Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Medlemmer av Burkholderia slekten er patogener av klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåte for total bakterieprotein utvinning, ved hjelp av mekaniske forstyrrelser, og 2-D-gel-elektroforese etterfølgende proteomikk analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Undersøkelsen av de intracellulære protein-nivåer i bakterielle arter er av betydning for å forstå de patogene mekanismer av sykdommer forårsaket av slike organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåte for protein-fjerning fra Burkholderia arter basert på mekanisk lysis ved hjelp av glasskuler i nærvær av etylendiamin-tetraeddiksyre og fenylmethyl-sulfonylfluorid i fosfatbufret saltvann. Denne metoden kan bli brukt for forskjellige Burkholderia arter, for forskjellige vekstbetingelser, og det er sannsynlig egnet for bruk i proteomic studier av andre bakterier. Etter protein ekstraksjon, er en to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese proteomikk teknikk som er beskrevet for å studere globale endringer i proteomes av disse organismene. Denne metoden består av separering av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, etterfulgt av separering på basis av molekylvektved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. Visualisering av separerte proteinene blir utført ved sølvfarging.

Introduction

Slekten Burkholderia omfatter mer enn 62 arter, Gram-negative organismer ble isolert fra en rekke nisjer, og den er delt i to hoved klynger 1,2. Den første klyngen omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste studier har fokusert på de sykdomsfremkallende arter av denne gruppen på grunn av deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (som forårsaker melioidosis og glanders henholdsvis) 3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerte arter av Burkholderia cepacia kompleks, BCC) 5, som forårsaker sykdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sykdom (CGD) en. Den andre klyngen, med mer enn 30 ikke-patogene arter, omfatter bakterier assosiert med planter eller med miljøet, og anses potensielt fordelaktig for verten 2..

Tallrike komplikasjoner dukker frOM bakteriell infeksjon med den patogene medlemmer av Burkholderia slekten, slik som overføring av organismen mellom pasienter, spredning av sykdommen og behandlingssvikt på grunn av den indre eller ervervet resistens mot antibiotika gjør vanskelig å utrydde i de fleste av tilfellene 6-9. Derfor få en klarere forståelse av grunnlaget for etablering av bakteriell infeksjon er viktig for behandling av sykdommer forårsaket av slike organismer. For å få innsikt i etablering av infeksjon, er omfattende undersøkelser på de bakterielle komponenter assosiert med patogenesen nødvendig. Studier som fokuserer på proteomikk analyser av Burkholderia organismer ved hjelp av proteomikk tilnærminger beskrevet proteiner som har vært innblandet i bakteriell patogenesen samt endringer i deres proteom profiler 10-16.

Protein utvinning metoder ved hjelp av ultralydbehandling og fryse-tint sykluser i lysis buffer som inneholder høy konsentration av urea, har tiourinstoff i kombinasjon med vaskemiddel og ampholytes blitt anvendt i Burkholderia proteomikk studier 10-13. Selv urinstoff er ganske effektiv for proteindenaturering, kan den etablere en likevekt i vandig oppløsning med ammonium-isocyanat, som kan reagere med amino-syregrupper, for derved å danne gjenstander (karbamylering reaksjon) 17. Derfor anbefales det å inkludere bærer ampholytes, som fungerer som cyanat passiveringsmidler og unngå temperaturer høyere enn 37 ° C 17. Videre, for å forhindre en hvilken som helst kjemisk interferens av lysis buffer med protein kvantifisering, den samme lyseringsbuffer kan anvendes til å generere standardkurven, slik at prøvene og standardene har samme bakgrunn 10.. Andre metoder involverer bruken av alkaliske buffere og vaskemidler med varme inkubasjonsperioder 17,18, men disse betingelser kan indusere endringer i proteomet og enkelte vaskemidler er ikke kompatible med proteomics søknad med mindre senere fjernings vaskemiddel trinn er inkludert 17,18.

Etter tilfredsstillende ekstraksjon og kvantifisering kan global protein ekspresjon av hvert enkelt protein bli studert ved hjelp proteomic tilnærminger som to-dimensjonal (2-D) gelelektroforese. Denne teknikken ble først beskrevet av O'Farell 19 og består i separasjonen av proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, og deretter i henhold til deres molekylvekt ved akrylamid gel elektroforese i den andre dimensjonen. På grunn av dets oppløsning og sensitivitet, er denne teknikken et kraftig verktøy for analyse og påvisning av proteiner fra komplekse biologiske kilder 19,20. Denne separasjonsteknikk er for tiden tilgjengelig i protein-sentriske tilnærminger med den store fordelen av å løse protein isoforms forårsaket av post-transcriptional modifikasjoner eller proteolytisk prosessering. Kvantitative endringerkan påvises ved å sammenligne intensiteten av den tilsvarende sted etter farging av gelen 20.. Imidlertid er denne teknikk ikke er egnet for identifisering av meget store proteiner, membranproteiner, ekstremt enkel og sure eller hydrofobe proteiner, og er en noe arbeidskrevende og tidskrevende teknikk 20.. Nye peptid-sentriske tilnærminger (ikke gel-basert) som er mer robust og objektiv blir tilgjengelige og kan benyttes for kvantitativ sammenligning av differensial stabile isotoper for merking av metoder som cystein merking av isotop-kodet affinitet merking (ICAT) 21, og aminogruppen merking av isotopen tagging for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) 22. Bruken av en enkelt proteomikk teknikk kan gi utilstrekkelig informasjon, og derfor bruken av to komplementære proteomic tilnærminger er nødvendig for de fleste fullstendig å vurdere endringer i proteom. Ikke desto mindre er 2-D-gel-elektroforese utbredt og kan rutinemessig anvendes for kvantitative uttrykket av flere proteiner i ulike organismer.

Her beskriver vi en hel-celle protein utvinning og 2-D gel elektroforese prosedyrer for Burkholderia arter som ble tilpasset og optimalisert fra GE Healthcare 2-D elektroforese Prinsipper og metoder håndbok 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet ekstraksjon ble utført ved hjelp av en limstreng beater med glasskuler i nærvær av PBS inneholdende 5 mM EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre), 1 mM PMSF (fenylmethyl-sulfonylfluorid). Denne prosedyren tillater kvantifisering av proteiner med minimal degradering og er amendable for proteomikk tilnærminger som tidligere rapportert 15,23,24. 2-D-gel-elektroforese ble utført ved å bruke 24 cm lang immobilisert pH 4-7 gradient og proteiner ble separert i henhold til deres isoelektriske punkt. Deretter proteiner ble separert i henhold til deres Molecmeringen vekt ved SDS-polyakrylamid-gel. I tillegg har vi beskrevet en sølvfargemetoden for visualisering av stikk proteiner, og en sølvfarge metode som er kompatibel for massespektrometri-analyse. Sammen disse prosedyrene kan tillate identifikasjon av viktige proteiner fra Burkholderia arter som kan være involvert i patogenesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Kultur Vekst (Days 1 +2)

  1. Dyrk en startkultur: 3 ml Luria Bertani (LB) buljong i en smekk topp 15 ml tube, ved 37 ° C rotator over natten. Tynn ut over natten vekst til en OD 600 på 0,6. Tilsett 1 ml av denne fortynning til 100 ml LB-næringsløsning i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Inkuber ved 37 ° C med rysting ved 250 rpm i 16 timer inn i stasjonær fase (SP), for å bedre nøyaktig, i batch-kultur, infeksjonsforhold, og for å sikre at bakteriell virulens faktorer under kontroll av stasjonære fasesignal faktorer som RPO og quorums sensing, kommer til uttrykk. Alternativt, kan bakterier dyrket ved tidlig SP eller midt-eller sent-logaritmisk fase brukes til å få informasjon om den bakterielle tilpasning fase.
  2. Etter 16 timer måle OD 600 og sikre at kulturen har nådd SP ved sammenligning med en på forhånd konstruert vekstkurve under identiske betingelser.

2. Protein Extraction (Dag 3)

  1. Forbered frisk 0,1 M phenylmethanesulfonyl (PMSF, 174,19 g / mol) løsning i aceton ved å løse opp 0,0174 g PMSF ('FORSIKTIG' PMSF er giftig og etsende, bruk visir og hansker) i 1 ml aceton ('FORSIKTIG' aceton er giftig og brannfarlig, bruker ansiktsbeskyttelse og hansker).
  2. Utgjør en PBS / EDTA / PMSF-løsning: 0,1 ml av 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA, og 9,8 ml PBS. Kontroller den utvendige diameteren til 16 timers kultur er omtrent der det skal være i SP.
  3. Ta 35 ml av bakteriekulturen og overfør til en Oakridge sentrifugerør og sentrifuger kulturen ved 4500 x g i 20 min ved 4 ° C.
  4. Fjern supernatanten til en avfallsbeholder oglegg 35 ml PBS avkjølt og resuspender pelleten. Sentrifuger på nytt ved 4500 x g i 20 min ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatant og resuspender i 1 ml kald PBS. Overfør til sterilt 2 ml Eppendorf sentrifuge og 1 min på høy i mikrosentrifuge ved 14 000 x g ved 4 ° C. Fjern og kast supernatanten.
  6. Legg 1 ml PBS / EDTA / PMSF løsning, resuspender pellet og overføring til en 2 ml skrukork (med o-ring) som inneholder ~ 0,5 ml glassperler (sterilisert). Tilsett re-suspendert pellet til røret inneholdende glass-perler og perle bash dem ved 4 ° C i 1 min i kaldt-rom. Gjør dette 3x, sette prøven på isen etter hvert bash.
  7. Sentrifuger ved 14000 x g i 1 min i en mikrosentrifuge. Fjern supernatanten og legg den i en steril 5 ml polystyren rør.
  8. For å øke utbyttet tilsett 1 ml PBS / EDTA / PMSF løsning på samme rør inneholde glassperler igjen. Perlene fest røret ved 4 ° C i 1 min. Har denne 2x sette prøven på is after bash. Sentrifuger ved 14000 x g i ett minutt på sentrifugen, og fjern supernatanten og tilsett til supernatant fra trinn 2.8. Bruk en 1 ml sprøyte, og et 0,20 mikrometer filter supernatanten fra polystyren røret til en ny steril 2 ml Eppendorf-rør.
  9. På dette tidspunkt prøvene som skal analyseres for protein-mengde, ved hjelp av Pierce MicroBCA protein ekstraksjon kit og aliquoter av 200 ug skal fryses ved -80 ° C inntil behov.

Tre. Prøvepreparering (Dag 4)

  1. Forbered 25 ml rehydrering stamløsning (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% bromfenolblå) og butikken i 2,5 ml deler ved -20 ° C. Til 7 mg ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol) rett før bruk, til en 2,5 ml alikvot av stamoppløsning rehydrering.
  2. Prosess tinte prøver fra trinnet 2.10 ved hjelp av en 2-D Clean kit med endelig resuspensjon i 450 pl av rehydrering forrådsoppløsning fremstilt i trinn 3.1.

4. Første-Dimensjon isoelektrisk fokusering (IEF) (Dag 4)

Alle trinnene i denne delen bruker Ettan IGPhor IEF System.

  1. Sett opp IPG første dimensjon strimler: rene strippeholdere med strip rengjøringsmiddel og vask deretter med Milli-Q vann, la opp ned for å tørke. Tildel hver prøve til en gel holderen nummer.
  2. Laste prøven fra rehydrering trinnet i den andre bredere området fra (-)-enden. Bruk rene pinsett til å trekke gel strimler ut av emballasjen. Ta ut beskyttende lag fra gel strimler. Linje strimler grove siden ned i en langsom, glidende bevegelse for å få strimlene våt underveis fra (-) enden til (+) ende.
  3. Sett fuktig trekkpapir med sterilisert vann på toppen av elektroden og under gel-strimler for å forhindre utbrenning. Skyll pinsett i-mellom rundene med renset vann og etanol. Fjern alle boblene, overlegg tynt med mineralolje for å forhindre tørre outs. Linje gel stripe holdere på maskinen.
  4. Kjør 12 timer ved 20 ° C for rehydrasjon, 1 time ved 200 V, 1 time ved 500 V, 1 time ved 1000 V, 0,5 timer ved 4000 V, 12 timer ved 8000 V, 24 hr hold på 300 V, og kan bli tatt ut på dette tidspunkt.
  5. Etter IEF er ferdig, er det anbefalt å utføre den andre dimensjons SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, med mindre IPG strimmelen blir frosset ved -80 ° C i Saran plast belagt med mineralolje for fremtidig analyse. Alternativt, for å unngå punkt streker grunnet DTT tilgang er det mulig å inkludere en andre ekvilibreringsperiode trinn av IPG strimler før den andre dimensjon med en buffer som inneholder jodacetamid.

5. Andre dimensjons SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (dag 5)

Alle trinnene i denne delen bruker Ettan DALTsix elektroforeseapparaturen.

  1. Slik setter du sammen gel caster apparatet, rengjør grundig alle komponenter og sikre at gel caster er nivået og den grå gummi bindende smøres med silikon gel. Sett den svarte gniBER trekantet stopper på bunnen. Deretter, vekselvis å plassere separatoren og glassplatene med den korte plate av glass mot fronten. Pass på at separatorer er på baksiden og forsiden. Fylle den gjenværende plassen med fyllstoff (ca 5 ark) slik at toppen er flat. Sett frontpanelet på med den røde kulen på utsiden. Bruk klemmer å stramme hver side og trekk til bunnskruene.
  2. Klar gel: Legg 297,3 ml av Duracryl, (er 'FORSIKTIG' Duracryl giftig bruk visir og hansker), 147 ml Tris Buffer 1,5 M pH 8,8, og 143,3 ml av Milli-Q vann i en kolbe med vakuum tips som inneholder en oppsikt bar. Sett lokk på over-og blande oppløsningen ved moderat hastighet med vakuum på 20 min. Vakuumet blir brukt for å de-gass til løsningen. Foreta en frisk 10% ammonium-persulfat-løsning (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS i 2 ml av Milli-Q vann.
  3. Ved å legge til gel-blanding til gel-caster: Når vakuum er gjort legg 6 ml 10% natrium-dodecyl-sulfat (SDS, 228,38 g / mol)til siden av kolben for å unngå å sette flere bobler i løsningen. Legg APS, røre, tilsett 0,25 ml N, N, N ',' tetrametyletylendiamin (TEMED, 116,20 g / mol) ('ADVARSEL' TEMED er brannfarlig bruk visir og hansker) og rør om.
  4. Hell gelen inn i blandingen gel trinse gjennom en trakt inn på baksiden av apparatet. Hell opptil en tomme under den korte plate. Tilsett 1,5 ml vann-mettet butanol til toppen av gelen og vikle topp med saran plast for å unngå uttørring. Vent i 1 time for å sikre fullstendig polymerisering.
  5. Kontroll av gel: Når gelen er gjort (sjekk kolbe), demontere gel caster av en vask. Sjekk for gel integritet mens skylling glassplatene med varmt vann, ikke la vann komme inn på plate. Hell ut butanol og skyll toppen av gel to ganger med vann for å bli kvitt butanol. Fyll toppen med vann igjen og la sitte hvis de gels ikke brukes med en gang.
  6. Forbereder stripene: Forbered likevektsbufferen løsning frafryser (6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.9% SDS, 0,002% bromfenolblått). Dette kan være preprepared og lagres i 10 ml alikvoter ved -20 ° C. Oppløs 0,1 g DTT til en 10 ml ekvilibrering bufferløsning. En slange kan brukes for to IPG strimler. Plasser gelene av strimmelen med forsiden ned på bufferen og la det stå i 30 min. Husk hvilken ende er hvilken.
  7. Klar Electrophoresis enheten (2-D separasjonsapparat): til 4,5 L av 1x elektroforese buffer (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM Glysin [288,38 g / mol], og 0,1% vekt / volum SDS [288,38 g / mol]) til driften tank. Denne bufferen kan brukes i opp til 3x. Snu elektroforese enheten på. Kontroller vannivået i vann-kjølemaskin og fylle det med vann dersom det er lavt. Slå på maskinen, trykker du på mode for å sjekke den utpekte temperatur, noe som bør være 10 ° C.
  8. Lag 1 L av 2x rennende buffer og 1 l 1x av rennende buffer og lagres ved 4 ° C. Gjør agarose-forsegling løsning: vekt 0,25 g agarosesjikte og oppløses i 50 ml av 1 x rennende buffer. Pulsen i 15 sekunder hver.
  9. Sette opp Elektroforese enhet: Bruk pinsett for å ta ut hver stripe og fjerne overflødig buffer på begge sider med rent papir håndkle. IKKE berøre strimler. Hell av vann på toppen av gelen og linje gel toppen med 1 x rennende buffer. Bruk rene pinsett og legg strimler på toppen av den lange plate, med gel siden vendt mot deg. Legg 1x buffer til strips for å smøre det. Slide strimler lenger ned ved bruk av plaststrimler. Fjern alle boblene i mellom stripen og gel.
  10. Legg agarose tettende løsning på toppen av strimmelen for å forsegle den. Gjenta for resten av strimlene. Plasser de glassplater som inneholder gelene inn i gel-holderen og lavere inn i gelen tanken. Sikre 1x buffer nivå i den ytre kammeret er på den angitte bunnlinjen før du setter den øvre kammer på.
  11. Plasser rammen for øvre buffer kammer på toppen av glassplatene, og at det er desto way ned ved å trykke bunnen ned. Bruk en trakt og legg til 2x buffer til det øvre kammeret opp til den midterste linjen. Bruk trakt og tilsett 1 x løpebuffer til det ytre kammeret til det når den øverste linje. Plasser lokket på toppen og slå på Elektroforese enhet og kraftpakke.
  12. Kjør over natten på 52 V, 96 mA, 5 W. Sjekk om strømmen går ved å se etter bobler på sølv wire nær toppen. Kjør gelen før Ledelinjen er en cm fra bunnen.
  13. Proteiner kan også bli analysert ved bruk av utstyr og reagenser fra andre selskaper BioRad eller Hoefer, i henhold til produsentens instruksjoner.

6. Silver Farging av Gel for Gel Visualisering (Dag 5-6)

  1. Tilbered en løsning løsning 1 (800 ml etanol, 200 ml eddiksyre og 1000 ml av Milli-Q vann i avtrekksskap i en plastbøtte). Løsningen er god for 6 gels. Snu alle maskinene av og ta ut hele midtre delen av Elektroforese enhet og pull det i vasken. Satte også den hvite stå i vasken. Trekk ut den øverste skuffen som inneholder 2x kjører buffer.
  2. Demontere apparatet og fjern gels fra glassplatene inn fix løsning en. Geler kan identifiseres ved å kutte hjørner når de er fjernet fra glassplatene og antallet hjørner snitt svarende til gel orden i hjulet.
  3. Plasser beholderen med opprettings løsning og gelene på en vippe i minst 1 time til over natten ved 4 ° C.
  4. Overfør gelene å fastsette Løsning 2 (20 ml 50% glutar-aldehyd, 600 ml etanol, 5 g kalium Tetrationat (302,46 g / mol), 136 g natrium-acetat (82,03 g / mol), og Milli-Q vann for å 2,000 ml) og plassere på et vippe i 1 time.
  5. Vask 4x gelene i 15 minutter hver i Milli-Q vann.
  6. Flekk gelene i sølvnitratløsning (4 g sølvnitrat (169,87 g / mol), 500 pl av formaldehyd, og Milli-Q vann til 2000 ml) i 30 min, eller opptil 48 timer.
  7. Vask gel for enmin i Milli-Q vann.
  8. Overføring til fremkallingsløsning (60 g natriumkarbonat (105,99 g / mol), 300 pl av formaldehyd, 15 mg natrium-tiosulfat (158,11 g / mol), og Milli-Q vann til 2000 ml) i 5-30 min inntil gel er farget.
  9. Sett gelene i stoppløsning (100 g Tris-base (121,14 g / mol), 40 ml eddiksyre, og Milli-Q vann til 2000 ml) i 10 min.
  10. For lagring, overføre gels til Glyserol Solution (40 ml glyserol eller 400 ml hvis langtidslagring er ønsket, og 1600 ml av Milli-Q vann) i 10 minutter og tørk dem ved hjelp av en gel tørketrommel.
  11. Gels kan visualiseres etter farging bruker bildesystemer for eksempel en skanner / densitometer, fotografert ved hjelp av lys transilluminator eller Gel imager. Image Analysis programvare som PDQuest 2-D-analyse fra BioRad kan deretter bli anvendt for å oppnå kvantitativ og kvalitativ informasjon fra proteiner i en prøve.

7. Gel Silver Farging for massespektrometri Analyse

  • Fiks gelene i 50% metanol og 5% eddiksyre i 1 time.
  • Vask i 50% metanol i minst 10 minutter til over natten.
  • Vask i destillert vann 3 ganger i 10 min.
  • Sensibilisere med 0,02% natriumtiosulfat (158,11 g / mol) 2 x i 15 min.
  • Vask 3x i KJØLTE destillert vann 3x for 10 min.
  • Senk gel i KJØLT 1% sølvnitrat-oppløsning (169,87 g / mol) i minst 20 minutter til 1 time ved 4 ° C
  • Vask 2 x i 1 minutt med destillert vann. Endre skuffen / bøtte.
  • Utvikle i 0,04% formaldehyd i 2% natriumkarbonat vannfri (105.99 g / mol) og kast når det blir gul ganske rask; har tre grupper og være klar til å endre hvert 5 min.
  • Vask i 5% eddiksyre og deretter lagre i 1% eddiksyre.
  • Skyll 1,5 ml Eppendorf-rør (for å holde få plass åpninger) med USP grade etanol og lufttørket før bruk.
  • Rene tang, barberblad og overflater med 100% metanol.
  • Spray hansker og overflater med etanol.
  • Avgiftsdirektoratet flekker i en flyt hette eller ren luft området. Flekker kan også fjernet ved hjelp av en automatisert sted cutter.
  • Sett dem i Eppendorf rør og skip på is eller holde i kjøleskap.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Sammenlignende analyse av proteinprofilene utvunnet fra den samme bakteriekultur på to forskjellige anledninger viste lignende mønstre banding indikerer suksessfulle protein ekstraksjoner. Molekylvekt proteiner utvunnet varierte 10-150 kDa. Figur 1 viser representant Coomassie blå flekker gel av de hel-celle protein utdrag fra Burkholderia multivorans (et medlem av BCC) kliniske isolater dyrket i LB eller gjær / mannitol (YEM) kjøttkraft og høstet fra stasjonær fase.

    For 2-D-gel-elektroforese-analyse, 200 pg av det totale proteiner fra Burkholderia pseudomallei ble benyttet (Figur 2). Siden dette patogenet er anerkjent som en B-type biologisk stridsmiddel ved US Centers for Disease Control and Prevention 25, ble protein klargjøring utført i Bio Safety Level 3 containment laboratorium og følgelig med standard operasjonsprosedyrer.Proteiner ble resuspendert i rehydrering-oppløsning og påført på en 24 cm lang immobilisert pH 4-7 gradient, og proteinene ble separert i henhold til deres isoelektriske punkt (pI). Da strimlene ble plassert på en SDS-polyakrylamidgel og proteiner ble separert i henhold til deres molekylvekt (MW). Deretter gel var sølv farget for protein flekk visualisering. Resultatene viste overflod av mer enn 500 proteiner som kan være individuelt identifisert av massespektrometri.

    Figur 1
    Figur 1. Total proteinprofilene av Burkholderia multivorans isolater. SDS-PAGE-analyse av protein utvunnet i den stasjonære fase fra D-2214 og D-2094 isolater dyrket i LB-eller gjær / mannitol (YEM) kokes i to forskjellige anledninger (1 og 2). 4 mikrogram av protein ble lagt i hvert kjørefelt av en 12,5% gel og farget with Coomassie blå. Lane M, protein markør.

    Fig. 2
    Figur 2. 2-D-gel-elektroforese-analyse av Burkholderia pseudomallei 1234B isolere. Representative sølvbeiset 2-D-gel som viser proteinseparasjon i pI 4-7 gående stripe. Hel-celle protein-ekstrakter (200 pg) på den stasjonære fasen ble brukt og separert på en 15% SDS-PAGE gel.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    En fremgangsmåte for proteiner Preparatet er beskrevet som kan trekke ut mesteparten av Burkholderia proteiner med god reproduserbarhet. Dette er demonstrert ved å skaffe den samme proteinprofilen fra to uavhengige preparater utført på forskjellige dager ved bruk av samme bakteriekultur dyrket i LB-eller YEM buljong, som vist i figur 1. Utvinning var effektiv for bakterier dyrkes i flytende medier, men vi har ikke testet denne metoden for bakterier dyrket på platene. Denne metoden ble også brukt for videre protein karakterisering ved hjelp av proteomikk verktøy; vår gruppe har fått studert proteom endringer ved hjelp av 2-D gel elektroforese og isotop tagging for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) proteomikk teknikker 15,23,24. For den sistnevnte, ble proteinene ekstrahert inn i en buffer inneholdende 0,5 M EDTA i PBS for å unngå enhver forstyrrelse av PMSF med iTRAQ eksperimenter 15.

    Det er viktig å remark som i løpet av protein utpakkingen og 2-D-gel-elektroforese, bør alle trinn utføres ved 4 ° C, eller i kulde ved hjelp av is bøtter for å minimalisere proteinnedbrytning, i tillegg til å bruke plugget spisser og slitasje nitril og dekke alle skin for å hindre forurensning av keratin eventuelle flekker skåret ut for påfølgende identifikasjon av massespektrometri. Ved utførelse av protein ekstraksjoner, er det også viktig å vurdere at PMSF har en kort halveringstid i vandige oppløsninger, i henhold til produsentens, derfor 0,1 mM stamløsning i aceton bør gjøres umiddelbart før bruk. Alternativt kan andre serin-hemmere eller protease-inhibitorer som er mer oppløselige og stabile, og mindre toksisk anvendes, selv om vi ikke har testet dem i våre eksperimenter.

    Den lysis buffer som brukes i denne fremgangsmåten ikke inneholder urea, noe som er viktig for oppløseliggjøring for å trekke ut både vandige (cytosoliske) proteiner og mindre løselig proteins, inkludert noen membran proteiner 17. Men, i løpet av prøveopparbeidelse for første-dimensjon isoelektrisk fokusering (trinn 3 av denne protokollen), er prøvene resuspendert i rehydrering buffer som inneholder urea. Andre proteomikk teknikker også innebære tilsvarende behandling 26. Før du følger med rehydrering trinn, virker det som fjerning av materialer forstyrrende eller lavmolekylære urenheter er avgjørende for høy oppløsning, anbefaler vi å bruke 2-D Clean-up Kit i hver protein prøver som resultatene forbedres. Tidligere lasting av prøver for første-dimensjon isoelektrisk fokusering separasjon, sørg for å ha forberedt strimler av trekkpapir riktig størrelse på stripen holdere, da dette er problematisk å kutte riktig størrelse i aseptisk mote på stedet (for trinn 3.4 i denne protokoll).

    Før drive en 2-D SDS-polyakrylamidgel-elektroforese, er det nødvendig å sikre at gelen prosent passer til de forventede størrelser av interesse (en 120,5% i prosent gel av kan løse protein i området fra 14 til 100 kDa). Etter andre dimensjonen gelelektroforese er fullført, kan visualisering av proteiner oppnås ved Coomassie blå eller sølvfarging, sistnevnte farging er mer følsom med deteksjonsgrense er så lav som 0,1 ng / protein / flekk 20.. Protein flekker visualisert med sølvfarging er egnet for videre analyse ved massespektrometri. Imidlertid er det viktig å nevne at sølvfarge løsningen bør ikke inneholde glutaraldehyd siden dette middel kryssbinder med proteiner, og derfor er det ikke er kompatibel med ytterligere massespektrometri-analyse 20.. Alternativt, for å oppdage og kvantifisere forskjellig uttrykt proteiner, en annen gel-basert tilnærming som Todimensjonale-forskjell i Gel elektroforese (2D-DIGE) sammen med automatisert programvare kan brukes. Denne tilnærmingen benytter forskjellige fluorescerende tagger (f.eks Cy 3, 5 og 2) som brukes til å merke prøver og en universell intern standard prior til andre dimensjonen elektroforese overvinne, til en viss grad, ulempene med variasjon og reproduserbarhet av 2-D elektroforese 27. I tillegg kan gelene farges etter den andre dimensjon med SyproRuby, som er en organometallisk ruthenium chelat flekken beregnet for proteomic anvendelser. Det kan påvise protein flekker med lik følsomhet for at sølvfarging, men med større følsomhet enn Coomassie blue. Etter farging gels kan bli fotografert med laserskanner eller transilluminator 28.

    Som konklusjon, beskriver dette video en hel-celle bakteriell protein ekstraksjonsmetode og 2-D-gel-elektroforese metode som kan tillate undersøkelse av globale endringer i proteomet i Burkholderia arter.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgements

    Dette arbeidet ble støttet av en studieplass fra The University of British Columbia (til BV) og tilskudd fra Cystisk Fibrose Canada og kanadiske Institutes of Health Research (til DPS). Vi takker Jacqueline Chung for den første utarbeidelse av protokoller.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
    2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. (2011).
    3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
    4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
    5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
    6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
    7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
    8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
    9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
    10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
    11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
    12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
    13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
    14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
    15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
    16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
    17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
    18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
    19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
    20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
    21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
    22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
    23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
    24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
    25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
    26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
    27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
    28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics