الإجراء لتنمية متعدد عمق التعميم مستعرضة Endothelialized Microchannels على واحد في رقاقة

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وقد تم تطوير منصة microchannels على واحد في رقاقة من قبل مجموعة من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics. منصة microchannels endothelialized يحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) هندسة في الجسم الحي microvessels، يعمل تحت رقابة تدفق نضح المستمر، ويسمح للتصوير عالية الجودة في الوقت الحقيقي، ويمكن تطبيقها للبحوث الاوعية الدموية الدقيقة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد تركزت الجهود على تطوير في فحوصات المختبر لدراسة microvessels لأن الدراسات على الحيوانات في الجسم الحي تستغرق وقتا طويلا أكثر، ومكلفة، والمراقبة والقياس الكمي هي صعبة للغاية. ومع ذلك، التقليدية في المختبر فحوصات microvessel لها حدود عندما تمثل في الجسم الحي microvessels فيما يتعلق ثلاثي الأبعاد (3D) الهندسة، وتوفير تدفق السوائل المستمر. باستخدام مزيج من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics، قمنا بتطوير متعدد عمق دائرية endothelialized مستعرضة microchannels على واحد في رقاقة، الذي يحاكي الهندسة 3D من microvessels في الجسم الحي ويعمل تحت نضح المستمر للرقابة التدفق. تم استخدام مقاومة للضوء reflowable إيجابية لافتعال القالب الرئيسي مع شبكة متناهية مستعرضة نصف دائري. من المواءمة والربط بين الاثنين polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels REPLicated من القالب الرئيسي، تم إنشاء شبكة متناهية أسطواني. يمكن للأقطار و microchannels يكون تسيطر عليها بشكل جيد. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت السري الوريد الخلايا الأولية البطانية الإنسان (HUVECs) المصنفة داخل الرقاقة أن الخلايا تصطف على السطح الداخلي للو microchannels تحت نضح رقابة دائمة لفترة زمنية ما بين 4 أيام إلى 2 أسابيع.

Introduction

Microvessels، كجزء من نظام الدورة الدموية، وتوسط التفاعلات بين الدم والأنسجة، ودعم الأنشطة الأيضية، وتحديد المكروية الأنسجة، وتلعب دورا حاسما في العديد من الظروف الصحية والمرضية. خلاصة من microvessels وظيفية في المختبر يمكن أن توفر منبرا لدراسة الظواهر الأوعية الدموية المعقدة. ومع ذلك، التقليدية في المختبر microvessel المقايسات، مثل البطانية المقايسات خلية الهجرة، البطانية المقايسات تشكيل أنبوب، والجرذان والفئران الأبهر المقايسات حلقة، غير قادر على إعادة إنشاء في الجسم الحي microvessels فيما يتعلق ثلاثي الأبعاد (3D) الهندسة والتحكم في التدفق المستمر 1-8. دراسات من microvessels باستخدام نماذج حيوانية والمقايسات في الجسم الحي، مثل القرنية فحص الأوعية الدموية، فرخ مشيمائي غشاء فحص الأوعية الدموية، ومقايسة Matrigel المكونات، هي أكثر استهلاكا للوقت، وارتفاع في التكلفة، مما يشكل تحديا فيما يتعلق المراقبة وquantifications، ورفع القضايا الأخلاقية 1، 9-13.

وقد مكنت التطورات في micromanufacturing وتقنيات شرائح ميكروفلويديك مجموعة متنوعة من نظرة ثاقبة العلوم الطبية الحيوية بينما الحد من تكاليف التجريبية العالية والتعقيدات المرتبطة مع الحيوانات في الجسم الحي والدراسات 14، مثل الظروف البيولوجية السيطرة عليها بسهولة وبإحكام والبيئات فلويديك الحيوية، والتي لن يكون كان ممكن مع التقنيات التقليدية macroscale.

هنا، فإننا نقدم هذا النهج لبناء endothelialized microchannels على واحد في رقاقة الذي يحاكي الهندسة 3D في الجسم الحي من microvessels ويعمل تحت رقابة تدفق نضح المستمر باستخدام مزيج من الفوتوليتوغرافية تقنية reflowable مقاومة للضوء، والطباعة الحجرية الناعمة، وعلى microfluidics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تلفيق ضوئيه من مقلب ماستر الواقي الضوئي

ويبين البروتوكول التالية العملية الى افتعال و microchannels مع أقطار بين 30-60 ميكرومتر. للحصول على متناهية التي يبلغ قطرها أصغر (أقل من 30 ميكرون)، واحدة تدور طلاء مقاوم الضوء هو مطلوب.

  1. نقل مقاومة للضوء إنحسر من الثلاجة عند 4 درجة مئوية لغرف الأبحاث 24 ساعة قبل استخدامها والسماح لها لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. تنظيف رقاقة السيليكون و خبز للموارد البشرية واحدة على 150 درجة مئوية لتمكينه من يذوى. فإن الجفاف مساعدة التصاق مقاومة للضوء إلى الركيزة السيليكون.
  3. تدور معطف الطبقة الأولى من مقاومة للضوء باستخدام الوصفة التالية:
خطوة الوقت (ثانية) السرعة (دورة في الدقيقة) تسارع
1 2 </ TD> 300 أعلى
2 10 0
3 3 300 أعلى
4 60 600 أعلى
5 10 500 أعلى
6 10 600 أعلى
  1. ثم، خبز الرقاقة على موقد مع درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. بعد خبز لينة سمك مقاومة للضوء ستكون 20-30 ميكرومتر.
  2. تدور معطف طبقة ثانية من مقاومة للضوء باتباع نفس الوصفة تستخدم للطبقة الأولى.
  3. لينة خبز الرقاقة مرة أخرى عن طريق وضعها على موقد مع درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. بعد هذا خبز لينة سمك مقاومة للضوء ستكون 40-60 ميكرومتر.
  4. توليد أنماط رئيسية إيجابية من خلال تعريض photoresist لضوء الأشعة فوق البنفسجية مع جرعة التعرض من 14،500 ميغا جول / سم 2 من خلال قناع الفيلم.
  5. تمييع المطور مع منزوع الأيونات (DI) الماء (1:2 (V / V)). شطف الرقاقة مرارا وتكرارا في حل حتى يتم تطوير هذا النمط تماما. ثم تغسل الرقاقة بالماء DI وجففها باستخدام غاز النيتروجين.
  6. إنحسر: مكان الرقاقة على موقد مع درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، وتغطي مع صحن من الزجاج بيتري لمنع تبخر المذيبات. إزالة الرقاقة من موقد والسماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. فإن سماكة مقاومة للضوء بعد إنحسر تكون 50-60 ميكرومتر.

2. لينة تلفيق الطباعة الحجرية من PDMS شبكة متناهية

  1. إعداد polydimethylsiloxane (PDMS) حل في نسبة الوزن 10:1 (قاعدة: وكيل علاج) ويخلط جيدا باستخدام خلاط الطرد المركزي الكواكب.
  2. يلقي حل PDMS على reflowed مقاومة للضوء القالب الرئيسي. ضع PDMS مسبوكة في مجفف لمدة 15 دقيقة لديغا. استخدام غاز النيتروجين لإزالة أي فقاعات المتبقية إذا لزم الأمر.
  3. خبز PDMS في فرن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3 دقائق للسماح لها علاج. ثم إزالة طبقة PDMS شفي من القالب الرئيسي.
  4. استخدام الناخس شحذ لإنشاء مدخل / مخرج الثقوب بواسطة اللكم ثقوب في شبكة القناة. تنظيف سطح PDMS باستخدام غاز النيتروجين.
  5. علاج طبقتين PDMS مع البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية داخل نظافة البلازما عند ضغط التشغيل من 4.5 × 10 -2 عربة ومعدل تدفق الأوكسجين من 3.5 قدم 3 / دقيقة. ثم، محاذاة السطوح من PDMS يدويا تحت المجهر الضوئي. استخدام قطرة ماء إذا لزم الأمر للحصول على تحكم أفضل من المحاذاة.
  6. خبز الجهاز في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحقيق الترابط دائم.

3. الثقافة HUVEC والبذر في رقاقة

  1. ثقافة HUVECs مع الثقافة المتوسطة مع الجلوتامين L-تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). عن الاستخدمت البريد الممرات التجربة بين 2 و 5.
  2. مرة واحدة في HUVECs هي متكدسة، عد الخلايا وحصادها من قبل الشطف الأولى الخلايا مع HEPES مخزنة محلول ملحي (HEPES-BSS)، ثم علاج الخلايا مع التربسين / EDTA واحتضان لمدة 2-6 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد trypsinization كاملة، تحييد التربسين / EDTA مع التربسين حل تحييد. أجهزة الطرد المركزي وتعليق الخلايا في مستنبت مع 8٪ ديكستران لجمعها. تم استخدام ديكستران لزيادة اللزوجة المتوسطة للمساعدة في أفضل البذر الخلية والمرفقات.
  3. علاج الجهاز مع البلازما الأكسجين لمدة 5 دقائق مع ضغط التشغيل من 4.5 × 10 -2 عربة ومعدل تدفق الأوكسجين من 3.5 قدم 3 / دقيقة. ثم تحميل الجهاز مع الماء DI وعلاج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 8 ساعة في الصفحي هود للسلامة الأحيائية التعقيم.
  4. قبل يوم واحد من الخلايا جاهزة، وغسل الجهاز مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (1X PBS) ثم معطف مع فبرونيكتين (100 ميكروغرام / مل، ديلuted مع 1X PBS)، واحتضان في الثلاجة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  5. بعد طلاء فبرونيكتين، وغسل الجهاز مع 1X PBS ثم تحميل مع الثقافة المتوسطة. احتضان الجهاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. تحميل الخلايا HUVEC في 8٪ ديكستران مستنبت مع تركيز الخلية من 3-4 × 10 6 خلية / مل. وضع 20 قطرات ميكرولتر من الخلايا في مدخل واحد للجهاز وإمالتها لإدخال الخلايا في قناة ميكروفلويديك. بعد 15-20 دقيقة وسوف تبدأ الخلايا لنعلق على الجدران الجانبية من القنوات. قم بتدوير الجهاز كل 15 دقيقة لإنشاء توزيع أكثر تجانسا من الخلايا. إذا لزم الأمر، وتحميل إضافية لا يمكن أن يؤديها.

4. إعداد الإرواء طويلة الأجل

بعد 5-6 ساعة من ثقافة ساكنة، وسوف تبدأ HUVECs المرفقة لنشر بشكل كامل. إعداد نضح باستخدام نظام للرقابة ضخ حقنة بعيد مع تدفق مستمر من 10 ميكرولتر / ساعة. نضح يمكن تعديلها وأو معدل تدفق أعلى، ويمكن أن تستمر لفترة زمنية ما بين 4 أيام إلى 2 أسابيع.

5. تلوين الخلية وتوصيف مجهر

  1. عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا داخل الجهاز، أولا، وغسل الجهاز مع 1X PBS لإزالة بدقة متوسطة. ثم تحميل الجهاز مع صبغة حمراء المخفف مع مخفف (4 ميكرولتر-1 مل). تحميل صبغ مماثلة للإجراء التحميل الخلية. احتضان الجهاز في الظلام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل الجهاز مع مستنبت لوقف تلطيخ. حضانة طويلة من الصبغة يمكن أن يسبب السمية الخلوية وdisadhesion.
  2. تحميل الجهاز مع صبغة زرقاء المخفف مع 1X PBS (2 قطرات لكل مل). احتضان في الظلام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل جيدا الجهاز مع 1X PBS.
  3. دراسة تلوين الخلية تحت المجهر الضوئي المقلوب. إذا كان تلطيخ كانت جيدة، تحميل و microchannels مع تحديد المتوسطة (3.5٪ بارافورمالدهيد المخفف مع 1X PBS)، ثم يغرقالجهاز في تحديد المتوسطة وتغطية تماما مع رقائق الألومنيوم. حافظ على بقاء الجهاز في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمنع الجهاز من الجفاف وphotobleaching. الجهاز الثابتة هو الآن جاهزة للتصوير متحد البؤر، والتي يمكن أن يتم عن طريق المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نهجنا لافتعال شبكة متناهية متعدد عمق يحاكي هندستها 3D المعقدة في الجسم الحي microvessels، التي اعتقلت و microchannels المقاطع العرضية 15. بالإضافة إلى ذلك، بأقطار من القنوات المتفرعة الأم والقنوات ابنة طاعة حوالي القانون موراي للحفاظ على تدفق السوائل في المستوى المطلوب بحيث مقاومة القناة العامة منخفضة وسرعات تدفق أكثر موحدة في جميع أنحاء الشبكة 16-18. وقد أثبتت العمليات والنتائج لاختلاق نصف دائري مقاوم الضوء القالب الرئيسي ومستعرضة PDMS شبكة متناهية دائرية في الفيلم 1، الشكل 2، وفيلم 2، على التوالي. واتسمت ملامح الهندسي للشبكة متناهية PDMS ومبين في الشكل 2. نتائجنا تظهر أن التقنية إنحسر مقاومة للضوء يمكن أن تخلق متعدد عمق شبكات قناة المتفرعة أناNA نهج أكثر ملاءمة من خلال تقنيات إنحسر مقاومة للضوء، ويسمح تصميم النظم بيوميمتيك الاوعية الدموية الدقيقة التي تطيع ما يقرب من قانون موراي.

في العديد من نماذج في المختبر، يتم استزراع خلايا الأوعية الدموية عادة على لوحات مستو، والمرشحات، أو هذه ركائز المغلفة مع الهلاميات المائية. في ظل هذه الظروف يتم إنشاء microvessels بشكل عشوائي من قبل الخلوية التجميع الذاتي. وبالإضافة إلى ذلك، المقايسات التقليدية الصعوبات الكامنة في تحقيق تدفق مستمر على الخلايا البطانية. عدم وجود تدفق وسائل الاعلام على المدى الطويل والمستمر يمنع القدرة على الحفاظ على استقرار أحادي الطبقة الخلية البطانية مع وظائف حاجز المناسبة. في نموذجنا، والاستفادة من تطبيق على microfluidics هو الراحة للوصول السوائل والتحكم (تفاوت معدلات تدفق ومدته وأنماط)، وكذلك التخلص من النفايات. ونحن لشرح عمليات السري الخلايا الأولية الوريد الإنسان البطانية (HUVECs) البذر في و microchannels وتعيين تينغ نظام نضح السوائل طويلة الأجل لزراعة الخلايا (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، وذلك بسبب هندستها معقدة من الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي، ورصد في الوقت الحقيقي من تلك السفن الصغيرة أمر صعب. وضعت رقاقة القائم على PDMS يوفر الخصائص البصرية جيدة ويسمح للتصوير عالي الجودة والوقت الحقيقي للو microchannels endothelialized. (الشكلان 4 و فيلم 3)

الفيلم 1. إجراءات تلفيق التخطيطي لقوالب ماستر مقاومة للضوء. في البداية، تم إعداد الركيزة السيليكون قبل تنظيفها. كانت إيجابية طبقة مقاومة للضوء إنحسر تدور المغلفة على الركيزة السيليكون وكان يخبز ويجفف. تعرضت مقاومة للضوء إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع منقوشة، وبعد ذلك، تم تطوير و microchannels منقوشة. وأنشئت شبكة متناهية مستعرضة الهلالية بعد إنحسر في 120 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.movie1.wmv "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

الشكل 1
الشكل 1. SEM يظهر مقاومة للضوء وضعت) قبل إنحسر؛ ب) بعد إنحسر؛ ج) مصبوب PDMS يظهر المقطع العرضي للمقاومة قبل الإنحسار؛ يظهر في الصورة مقطع عرضي مستطيل؛ د) مصبوب PDMS يظهر المقطع العرضي نصف دائري لل مقاومة بعد الإنحسار؛ وتمت السيطرة على المقطع العرضي بعد إنحسر من خلال تصميم البعد الأولي للنمط ودرجة الحرارة إنحسر. (أعيد طبعها بإذن من المرجع 15). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

2 فيلم. الإجراءات تلفيق التخطيطي لشبكة متناهية أسطواني في الحركة الديمقراطية الشعبية S. كان يلقي حل PDMS على القالب مقاومة للضوء ومملح في الفرن عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. هي التي تنسجم اثنين متطابقة طبقات PDMS الشفاء، كل واحدة منها لديها شبكة متناهية مستعرضة نصف دائري، والالتصاق مع بعضها البعض لتشكيل microchannels مع مقاطع عرضية دائرية. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .

الشكل 2
الشكل 2. أ) وجود شبكة متناهية أسطواني محاذاة والمستعبدين في PDMS. دينار بحريني) التعميم المقاطع العرضية من قوالب PDMS تظهر أبعاد قناة في كل مستوى المتفرعة (1-1 '، 2-2'، و3-3). وبالإضافة إلى ذلك، تظهر هذه الأرقام خلق multidepth دائرية مستعرضة شبكة قناة ميكروفلويديك على multibranching و.

الصفحة = "دائما"> الشكل (3)
الشكل (3). رسم تخطيطي يبين نضح طويل الأجل من خلال رقاقة باستخدام مضخة محقنة التحكم فيها عن بعد.

الشكل 4
الشكل 4. الصور المجهري باستخدام فلوري غشاء الخلية صبغ (الحمراء)، وصبغ النووية (الأزرق) تظهر الخلية أن خط HUVECs السطح الداخلي للشبكة متناهية أسطواني في المناطق المتفرعة مختلفة. أ) الأعلى، ب) الأوسط، وج) فرق القاع. د) يظهر صورة الفحص المجهري متحد البؤر رأي مستعرضة دائرية من HUVECs المبطنة للقناة شبكة. أشرطة النطاق: 100 ميكرون.

فيلم 3. فيلم متحد البؤر تبين بطانة الخلية على طول قناة شبكة دائرية.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv ​​"الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. القالب الرئيسي تلفيق

واحدة من المبادئ التوجيهية لتصميم وقياس الأشكال الأوعية الدموية يعرف باسم قانون موراي 16، التي تنص على أن توزيع بأقطار السفينة في جميع أنحاء الشبكة تحكمه النظر الطاقة الحد الأدنى. كما تنص الاتفاقية على أن المكعب من أقطار سفينة الأم في التشعب يساوي مجموع مكعبات من أقطار الأوعية ابنة ( المعادلة 1 ) 19 بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام القانون بوازوي لتقدير حجم إجهاد القص في معظم الأوعية الدموية كما المعادلة 2 . التي1eq3.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "العرض =" 25px "/> هو إجهاد القص الدورة الدموية، μ هو لزوجة الدم، Q هي معدل التدفق، وR هو نصف قطر سفينة 20،21. للالتشعبات متماثل، نتيجة هامة يستند إلى القانون موراي والقانون بوازوي هو أن إجهاد القص الجدار لا تزال مستمرة في جميع أنحاء شبكة الأوعية الدموية، وبالتالي لشبكة قناة ميكروفلويديك متماثل ملفقة مع التعميم المقاطع العرضية، وإذا كانت قناة أبعاد على القانون التشعبات أطيعوا موراي، ينبغي أن إجهاد القص التي تعيشها الخلايا البطانية تكون ثابتة في القنوات المتفرعة مختلفة.

تم تطبيق العديد من التقنيات والعمليات التصنيع الدقيق لتصنيع microchannels المستخدمة لخلايا الأوعية الدموية 22-25، ومع ذلك، أدت و microchannels مما أدى إلى مستطيلة، مربعة أو شبه منحرف المقاطع العرضية من القنوات. ومستطيلة المقاطع العرضية من القنوات يخدعstructed مع زوايا حادة والتحولات المفاجئة في التشعبات، والتي يمكن فرض متفاوتة على نطاق واسع اجهادات القص السوائل وهندستها nonphysiological على الخلايا في وظائف قناة مختلفة، مما أدى إلى تغيرات في الخلية الفيزيولوجيا 26،27.

عملية إنحسر مقاومة للضوء، مما أدى إلى الملف الشخصي قناة مدورة، تنطوي على اثنين من الإجراءات، 1) ذوبان مقاومة للضوء منقوشة وسائل مقاومة الأسطح يتم سحبها في شكل مما يقلل من الطاقة النظام 28،29 و2) التبريد و مرحلة التصلب يتبع عملية الصهر. الأشكال من القنوات reflowed ما يتم تقريب جيدا من قبل على سطح semicylindrical. تليها reflowed القالب الرئيسي تلفيق، تم استخدام نهج الطباعة الحجرية الناعمة القياسية لافتعال شبكة PDMS ميكروفلويديك قناة مع المقطع العرضي دائري. أظهرت نتائجنا أن تقنية إنحسر مقاومة للضوء يمكن أن تخلق متعدد عمق المتفرعة شبكات متناهية في أكثر مستقيمار إلى الأمام النهج، ويسمح لنا لتصميم نظم بيوميمتيك الاوعية الدموية الدقيقة التي تطيع ما يقرب من قانون موراي وتحاكي هندسة في الجسم الحي الأوعية الدموية الدقيقة، بحيث مقاومة القناة العامة منخفضة، والتغيرات إجهاد القص عند مستويات المتفرعة مختلفة يمكن التقليل في ملفقة شبكة قناة ميكروفلويديك.

وmicrovessels الدم الفسيولوجية اعتماد المقطع العرضي دائري تقريبا مع كعبرة بين 30-300 ميكرون 30. واختلفت أبعاد لشبكة متناهية أظهر في هذه الورقة حوالي 60 ميكرون إلى 100 ميكرون في مستويات مختلفة المتفرعة. الى افتعال microchannels مع مجموعة مختلفة من أقطار لمحاكاة في الجسم الحي microvessels، ونحن نوصي لاستخدام واحدة شباك إنحسر طبقة مقاومة (محدودة إلى 30 ميكرون) أو يقاوم الأخرى اللزوجة أقل. لمتناهية التي يبلغ قطرها أكبر (30-60 ميكرون)، وهو إجراء انقر نقرا مزدوجا طلاء يمكن تطبيقها للحصول على فيلم مقاوم الضوء سمكا15. إضافية تدور طلاء طبقتين أعلاه يجب تجنبها لمنع غير منتظم سماكة الفيلم، الذي يمكن أن يؤدي إلى جرعة التعرض غير دقيقة. لسماكة الفيلم أكثر من 60 ميكرون، وينصح أخرى أعلى مقاومات الضوء إنحسر لزج.

في حالة مثالية، الى افتعال مقاومة العفن مع المقطع العرضي نصف دائري، وسمك الفيلم يمكن أن تكون محددة سلفا في البداية من خلال إعطاء العرض المطلوب والبعد البؤري للمتناهية كما المعادلة 4 ، حيث H هو المطلوب سمك نسج الفيلم، R هو نصف عرض القناة، R هو نصف قطر ثابت للانحناء، H هو ارتفاع المركزي للانحناء، وE هو نسبة مقاومة أحجام متناهية قبل وبعد الإنحسار 31. لسطح أسطواني بعرض معين من متناهية، واحد حجم معين من مقاومة هو إعادةالالزمة. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن العديد من المعلمات أن تؤثر على مقاومة للضوء reflowed وجعل قناة الملامح أدى أكثر تعقيدا، مثل الزاوية الحرجة وحركة الحدود بين مقاومة للضوء والركيزة الصلبة، تبخر مادة الخبز خلال إنحسر، ودرجة الحرارة والتوقيت لعملية إنحسر، إطلاق الغازات، والتوحيد الركيزة، ومقاومة خصائص 32-34. على سبيل المثال، يمكن لدرجة الحرارة إنحسر وتوقيت يؤدي إلى تغيير حجم مما تسبب في حركة الحدود وبالتالي متفاوتة الزاوية الحرجة والنهائية reflowed مقاومة الملف الشخصي 33. كما ذكرت من قبل عملنا السابق 15، وانخفضت عملية إنحسر بعرض قناة بنسبة 2٪ في المتوسط ​​بسبب حجم التخفيضات مقاومة للضوء والحركة الحدود. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حجم من أجل الحصول على سطح أسطواني يحتاج إلى جعل بدل للتأثير التبخر المواد أثناء عملية إنحسر 35،36. إذا كانت هناك حاجة السطوح الاسطوانية مع أنصاف الأقطار المختلفة من خلالشبكة متناهية فمن الضروري أن تختلف عرض و microchannels، مما أدى إلى اختلافات في وحدات التخزين في مناطق مختلفة في الشبكة 15. الى افتعال بنجاح شبكة قناة أسطواني بأقطار مختلفة، يقاوم الاعراض / وحدات التخزين، ودرجات الحرارة إنحسر وتوقيت، وزوايا حرجة، حركة الحدود، ومقاومة اللزوجة والبروتوكولات طلاء زيادة ونقصان، وخصائص الركيزة يجب النظر واختبار.

2. زراعة الخلايا على المدى الطويل

وقد تم التعرف على أهمية تدفق ويرتبط بها جدار إجهاد القص بشكل جيد في تنظيم البيولوجيا البطانية. وقد شوهد ذلك في مجالات مثل إحداث تغييرات في شكل الخلية والتوجه، وإفراز وتنظيم وانتشارها وتمايز، مما يشير إلى داخل الخلايا، وإنتاج البروتين الهيكل الخلوي والتعبير الجيني، والنضج السفينة والهيكل، وظائف حاجز 37-47. الحالي في أساليب المختبر لتشكيل نهايةأنابيب othelial تعتمد عموما على الخلايا البطانية '(ECS) التنظيم الذاتي مع أو بدون خلايا اللحمة المتوسطة في المصفوفة خارج الخلية (ECM) (النوع الأول الكولاجين، الفيبرين، أو Matrigel) 48-54. على الرغم من أن هذه الثقافات وعلى غرار العديد من السلوكيات بنجاح الاوعية الدموية الدقيقة، الأوعية الاصطناعية تتكون من خلال عملية عشوائية من التشكل تفتقر إلى استنساخ والتوجه المكاني المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير تدفق على الاستقرار الاوعية الدموية الدقيقة ما زال مجهولا إلى حد كبير لأن هذه السفن الذاتي تجميعها لا تجمع بين سهولة تدفق اللمعية مع منظمة أنبوبي 3D 55، مما يشكل تحديا للالأوعية الدموية هندسية لحاجز لها وظائف الأوعية الدموية والاستقرار على المدى الطويل.

وقد أثبتت أنظمة ميكروفلويديك أن تكون عملية ومفيدة لإدخال التدفقات إلى مجموعة متنوعة من تحليل الكيمياء الحيوية والبيولوجية 56،57. نهجنا يوفر وسيلة مريحة لتقديم تدفق السوائل خلال الخلايا المستزرعة. استخدمنامتقدمة عن بعد ضخ حقنة للرقابة لتحقيق التحكم في التدفق مريحة حتى الآن ثابتة ودقيقة من خلال و microchannels لزراعة الخلايا على المدى الطويل (بين 4 أيام و 2 أسابيع).

3. ثقافة خلية في رقاقة

أكسدة البلازما بمساعدة من و microchannels PDMS يدخل مجموعات silanol (SiOH) على السطوح مما يجعل سطح ماء ويساعد في مزيد من طلاء البروتين. تم اختبار البروتينات ECM مختلفة (فبرونيكتين، والجيلاتين، والكولاجين) لمرفق الخلية، ولم يتم العثور على أفضل نتيجة ليكون طلاء فبرونيكتين. أعدت HUVECs بتركيز 3 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام ثقافة تستكمل مع 8٪ ديكستران (70 كيلو دالتون) للبذار. ديكستران يزيد من اللزوجة من وسائل الإعلام لتمكين دفع غرامة السيطرة على كثافة البذر ECS.

وقد وضعت أحادي الطبقة متموجة بين 2-4 أيام للHUVECs يتعرض إلى تدفق ثابت المتوسطة. لتصور الخلايا بعدخلية ثقافة، ونحن الخلايا المسمى مع تلطيخ غشاء الأصباغ وتلطيخ النوى، عرضت هذه الأصباغ أقل سمية للخلايا 58. نحن ملطخة الخلايا باعتباره أحادي الطبقة ملتصقة تربيتها في رقاقة. A كاملة 1X PBS غسل ضروري لمنع الأصباغ اضافية محاصرين داخل الرقاقة.

في ملخص، من خلال الجمع بين تقنية إنحسر مقاومة للضوء وتكرار PDMS، كان يقترب من شبكة متناهية متعدد عمق تطويرها من قبل سطح دائري وبأقطار قناة في كل التشعب طاعة حوالي القانون موراي. الاختلافات إجهاد القص على مستويات مختلفة المتفرعة يمكن التقليل في شبكة قناة ميكروفلويديك ملفقة. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت النتائج من ثقافة خلية حالة صحية من الخلايا البطانية. وهكذا، و microchannels على واحد في رقاقة endothelialized نموا يوفر نهجا السريع وقابلة للتكرار لإنشاء دائرية مستعرضة متعددة المتفرعة وشبكات متناهية multidepth، الذي يحاكيهندسة في الجسم الحي microvessels. يوضح الإجراء استخدام قدرات فريدة من نوعها في micromanufacturing والتقنيات المتطورة ميكروفلويديك لخلق نموذج الأوعية الدموية الدقيقة مع طويلة الأمد، ومراقبة نضح المستمر وكذلك عالية الجودة في الوقت الحقيقي والقدرة على التصوير. مع الأداة المساعدة متزايد من القنوات ميكروفلويديك للبيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة، وتطبيقات الهندسة الحيوية، و microchannels على واحد في رقاقة endothelialized هو مقايسة المحتملة للبحوث الاوعية الدموية الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (NSF 1227359)، وفو برنامج EPSCoR بتمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (EPS-1003907)، مكتب ADVANCE وفو برعاية مؤسسة العلوم الوطنية (1007978)، ووفو PSCoR، على التوالي. تم إنجاز العمل في التصنيع الدقيق وفو مرافق البحوث المشتركة (مرافق غرف الأبحاث) وميكروفلويديك البحوث الخلوية تكاملية على مختبر رقاقة (رقاقة مختبر) في جامعة وست فرجينيا. وقد تم التصوير متحد البؤر في وفو مرفق التصوير المجهر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. 1st edition, Biota Publishing. (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. Springer. (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40, (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14, (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9, (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78, (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46, (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39, (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
  31. O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. VCH Publishers. New York. (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316, (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104, (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87, (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4, (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (12), 5133-5138 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics