og farves with Coomassie blue. Lane M, proteinmarkør.

    Figur 2
    Figur 2. 2-D gelelektroforese analyse af Burkholderia pseudomallei 1234B isolere. Repræsentant sølv-farvet 2-D gel viser protein separation i pI 4 til 7-range strimmel. Helcelle-proteinekstrakter (200 ug) på den stationære fase blev anvendt, og separeret på en 15% SDS-PAGE-gel.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    En fremgangsmåde til fremstilling proteiner er blevet beskrevet, der kan udtrække størstedelen af Burkholderia proteiner med god reproducerbarhed. Dette er påvist ved at opnå den samme protein profil fra to uafhængige præparater udføres i forskellige dage under anvendelse af samme bakterie-kultur dyrket i LB eller YEM bouillon, som vist i figur 1. Udvinding var effektiv for bakterier dyrket i flydende medier, men vi har testet denne metode for bakterier dyrket på plader. Denne metode blev også anvendt til yderligere protein karakterisering ved hjælp af proteom værktøjer vores gruppe har med succes undersøgt proteommønstrene ændringer ved hjælp af 2-D gelelektroforese og isotop tagging for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) proteom teknikker 15,23,24. For sidstnævnte blev proteinerne ekstraheret i en buffer indeholdende 0,5 M EDTA i PBS for at undgå enhver forstyrrelse af PMSF med iTRAQ eksperimenterne 15.

    Det er vigtigt at remArken, at der under protein udpakningen og 2-D gelelektroforese, bør alle trin udføres ved 4 ° C eller under kolde forhold ved hjælp af is spande til at minimere protein nedbrydning, samt at bruge tilsluttet tips og slid nitrilhandsker og dække alle huden for at forhindre keratin forurening af nogen pletter skåret ud for efterfølgende identifikation af massespektrometri. Ved udførelse af protein ekstraktioner, er det også vigtigt at overveje, at PMSF har en kort halveringstid i vandige opløsninger, ifølge fabrikanten, derfor 0,1 mM stamopløsning i acetone skal ske umiddelbart før brug. Alternativt kan der anvendes andre serin-hæmmere eller protease-inhibitorer, som er mere opløseligt og stabilt og mindre toksisk, selvom vi ikke har testet dem i vores eksperimenter.

    Den lysisbuffer der anvendes i denne fremgangsmåde ikke indeholder urinstof, hvilket er vigtigt for solubiliseringen at udvinde både vandige (cytosol) proteiner og mindre opløselig proteins, herunder nogle membranproteiner 17. Men i løbet af prøveforberedelse for første dimension isoelektrisk fokusering (trin 3 i denne protokol), der prøver resuspenderes i rehydrering buffer, der indeholder urea. Andre proteom teknikker indebærer også lignende behandling 26. Før du følger med rehydratiseringstrinnet, ser det ud til, at fjernelse af forstyrrende materialer eller lavmolekylære urenheder er afgørende for høj opløsning, anbefaler vi at bruge 2-D Clean-up Kit i hvert protein prøver som resultat forbedret. Tidligere indlæsning prøverne for første dimension isoelektrisk fokusering adskillelse, så sørg for at have forberedt strimler af trækpapir den rigtige størrelse af Strip indehavere, da dette er problematisk at skære den rigtige størrelse i aseptisk mode på stedet (for trin 3.4 protokol).

    Før kører en 2-D SDS-polyacrylamidgelelektroforese, er det nødvendigt at sikre, at den procentvise gel passer de forventede størrelser af interesse (en 120,5% procent gel kan løse protein i intervallet fra 14 til 100 kDa). Efter anden dimension gelelektroforese er afsluttet, kan visualisering af proteiner opnås ved Coomassie blå eller sølvfarvning, sidstnævnte farvning er mere følsom med detektionsgrænsen er så lav som 0,1 ng / protein / spot 20. Protein pletter visualiseret med sølvfarvning er egnede til yderligere analyse ved hjælp af massespektrometri. Men det er vigtigt at nævne, at sølv plet løsning ikke bør indeholde glutaraldehyd, da dette middel krydsbinder med proteiner, og det er derfor ikke foreneligt med yderligere massespektrometrianalyse 20. Alternativt, for at opdage og kvantificere differentielt udtrykte proteiner, der kan bruges en anden gel-baserede tilgang som todimensionalt-forskel i Gelelektroforese (2D-DIGE) sammen med automatiseret software. Denne tilgang beskæftiger forskellige fluorescerende tags (f.eks Cy 3, 5 og 2), der anvendes til at mærke prøver og en universel intern standard PRior til anden dimension elektroforese overvindelse, til en vis grad ulemperne ved variation og reproducerbarheden af 2-D-elektroforese 27. Derudover kan gelerne farves efter den anden dimension SyproRuby, som er en organometallisk ruthenium-chelat plet designet til proteom applikationer. Den kan registrere proteinpletter med lignende følsomhed til sølvfarvning, men med større følsomhed end Coomassie blå. Efter farvning geler kan blive fotograferet med laserscanner eller transilluminator 28.

    Afslutningsvis denne video beskriver en helcelle-bakterielt protein ekstraktionsprocedure og 2-D gelelektroforese metode, der kan tillade undersøgelse af globale ændringer i proteomet i Burkholderia arter.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgements

    Dette arbejde blev støttet af en studentship fra The University of British Columbia (BV) og tilskud fra cystisk fibrose Canada og canadiske Institutes of Health Research (til DPS). Vi takker Jacqueline Chung til den indledende forberedelse af protokoller.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
    2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. (2011).
    3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
    4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
    5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
    6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
    7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
    8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
    9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
    10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
    11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
    12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
    13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
    14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
    15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
    16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
    17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
    18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
    19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
    20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
    21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
    22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
    23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
    24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
    25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
    26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
    27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
    28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics