Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per

Immunology and Infection

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Summary

I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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Abstract

L'indagine dei livelli di proteine ​​intracellulari di specie batteriche è importante per comprendere i meccanismi patogenetici delle malattie causate da questi organismi. Qui si descrive un procedimento per l'estrazione di proteine ​​da specie Burkholderia basato su lisi meccanica utilizzando perle di vetro in presenza di acido etilendiamminotetraacetico e fluoruro phenylmethylsulfonyl in tampone fosfato salino. Questo metodo può essere utilizzato per diverse specie di Burkholderia, per diverse condizioni di crescita, ed è probabile adatto per l'uso in studi di proteomica di altri batteri. Dopo l'estrazione di proteine, una bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel tecnica proteomica è descritta per studiare i cambiamenti globali nei proteoma di questi organismi. Questo metodo consiste nella separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, seguita da separazione sulla base del peso molecolaremediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Visualizzazione di proteine ​​separate avviene tramite colorazione argentica.

Introduction

Il Burkholderia genere comprende più di 62 specie, microrganismi Gram-negativi isolati da una vasta gamma di nicchie, ed è diviso in due gruppi principali 1,2. Il primo cluster comprende umana, animale e gli organismi phytotrophic, e la maggior parte degli studi si sono concentrati sulle specie patogene di questo gruppo a causa della loro importanza clinica. I membri più patogeni sono B. pseudomallei e B. mallei (che provoca rispettivamente melioidosi e morva) 3,4 e patogeni opportunisti (le 17 specie definite del complesso Burkholderia cepacia, BCC) 5, che causano la malattia della fibrosi cistica (CF) e malattia granulomatosa cronica (CGD) 1. Il secondo gruppo, con più di 30 specie patogene, comprende batteri associati con le piante o con l'ambiente, e sono considerati potenzialmente benefico per l'host 2.

Numerose complicazioni emergono frinfezione batterica om con i membri patogeni del genere Burkholderia, come la trasmissione del patogeno tra pazienti, diffusione della malattia e fallimento del trattamento a causa della resistenza intrinseca o acquisita agli antibiotici rendendo difficile sradicare nella maggior parte dei casi 6-9. Pertanto, ottenendo una migliore comprensione della base per l'istituzione di infezione batterica è fondamentale per il trattamento di malattie causate da questi organismi. Al fine di ottenere una visione nello stabilimento di infezione, sono necessarie approfondite indagini sui componenti batterici associati alla patogenesi. Studi incentrati sull'analisi proteomica di organismi Burkholderia utilizzando approcci di proteomica descritti proteine ​​che sono stati implicati nella patogenesi batterica così come i cambiamenti nel loro proteoma PROFILI 10-16.

Metodi di estrazione di proteine ​​mediante sonicazione e cicli di gelo-scongelati in tampone di lisi contenente alta concentration di urea, tiourea in combinazione con detergente e anfoliti è stato applicato in Burkholderia studi di proteomica 10-13. Anche se l'urea è molto efficace per denaturazione proteica, può stabilire un equilibrio in soluzione acquosa con isocianato di ammonio, che può reagire con gruppi ammino acidi, formando così artefatti (reazione carbamilazione) 17. Pertanto, si raccomanda di includere anfoliti portanti, che agiscono come spazzini cianato ed evitare temperature superiori a 37 ° C 17. Inoltre, per evitare qualsiasi interferenza chimica di tampone di lisi con proteine ​​quantificazione, lo stesso tampone di lisi può essere utilizzato per generare la curva standard in modo che i campioni e gli standard hanno lo stesso sfondo 10. Altre metodologie prevedono l'utilizzo di tamponi alcalini e detergenti con calore periodi di incubazione 17,18, ma tali condizioni potrebbero inducono cambiamenti nel proteoma e alcuni detersivi non sono compatibili con proteomics domanda, salvo successive fasi di rimozione del detersivo sono inclusi 17,18.

Dopo estrazione e quantificazione adeguata, espressione proteica globale di ogni singola proteina può essere studiata utilizzando approcci di proteomica come bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel. Questa tecnica è stata descritta da O'Farell 19 e consiste nella separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, e poi in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Grazie alla sua risoluzione e sensibilità, questa tecnica è un potente strumento per l'analisi e la rilevazione di proteine ​​da fonti biologiche complesse 19,20. Questa tecnica di separazione è attualmente disponibile negli approcci proteina-centric, con il grande vantaggio di risolvere isoforme della proteina causate da modificazioni post-trascrizionali o proteolitici processing. Variazioni quantitativepuò essere rilevato confrontando l'intensità del corrispondente punto dopo colorazione del gel 20. Tuttavia, questa tecnica non è adatta per l'identificazione di molto grandi proteine, proteine ​​di membrana, proteine ​​estremamente semplice e acidi o idrofobi, ed è un po 'laborioso e richiede tempo tecnica 20. Nuovi approcci peptide-centric (basato su gel non) che sono più robusti e oggettivo diventano disponibili e possono essere utilizzati per il confronto quantitativo da differenziali metodi di etichettatura isotopo stabile come l'etichettatura cisteina per affinità isotopo codificato tagging (ICAT) 21, e il gruppo amminico etichettatura da isotopo codifica per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) 22. L'uso di una singola tecnica proteomica potrebbe dare informazioni sufficienti, pertanto è necessario l'utilizzo di due approcci di proteomica complementari per la maggior parte dei cambiamenti pienamente valutare in proteoma. Tuttavia, 2-D elettroforesi su gel è ampiamente utilizzato e può essere applicato routine per quantitativo espressione di diverse proteine ​​in organismi differenti.

Qui si descrive una estrazione di proteine ​​whole-cell e 2-D le procedure di elettroforesi su gel per le specie di Burkholderia che sono stati adattati e ottimizzati da GE Healthcare 2-D elettroforesi Principi e metodi Handbook 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'estrazione delle proteine ​​è stata effettuata utilizzando un battitore branello con perle di vetro in presenza di PBS contenente 5 mM di EDTA (etilendiammina tetraacetico) e 1 mM PMSF (fluoruro phenylmethylsulfonyl). Questa procedura permette la quantificazione delle proteine ​​con degradazione minima ed è modificabile per gli approcci di proteomica come precedentemente riportato 15,23,24. 2-D gel elettroforesi è stata effettuata usando 24 centimetri lungo immobilizzati pH 4-7 sfumate e proteine ​​sono state separate in base al loro punto isoelettrico. Poi proteine ​​sono state separate in base alla loro molecpeso colare da gel SDS-poliacrilammide. Inoltre, abbiamo descritto un metodo di colorazione argento per la visualizzazione di proteine ​​piatte e un metodo macchia d'argento che è compatibile per analisi di spettrometria di massa. Insieme, queste procedure possono consentire l'identificazione di proteine ​​importanti specie di Burkholderia che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi.

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Protocol

1. Crescita Cultura (Giorni 1 +2)

  1. Coltivare una coltura starter: 3 ml di Luria Bertani (LB) brodo in una provetta alto a scatto 15 ml, a 37 ° C durante la notte rotatori. Diluire la crescita durante la notte per un OD 600 di 0,6. Aggiungere 1 ml di questa diluizione a 100 ml di brodo LB in una beuta da 250 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 rpm per 16 ore in fase stazionaria (SP), per meglio approssimativa, in coltura batch, in condizioni di infezione e di assicurare che i fattori di virulenza batterici sotto il controllo del segnale di fase stazionaria fattori quali RPOs e quorum sensing, sono espressi. In alternativa, i batteri coltivati ​​in SP presto o fase-mid o late-logaritmica possono essere utilizzate per ottenere informazioni sulla fase di adattamento dei batteri.
  2. Dopo 16 hr misurare il diametro esterno 600 e garantire la coltura ha raggiunto SP rispetto ad una curva di crescita precedentemente costruito in condizioni identiche.

2. Estrazione Protein (3 ° giorno)

  1. Preparare fresco 0.1 M phenylmethanesulfonyl fluoruro di soluzione (PMSF, 174,19 g / mol) in acetone sciogliendo 0,0174 g di PMSF (PMSF 'ATTENZIONE' è tossico e corrosivo, utilizzare visiere e guanti) in 1 ml di acetone (acetone 'ATTENZIONE' è tossici e infiammabili, usare visiere e guanti).
  2. Costituire una soluzione PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml di 0,1 M PMSF, 0,1 ml di 0,5 M EDTA, e 9,8 ml di PBS. Controllare il diametro esterno della cultura 16 ore è di circa dove dovrebbe essere in SP.
  3. Prendere 35 ml di coltura batterica e trasferimento di un tubo da centrifuga e centrifugare Oakridge cultura a 4.500 xg per 20 min a 4 ° C.
  4. Rimuovere il surnatante in un contenitore di rifiuti eaggiungere 35 ml di raffreddamento PBS e risospendere il pellet. Centrifugare nuovamente a 4.500 xg per 20 min a 4 ° C.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di PBS freddo. Trasferimento a sterile 2 ml Eppendorf e centrifugare 1 min in alto nella microcentrifuga a 14.000 xg a 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
  6. Aggiungere 1 ml di soluzione PBS / EDTA / PMSF, risospendere il pellet e trasferirli in una provetta 2 ml vite tappo (con o-ring) contenente ~ microsfere di vetro da 0,5 ml (presterilized). Aggiungere il pellet risospeso alla provetta contenente perle di vetro e perline li bash a 4 ° C per 1 min in camera fredda. Fate questo 3x, mettendo il campione in ghiaccio dopo ogni bash.
  7. Centrifugare a 14000 g per 1 min in microcentrifuga. Rimuovere il surnatante e metterlo in una sterile provetta di polistirene da 5 ml.
  8. Per aumentare il rendimento aggiungere 1 ml di PBS / EDTA soluzione / PMSF a tubo stesso contenga ancora perle di vetro. Bead bash il tubo a 4 ° C per 1 min. Fate questo 2x mettere il campione sul ghiaccio after bash. Centrifugare a 14000 g per un minuto in centrifuga e rimuovere il supernatante e voglio surnatante dal punto 2.8. Utilizzare una siringa da 1 ml e un filtro 0.20 micron surnatante dal tubo polistirolo in un tubo sterile 2 ml Eppendorf.
  9. A questo punto i campioni devono essere analizzati per la quantità di proteine, utilizzando il kit di estrazione delle proteine ​​Pierce MicroBCA e aliquote di 200 mg devono essere congelati a -80 ° C fino al momento.

3. Preparazione del campione (Giorno 4)

  1. Preparare 25 ml di soluzione madre di reidratazione (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0.002% blu di bromofenolo) e conservare in 2,5 ml di aliquote a -20 ° C. Aggiungere 7 mg ditiotreitolo (DTT, 154,2 g / mol) appena prima di usare un 2,5 ml aliquota di reidratazione soluzione stock.
  2. Processo scongelato campioni dal punto 2.10 con un 2-D Clean up kit con la risospensione finale in 450 ml di reidratazione soluzione madre preparata al punto 3.1.

4. PrimoDimensione Isoelectric Focusing (IEF) (Giorno 4)

Tutti i passaggi in questa sezione utilizzano il sistema IEF Ettan IGPhor.

  1. Impostare le prime strisce IPG dimensione: premibandella pulite con soluzione detergente striscia e poi lavare con acqua Milli-Q, lasciare a testa in giù ad asciugare. Assegnare ad ogni campione un numero di supporto della striscia di gel.
  2. Caricare il campione dalla fase di reidratazione nella seconda zona più ampia dal polo (-). Utilizzare pinze pulite per tirare strisce di gel di imballaggi. Estrarre strato protettivo da strisce di gel. Linea strisce lato ruvido verso il basso in un lento, movimento di scorrimento per ottenere le strisce umide lungo il percorso da (-) fine (+) fine.
  3. Mettere carta assorbente inumidito con acqua sterilizzata in cima elettrodo e sotto le strisce di gel per evitare burnout. Sciacquare pinzette in-tra un round con acqua purificata ed etanolo. Rimuovere tutte le bolle, sovrapporre uno strato sottile di olio minerale per evitare interventi a secco. Allineare le premibandella gel sulla macchina.
  4. Esegui 12 ore a 20 ° C per rehydrazione, 1 ora a 200 V, 1 ora a 500 V, 1 ora a 1000 V, 0,5 ore a 4000 V, 12 hr a 8000 V, 24 hr stretta a 300 V e può essere estratta in questo momento.
  5. Dopo IEF è finito, si consiglia di eseguire la seconda dimensione elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide, a meno che la striscia IPG sono stati congelati a -80 ° C in Saran Wrap ricoperto di olio minerale per le analisi future. In alternativa, per evitare punto striature dovuto accesso DTT è possibile includere una seconda fase equilibramento della IPG strisce prima della seconda dimensione di un buffer che contiene iodoacetamide.

5. Seconda dimensione SDS-poliacrilammide gel elettroforesi (Giorno 5)

Tutti i passaggi in questa sezione si utilizza l'apparecchiatura di elettroforesi Ettan DALTsix.

  1. Per montare l'apparecchio gel caster, pulire accuratamente tutti i componenti e di garantire che il gel caster sia a livello e l'associazione gomma grigia è lubrificato con gel di silicone. Mettere il rub nerober tappo triangolare sul fondo. Poi, alternativamente posizionare il separatore e le lastre di vetro con la piastra inferiore di vetro sul davanti. Assicurarsi che i separatori sono sul retro e la parte anteriore. Riempire lo spazio rimanente con le cariche (circa 5 fogli) in modo che la parte superiore è piatta. Inserire il frontalino avanti con la punta rossa all'esterno. Utilizzare i morsetti per stringere ogni lato e stringere le viti inferiori.
  2. Preparazione del gel: Aggiungere 297,3 ml di Duracryl, ('ATTENZIONE' Duracryl è uso tossico visiere e guanti), 147 ml di Tampone Tris 1,5 M pH 8,8 e 143,3 ml di acqua Milli-Q in un pallone con la punta del vuoto contenente un ancoretta. Mettere il coperchio sulla parte superiore e soluzione di miscela a velocità moderata con il vuoto per 20 min. Il vuoto viene utilizzato per de-gas la soluzione. Effettuare una fresca 10% di soluzione di ammonio persolfato (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g di APS a 2 ml di acqua Milli-Q.
  3. Aggiunta la miscela gel al caster gel: Quando il vuoto è fatto aggiungere 6 ml di 10% sodio dodecil solfato (SDS, 228,38 g / mol)al lato del pallone per evitare di mettere più bolle nella soluzione. Aggiungi APS, mescolare, aggiungere 0,25 ml di N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED, 116.20 g / mol) (' ATTENZIONE 'TEMED è uso infiammabile visiere e guanti) e mescolare.
  4. Versare il composto in gel gel caster attraverso un imbuto inserito sul retro dell'apparecchio. Versare fino a un centimetro sotto la corta piatto. Aggiungere 1,5 ml di butanolo saturo d'acqua all'inizio del gel e dell'involucro superiore con pellicola trasparente per evitare la disidratazione. Attendere 1 ora per garantire la piena polimerizzazione.
  5. Controllo del gel: Quando il gel è fatto (controllare il pallone), smontare il caster gel da un lavandino. Verificare l'integrità del gel, mentre il risciacquo delle lastre di vetro con acqua calda, non permettono all'acqua di entrare nel piatto. Versare il butanolo e risciacquare la parte superiore del gel due volte con acqua per sbarazzarsi di butanolo. Riempire nuovamente la parte superiore con acqua e lasciate riposare se il gel non vengono utilizzati subito.
  6. Preparare le strisce: Preparare la soluzione tampone di equilibratura dalfreezer (6 M Urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0.002% blu di bromofenolo). Questo può essere preprepared e memorizzati in 10 ml aliquote a -20 ° C. Sciogliere 0,1 g di DTT per un 10 ml di soluzione tampone di equilibratura. Un tubo può essere usato per due strisce IPG. Posizionare i gel del viso striscia giù sul buffer e lasciate riposare per 30 min. Ricordate che finale è che.
  7. Preparare l'unità di elettroforesi (apparecchi di separazione 2-D): Aggiungere 4,5 l di 1x tampone di elettroforesi (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM glicina [288,38 g / mol], e 0,1% w / v SDS [288,38 g / mol]) per il serbatoio di servizio. Questo tampone può essere usato fino a 3x. Accendere l'unità elettroforesi su. Controllare il livello dell'acqua nella macchina di raffreddamento ad acqua e riempire con acqua se è bassa. Accendere il dispositivo, premere mode per controllare la temperatura designato, che dovrebbe essere di 10 ° C.
  8. Fare 1 L di tampone di corsa 2x e 1 L di 1x tampone di corsa e conservarli a 4 ° C. Make-agarosio tenuta Soluzione: Peso 0.25 g di agarosE e sciogliere in 50 ml di 1x tampone di corsa. Pulse per 15 secondi ciascuna.
  9. Impostazione dell'unità di elettroforesi: Utilizzare le pinzette per stipulare ogni striscia e rimuovere il tampone in eccesso su entrambi i lati con il tovagliolo di carta pulito. NON toccare le strisce. Versare l'acqua sulla superficie del gel e la linea all'inizio gel con 1x tampone di corsa. Utilizzare pinzette pulite e posizionare le strisce sulla parte superiore della piastra lunga, con il lato rivolto verso di gel. Aggiungere 1x tampone ai pozzetti di una buona lubrificazione. Strisce di scorrimento più in basso utilizzando strisce di plastica. Rimuovere tutte le bolle tra la striscia e il gel.
  10. Aggiungere la soluzione-agarosio tenuta all'inizio della striscia per sigillarla. Ripetere per il resto delle strisce. Posizionare le lastre di vetro contenenti gel in gel culla e inferiore nel serbatoio gel. Assicurarsi che il livello 1x tampone nella camera esterna è sulla riga inferiore designato prima di mettere la camera superiore su.
  11. Posizionare il telaio per camera di transito superiore sopra le lastre di vetro e assicurarsi che sia tutto il way verso il basso premendo la parte inferiore verso il basso. Utilizzare un imbuto e aggiungere il tampone di corsa 2x nella camera superiore fino alla linea centrale. Utilizzare un imbuto e aggiungere tampone di corsa 1x alla camera esterna fino a raggiungere la linea superiore. Mettere il coperchio sulla parte superiore e accendere l'unità elettroforesi e l'alimentatore.
  12. Eseguire una notte a 52 V, 96 mA, 5 W. Verificare se la corrente sta cercando di bolle sul filo d'argento vicino alla cima. Eseguire il gel fino a quando la linea principale è a 1 cm dal fondo.
  13. Le proteine ​​possono anche essere analizzati utilizzando attrezzature e reagenti provenienti da altre aziende quali Biorad o Hoefer, secondo le istruzioni del produttore.

6. Argento colorazione dei gel Gel Visualization (Day 5-6)

  1. Preparare una soluzione di correzione 1 (800 ml di etanolo, 200 ml di acido acetico, e 1000 ml di acqua Milli-Q in cappa in un secchio di plastica). Soluzione è buona per 6 gel. Girare tutte le macchine fuori e prendere l'intera sezione centrale dell'unità di elettroforesi e pull nel lavandino. Anche mettere lo stand bianco nel lavandino. Estrarre il vassoio superiore contenente il tampone 2x esecuzione.
  2. Smontare l'apparecchio e rimuovere il gel dalle lastre di vetro nella soluzione di correzione 1. I gel possono essere identificati tagliando angoli quando vengono rimossi dalle lastre di vetro, il numero di angoli tagliati corrispondente all'ordine gel nel caster.
  3. Posizionare il contenitore con la soluzione correzione e il gel su un agitatore per almeno 1 ora a notte a 4 ° C.
  4. Trasferire i gel per fissare Soluzione 2 (20 ml di 50% glutaraldeide, 600 ml di etanolo, 5 g di Tetrathionate potassio (302,46 g / mol), 136 g di acetato di sodio (82,03 g / mol), e acqua Milli-Q per 2.000 ml) e posto su una sedia a dondolo per 1 ora.
  5. Lavare i gel 4x per 15 minuti ciascuno in acqua Milli-Q.
  6. Macchiare i gel in soluzione di nitrato d'argento (4 g di nitrato d'argento (169.87 g / mol), 500 ml di formaldeide, e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 30 minuti o fino a 48 ore.
  7. Lavare gel per 1min in acqua Milli-Q.
  8. Trasferimento di soluzione di sviluppo (60 g di carbonato di sodio (105.99 g / mol), 300 ml di formaldeide, 15 mg di sodio tiosolfato (158.11 g / mol), e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 5-30 min fino alla gel è macchiato.
  9. Mettere i gel in soluzione bloccante (100 g di Tris-Base (121.14 g / mol), 40 ml di acido acetico e acqua Milli-Q a 2.000 ml) per 10 min.
  10. Per lo stoccaggio, trasferire i gel di glicerina Solution (40 ml di glicerolo o 400 ml se la conservazione a lungo termine è desiderata, e 1.600 ml di acqua Milli-Q) per 10 min e poi asciugarli con essiccatore gel.
  11. I gel possono essere visualizzati dopo colorazione utilizzando sistemi di imaging come uno scanner / densitometro, fotografato utilizzando transilluminatore luce o gel imager. Software di analisi delle immagini, come PDQuest 2-D di analisi da BIORAD può quindi essere utilizzato per ottenere informazioni quantitative e qualitative da proteine ​​in un campione.

7. Gel d'argento colorazione per l'analisi Spettrometria di Massa

  • Fissare i gel in 50% metanolo e acido acetico 5% per 1 ora.
  • Lavare in metanolo al 50% per almeno 10 minuti per tutta la notte.
  • Lavare 3x in acqua distillata per 10 min.
  • Sensibilizzare con tiosolfato di sodio 0,02% (158.11 g / mol) 2x per 15 min.
  • Lavare 3x in REFRIGERATE 3x acqua distillata per 10 min.
  • Immergere gel in soluzione di nitrato d'argento refrigerati 1% (169.87 g / mol) per almeno 20 minuti a 1 ora a 4 ° C
  • Lavare 2x per 1 minuto con acqua distillata. Cambia vassoio / secchio.
  • Sviluppare in 0,04% di formaldeide nel 2% di carbonato di sodio anidro (105.99 g / mol) e scartare quando diventa giallo abbastanza veloce; avere tre lotti ed essere pronti a cambiare ogni 5 min.
  • Lavare in 5% di acido acetico quindi memorizzare in 1% acido acetico.
  • Sciacquare 1,5 ml provette Eppendorf (per tenere get spot cut-outs) con etanolo grado USP e asciugare prima dell'uso.
  • Pinze pulite, lame di rasoio e superfici con il 100% di metanolo.
  • Spruzzare guanti e superfici con etanolo.
  • Macchie accise in una cappa a flusso o un'area aria pulita. Spot possono essere asportati anche utilizzando una fresa posto automatizzato.
  • Metterli in provette Eppendorf e nave su ghiaccio o mantenere in frigorifero.
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    Representative Results

    Analisi comparativa dei profili proteici estratti dalla stessa coltura batterica in due diverse occasioni ha mostrato modelli simili banding indicando estrazioni di proteine ​​successo. Proteine ​​di peso molecolare estratte andavano 10-150 kDa. Figura 1 mostra rappresentante Coomassie blu colorazione gel delle estrazioni proteina whole-cell da multivorans Burkholderia (membro della BCC) isolati clinici coltivati ​​in LB o lievito / Manitol (YEM) brodo e raccolte da fase stazionaria.

    Per 2-D elettroforesi su gel, 200 mg di proteine ​​totali da Burkholderia pseudomallei stato utilizzato (Figura 2). Dal momento che questo agente patogeno è riconosciuto come un B-tipo di agente di guerra biologica dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie 25, sono state effettuate le procedure di preparazione di proteine ​​nel livello di sicurezza Bio laboratorio 3 di contenimento e di conseguenza con le procedure operative standard.Le proteine ​​sono state risospese in soluzione di reidratazione e applicati a un 24 cm immobilizzati pH 4-7 gradiente e proteine ​​sono state separate in base al loro punto isoelettrico (pI). Poi strisce sono state poste su un gel SDS-poliacrilammide e proteine ​​sono state separate in base al loro peso molecolare (MW). Successivamente, il gel è stato colorato argento per la visualizzazione posto proteina. I risultati hanno mostrato l'abbondanza di oltre 500 spot proteici che possono essere identificati individualmente mediante spettrometria di massa.

    Figura 1
    Figura 1. Profili proteici totali di multivorans Burkholderia isolati. Analisi SDS-PAGE delle proteine ​​estratte nella fase stazionaria da D-2214 e D-2094 isolati coltivato in LB o lievito / Manitol (YEM) brodo in due diverse occasioni (1 e 2). 4 mg di proteina sono stati caricati in ogni corsia di un gel 12,5% e wi macchiatoth Coomassie blu. Corsia M, proteina marker.

    Figura 2
    Figura 2. 2-D analisi elettroforesi su gel di Burkholderia pseudomallei 1234B isolare. Rappresentante 2-D gel che mostra la separazione delle proteine-argento macchiato nel pI 4-7 gamma strip. Estratti proteici cellula intera (200 mcg) alla fase stazionaria sono stati usati e separati su un gel SDS-PAGE 15%.

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    Discussion

    Procedimento per la preparazione di proteine ​​è stato descritto che può estrarre la maggior parte delle proteine ​​Burkholderia con buona riproducibilità. Ciò è dimostrato ottenendo lo stesso profilo proteico da due preparazioni indipendenti eseguiti in giorni diversi utilizzando la stessa coltura batterica cresciuta in LB o YEM brodo come mostrato nella Figura 1. Estrazione era efficiente per i batteri coltivati ​​in terreni liquidi, ma non abbiamo testato questo metodo per i batteri coltivati ​​su piastre. Questo metodo è stato utilizzato anche per l'ulteriore caratterizzazione delle proteine ​​utilizzando strumenti di proteomica, il nostro gruppo ha studiato con successo i cambiamenti del proteoma mediante elettroforesi su gel 2-D e isotopo codifica per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) tecniche di proteomica 15,23,24. Per questi ultimi, le proteine ​​sono state estratte in un tampone contenente 0,5 M EDTA in PBS per evitare qualsiasi interferenza di PMSF con gli esperimenti iTRAQ 15.

    È importante remarca che durante il processo di estrazione delle proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel, tutti i passaggi effettuati a 4 ° C o in condizioni di freddo mediante benne di ghiaccio per minimizzare la degradazione delle proteine, come pure di utilizzare punte collegato e indossare guanti in nitrile e coprire tutte pelle per prevenire la contaminazione della cheratina di tutti i punti tagliati fuori per la successiva identificazione mediante spettrometria di massa. Quando si esegue estrazioni proteiche, è anche importante considerare che il PMSF ha un breve tempo di emivita in soluzioni acquose, secondo il costruttore, quindi la soluzione madre di 0,1 mM in acetone deve essere effettuato immediatamente prima dell'uso. In alternativa, altri inibitori della serina proteasi o inibitori che sono più solubili e stabili, e meno tossici possono essere usate, anche se non li abbiamo testato nei nostri esperimenti.

    Il tampone di lisi utilizzato in questa procedura non contiene urea, che è importante per la solubilizzazione di estrarre entrambi (citosolici) proteine ​​acquose e prot meno solubileeins, tra cui alcune proteine ​​di membrana 17. Ma, durante la loro preparazione per prima dimensione focalizzazione isoelettrica (fase 3 del presente protocollo), i campioni sono risospesi in tampone di reidratazione che contiene urea. Altre tecniche di proteomica comportano anche un trattamento simile 26. Prima di seguire con la fase di reidratazione, sembra che la rimozione di materiali interferenti o impurità a basso peso molecolare è fondamentale per alta risoluzione, si consiglia di utilizzare il 2-D Clean-up Kit in ogni campioni di proteine ​​come risultati migliorati. Prima di caricare i campioni per la prima dimensione isoelettrica separazione di messa a fuoco, assicurarsi di avere le strisce preparate di carta assorbente la giusta dimensione dei titolari striscia, in quanto questo è problematico per tagliare la giusta dimensione in modo asettico in loco (per il punto 3.4 del presente protocollo).

    Prima di eseguire una SDS-poliacrilammide gel elettroforesi 2-D, è necessario garantire che la percentuale gel si adatta alle dimensioni attese di interesse (a 120,5% la percentuale di gel in grado di risolvere proteine ​​nel range di 14-100 kDa). Dopo elettroforesi su gel seconda dimensione è completata, la visualizzazione di proteine ​​può essere ottenuto mediante colorazione con Coomassie blu o argento; quest'ultima colorazione è più sensibile con limite di rivelazione è a partire da 0,1 ng / proteine ​​/ spot 20. Spot proteici visualizzate con colorazione argento sono adatti per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa. Tuttavia, è importante ricordare che la soluzione macchia d'argento non dovrebbe contenere glutaraldeide poiché questo agente reticola con proteine, quindi non è compatibile con ulteriori analisi di spettrometria di massa 20. In alternativa, per rilevare e quantificare le proteine ​​differenzialmente espresse, può essere utilizzato un altro approccio a base di gel come Two-Dimensional differenza nel gel (2D-DIGE) insieme con software automatizzato. Questo approccio impiega tag fluorescenti distinti (ad esempio CY 3, 5 e 2) che vengono utilizzati per campioni un'etichetta e un pr standard interno universaleior a seconda superamento elettroforesi dimensione, in una certa misura, gli svantaggi di variazione e riproducibilità di 2-D elettroforesi 27. Inoltre, i gel possono essere colorati dopo la seconda dimensione con SyproRuby, che è una macchia rutenio chelato organometallico progettato per applicazioni di proteomica. Può rilevare spot proteici con sensibilità simile a quella colorazione argentica, ma con una maggiore sensibilità di Coomassie blue. Dopo gel di colorazione possono essere fotografati con scanner laser o transilluminatore 28.

    In conclusione, questo video descrive un intero-cellula batterica procedura di estrazione delle proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel metodo che può permettere lo studio dei cambiamenti globali nel proteoma in specie Burkholderia.

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    Disclosures

    Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

    Acknowledgements

    Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Università della British Columbia (a BV) e borse di Cystic Fibrosis Canada e Canadian Institutes of Health Research (a DPS). Ringraziamo Jacqueline Chung per la preparazione iniziale dei protocolli.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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    References

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