发展多深的圆形横截面微内皮化的一个芯片的程序

Bioengineering

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Summary

Â微通道上的一个芯片平台开发回流焊的光致抗蚀剂光刻技术,软光刻技术和微流体的结合。模拟的三维(3D)的几何形状在体内微血管内皮化的微通道平台,控制连续灌注流量下运行,允许高品质和实时成像,并可以应用对微血管研究。

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Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).

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Abstract

努力一直专注于发 ​​展在体外实验研究微血管,因为动物体内研究更费时,昂贵,观察和量化是非常具有挑战性的。然而,传统的在体外微血管检测体内微血管代表相对于三维(3D)的几何形状,并提供连续的流体流动的限制。使用回流焊的光致抗蚀剂光刻技术,软光刻技术,以及微流控芯片的组合,我们已经制定了多深的圆形横截面内皮化微的芯片,它模仿3D几何体内微血管和运行控制连续灌注下流程。使用了一个正的回流的光致抗蚀剂,制作母模的半圆形横截面的微通道网络。由对准和粘接的聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微通道REPL从主模具icated,的圆柱形微通道网络已创建。微通道的直径可以得到很好的控制。此外,原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表明,在芯片内接种细胞排列的微通道的内表面上为4天至2周之间的时间周期根据控制灌注持久。

Introduction

微血管,作为流通体系的一部分,调解血液和组织之间的相互作用,支持新陈代谢活动,定义组织微环境,在许多健康和病理条件下发挥了关键作用。再演在体外的功能微血管提供了一个平台,为研究复杂的血管现象。然而,传统的在体外微血管检测,如内皮细胞迁移测定,内皮细胞管腔形成的测定中,大鼠和小鼠的主动脉环测定,无法重新创建的三维(3D)的几何形状和连续的流量控制相对于体内微血管1-8。微血管的研究使用的动物模型中和在体内测定,如角膜血管生成法,鸡胚尿囊膜血管生成实验,Matrigel栓实验,是更费时,成本高,相对于观察和量化挑战,并引发伦理问题1,9-13。

显微制造和微流控芯片技术的进展已启用了各种各样的见解,到生物医学科学在削减高的实验与动物体内研究,如容易和严格控制的生物条件和动态流体环境中,不会有相关的成本和复杂性的同时一直未能与传统的大容量的技术。

在这里,我们提出了一种方法来构建内皮化微通道上的单芯片模拟3D几何体内微血管和控制的连续灌流采用回流焊的光致抗蚀剂光刻技术,软光刻技术和微流体的结合下运行。

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Protocol

1。光致抗蚀剂光刻制作模具师傅

以下协议显示制程制作的微通道直径在30-60微米之间。为了得到一个更小的直径(小于30微米),一个单一的光致抗蚀剂的旋涂的微通道是必要的。

  1. 转移从冰箱中在4℃下回流的光致抗蚀剂的洁净室在使用前24小时,并允许其升温至室温。
  2. 清洁硅片上并烘烤1小时,在150℃下使其脱水。脱水将协助光致抗蚀剂的硅衬底的粘附性。
  3. 旋涂第一层的光致抗蚀剂中使用下述配方:
步骤 时间(秒) 转速(rpm) 促进
1 2 </ TD> 300 最高
2 10 0
3 3 300 最高
4 60 600 最高
5 10 500 最高
6 10 600 最高
  1. 然后,在加热板上的温度为110℃,持续90秒烘烤晶片。软后烘烤的光致抗蚀剂的厚度是20-30微米。
  2. 旋涂光致抗蚀剂后,使用相同的配方,用于第一层的第二层。
  3. 软烤晶片,再通过将其放置在加热板上,在110℃的温度下,持续90秒。在此之后软烘焙光致抗蚀剂的厚度是40-60微米。
  4. 产生正面主图案露出photorESIST 14500兆焦耳/厘米2的曝光量,通过UV光的膜掩模。
  5. 稀释用的去离子(DI)水(1:2(体积/体积))的显影剂。重复冲洗晶片,在溶液中,直至图案被充分发展。然后用去离子水清洗晶圆,使用氮气和干燥。
  6. 回流焊:晶片放置在加热板上,用温度为120℃,4分钟和盖的玻璃培养皿中,以防止溶剂蒸发。从加热板上取下晶片,并使其冷却至室温。回流焊后的光致抗蚀剂的厚度为50-60微米。

2。软光刻技术制作PDMS微通道网络

  1. 准备按重量比为10:1(基料:固化剂)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)的解决方案,彻底混合使用行星离心混合器。
  2. 到回流的光致抗蚀剂母模铸造的PDMS解决方案。在干燥器中15分钟进行脱气,将浇铸的硅橡胶。使用氮气,以去除任何剩余的气泡,如果必要的。
  3. 烤的PDMS在烘箱中在60℃的温度下3小时,以允许其固化。从主模,然后取出固化硅橡胶层。
  4. 使用削尖的打孔器,创建入口/出口孔打孔渠道网络。使用氮气清洁的PDMS表面。
  5. 30秒内的等离子清洗机在操作压力4.5×10 -2乇,氧流量为3.5英尺3 /分氧等离子体处理将两个PDMS层。然后,对准的PDMS表面,在光学显微镜下手动。使用一滴水,如果需要更好地控制对齐。
  6. 烘烤设备,在烘箱中在60℃下30分钟,以实现永久性粘接。

3。脐静脉内皮细胞的培养和幼苗在芯片

  1. 培养的人脐静脉内皮细胞与培养液中补充10%胎牛血清(FBS),L-谷氨酰胺的。日ê实验2和5之间的通道被使用。
  2. 一旦融合的人脐静脉内皮细胞,计数细胞,收获他们首先用HEPES缓冲盐溶液(HEPES-BSS)冲洗细胞,然后把细胞用胰蛋白酶/ EDTA和孵育在37℃下2-6分钟胰蛋白酶消化完成后,用胰蛋白酶中和溶液中的胰蛋白酶/ EDTA。离心,悬浮细胞培养基中的8%右旋糖酐收集它们。葡聚糖用于增加介质的粘度,以帮助更好的细胞播种和附件。
  3. 治疗设备5分钟,操作压力为4.5×10 -2乇和氧流速为3.5英尺3 /分钟的氧等离子体。然后加载装置与去离子水,并用UV光8小时在层的生物安全罩进行杀菌处理。
  4. 前一天细胞都准备好了,洗设备1X磷酸盐缓冲液(1X PBS),然后大衣,纤维连接蛋白(100微克/毫升,DILuted用1×PBS中),并在冰箱中在4℃过夜孵育。
  5. 纤连蛋白涂层后,用1×PBS中,然后用培养液加载洗设备。 15分钟,温度为37°C孵育设备。
  6. 负载HUVEC细胞在8%葡聚糖培养基中,细胞浓度为3-4×10 6细胞/ ml。细胞20μl的液滴放置在该设备的一个入口,并倾斜到微流体通道中引入细胞。 15-20分钟后,细胞就会开始附加到通道的侧壁。旋转的移动设备创建一个更均匀的分布,细胞每15分钟。如果有必要,可以进行额外的负荷。

4。长期灌注设定的

所附的人脐静脉内皮细胞静态培养5-6小时后,将开始完全摊开。设置使用远程控制的注射泵系统10微升/小时源源不断的灌注。灌注可以调整的F或更高的流速,并且可以持续4天至2周之间的时间周期。

5。细胞染色和显微镜表征

  1. 当细胞达到汇合里面的设备中,首先,洗涤装置用1x PBS彻底清除介质。稀释剂(4微升1毫升)稀释,用红色的染料,然后加载设备。加载染料的细胞装载过程相似。孵育的移动设备在黑暗中,在室温下5分钟,然后用培养液中洗设备停止染色。潜伏期长的染料可以导致细胞毒性和disadhesion。
  2. 蓝色染料用1×PBS稀释(每毫升含2滴),载入装置。在室温下在黑暗中孵育5分钟,然后彻底清洗装置,用1×PBS。
  3. 一个倒置的光学显微镜下检查细胞染色。如果染色还是不错的,与固定介质加载的微(3.5%多聚甲醛与1X PBS稀释),然后淹没固定介质的设备中,完全覆盖铝箔。将装置存放在冰箱中,在温度为4°C,以防止设备从干燥和漂白。是固定的移动设备现在已准备好用于共焦成像,这可以通过激光扫描共聚焦显微镜。

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Representative Results

我们的方法来制造微通道网络的多深度模仿体内微血管的复杂的三维几何形状,其中的微通道具有圆形横截面15。此外,父分支通道的女儿通道的直径近似服从默里定律保持在所需的水平的流体流动,使整体的流路阻力变低,流动速度更均匀的整个网络16-18。 电影1,图2,电影 ,分别为一个半圆形的光致抗蚀剂制造模具师傅和圆形的横截面PDMS微通道网络的过程和结果进行了论证。 PDMS微通道网络的几何特征,其特征在于, 如图2所示。我们的研究结果表明,光刻胶回流技术,可以创建多深入的分支通道网络,我呐光刻胶回流技术,更方便的方式,让设计的微血管仿生系统近似服从穆雷的律师。

在许多体外模型,血管细胞通常培养在平面板,过滤器,或这些基材涂有凝胶。在这些条件下的微血管通过细胞自组装是随机生成的。此外,传统的检测实现不断流过血管内皮细胞的固有困难。长期的连续媒体流的缺乏阻止的能力,保持适当的屏障功能单层内皮细胞​​的稳定性。在我们的模型中,应用微流体的利益是流体的访问和控制(不同的流速,持续时间和模式),以及摆脱废物的方便。我们证明的过程为主要的人类脐静脉内皮细胞(血管内皮细胞)在微播种,并设置婷长期的细胞培养液灌注系统( 图3)。此外,由于复杂的几何形状在体内的微血管,这些小血管的实时监控是困难的。基于PDMS芯片开发提供了良好的光学性能,并允许高品质和实时成像的内皮化微。 ( 图4电影3)

动画1。示意性光致抗蚀剂的主模具的制造程序的开始时,预先清洗的硅衬底制备。回流的正的光致抗蚀剂层到硅衬底上旋涂并烘烤和干燥。通过图案化掩模的光致抗蚀剂暴露在紫外线下,然后,图案化的微通道。半圆形横截面的微通道网络建立后4分钟,在120℃回流。movie1.wmv“目标=”_blank“>点击这里观看电影。

图1
图1。 SEM观察发现发达的光致抗蚀剂,a)在回流温度,b)在回流温度; 三)成形的PDMS显示在回流前的抗蚀剂的横截面;的图片显示的是矩形横截面)PDMS中示出的半圆形横截面的模制回流后的抗蚀剂,再流焊后的横截面,所控制的初始尺寸的图案和设计的回流温度。 (转载与许可参考15)。 点击这里查看大图

电影2的原理制造程序,在PDM中的的圆柱形微通道网络S。甲PDMS溶液浇铸到光致抗蚀剂的模具,并在烘箱中,在温度为60℃3小时固化。两个相同的固化硅橡胶层,其中有一个半圆形的横截面微通道网络,对齐粘合在一起,形成圆形横截面的微通道。 点击这里观看电影

图2
图2。 a)一个对准和键合的圆筒状的微通道网络在PDMS的BD)PDMS模具的圆形横截面示出在每个分支的电平(1-1',2-2'和3-3')的通道尺寸。此外,这些数字显示了创建一个multibranching multidepth的圆形横截面的微通道网络。

=“总是”> 图3
图3。示意图,示出通过使用远程控制的注射器泵的芯片的长期灌注。

图4
图4。使用荧光细胞膜染料(红色)和细胞核染料(蓝色)表示的脐静脉内皮细胞线的内表面的圆筒状微通道网络在不同的分支区a)俯视,B)中,和c)的底部,D)显微镜图像共聚焦显微镜的图像显示的人脐静脉内皮细胞衬里的通道网络的圆形的横截面视图。比例尺:100微米。

电影3。共聚焦细胞沿圆形衬砌渠道网络电影 。iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv“目标=”_blank“>点击这里观看电影。

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Discussion

1。主模具制造

血管形态计量学的设计和指导原则之一是被称为穆雷的第16条,其中规定,受整个网络分布的血管直径最小能量代价。报告还指出,在分叉的父容器的直径的立方等于总和的女儿血管直径的立方( 公式1 19)此外,泊肃叶定律已被用于估计在大多数的血管的剪切应力的大小,作为公式(2) 。在其中1eq3.jpg“的src =”/ files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg“宽度=”25PX“/>的血流动力学的剪切应力,μ是血液粘度,Q是流率,R为半径的容器20,21。对于对称分岔,默里定律和泊肃叶定律的基础上的一个重要的后果是,整个血管网壁面剪切应力保持恒定,因此,对于制造的对称与圆形横截面的微流体通道网络,如果信道的尺寸,可在分支服从默里的法律,内皮细胞所经历的剪切应力应该是恒定的,在不同的分支通道。

许多微细加工技术和工艺已应用到用于血管细胞22-25的微通道制造的,但是,所得到的微通道,长方形,正方形或梯形横截面的通道。的矩形截面的通道是constructed带尖角和突然转换分岔,,可以并处广泛不同流体剪切应力和非生理性的几何细胞在不同的频道位置,从而导致在细胞生理26,27变化。

一种光致抗蚀剂的回流过程中,产生在一个圆形的通道配置文件,涉及两个程序,1)的图案化的光致抗蚀剂熔化,液体抗蚀剂表面拉入最大限度地减少了系统的能量28,29和2的形状)的冷却和凝固阶段如下熔化过程。回流的通道的形状的半圆柱形的表面上很好地近似。其次回流主模具制造,一个标准的软光刻技术的方法被用来制造一个圆形横截面的PDMS微流体通道网络。我们的研究结果表明,在光致抗蚀剂的再流焊技术可以创建多深入分支微通道网络更straigh吨正向的方法,并允许我们以设计微血管仿生系统约服从默里定律和模仿体内微脉管系统的几何形状,使整体的信道的电阻是低的,和剪切应力的变化不同分支水平可以被最小化在制造的微流体通道网络。

的生理血微血管采用的大致圆形的横截面半径30-300微米之间30。本文展示了微通道网络的尺寸为约60〜100μm的变化在不同的分支水平。要编造模仿体内微血管的直径不同范围的微通道,我们建议使用单纺层回流剂(30微米)或其他较低的粘度抵抗。对于微通道具有较大的直径(30-60微米),双涂覆的方法也可以得到更厚的光致抗蚀剂膜15。附加上述自旋涂料两层应该避免,以防止不均匀的薄膜厚度,这可能会导致不准确的曝光剂量。对于60微米以上的膜厚,其他高粘性回流的光致抗蚀剂的建议。

在理想的条件下,制作抗蚀剂的半圆形横截面的模具,膜厚度可以初步预定给所需的微通道的宽度和焦距式(4) ,其中,H是所需的纺粘膜厚度,r是一半的沟道宽度,R是恒定的曲率半径,h是高度的曲率中心,及E为比之前和之后的抗蚀剂体积的微回流31。对于一个给定的微流路的宽度的圆筒面,一个特定体积的抗蚀剂是重新细部微调。已报道,有几个参数影响回流的光致抗蚀剂,并导致更复杂的信道的档案,如临界角和晶界的移动之间的光致抗蚀剂和固体基材,在回流过程中烘烤,温度和时间的蒸发材料回流过程出气,基板均匀,抵制物业32-34。例如,在回流温度和时间可以导致的体积变化引起的晶界的移动,从而不同的临界角和最终回流光阻配置文件33。正如我们以前的工作15报道,回流过程中的通道宽度减少2%的平均水平,因为光致抗蚀剂的量减少和边界运动。此外,用于得到一个圆筒形表面的体积需要使材料蒸发的效果,在回流焊过程35,36的津贴。如果需要通过不同的半径的圆柱表面与微通道网络是必要的不同的微通道的宽度,导致在网络中的不同的区域15中的卷的变化。要成功地制作出抵抗宽度/卷,回流温度和时间,临界角,边界运动,抗粘度和旋涂协议的,与基板物业必须考虑和测试不同直径的圆柱形通道网络。

2。长期的细胞培养

流量和相关的壁面切应力的重要性已经充分认识到,在调节内皮细胞生物学。这一直被视为领域,如诱导改变细胞的形状和方向,分泌和组织,增殖和分化,细胞内的信号传导,细胞骨架蛋白的生产和基因表达,血管成熟和结构,功能和屏障功能37-47。 体外方法,用于形成端的电流一般othelial管依靠对血管内皮细胞(内皮细胞)的自我组织的间充质细胞在细胞外基质(ECM)的(I型胶原蛋白,纤维蛋白,或基底膜)48-54的有或无。虽然这些文化已经成功建模的几种的微血管行为,通过一个随机过程缺乏所需的空间的重现性和方向的形态形成的人工血管。此外,对微血管稳定流动的影响仍是未知,因为这些自组装船只不容易管腔流相结合的三维管状组织55,工程血管的屏障功能和血管长期稳定构成了挑战。

微流体系统已被证明是实用的和有用的流量引入多种生物化学和生物分析56,57。我们的方法提供了一个方便的方式来介绍流体流量超过所培养的细胞。我们使用了一个先进的远程控制注射泵,实现了便捷而又稳定和​​准确的长期细胞培养(4天,2周之间)的微流控。

3。在芯片的细胞培养

等离子体辅助氧化的PDMS微通道引入的硅烷醇基(SiOH基)的表面上呈现的表面具有亲水性,并且有助于进一步蛋白涂层。不同的细胞外基质蛋白(纤连蛋白,明胶和胶原蛋白)进行了测试的细胞附着,和纤连蛋白涂层被认为是最好的结果。制备在人脐静脉内皮细胞中的浓度为3×10 6个细胞/ ml的培养基中补充了8%葡聚糖(70 kDa)的播种。葡聚糖增加粘度的媒体,使精细控制权播种内皮细胞密度。

融合单层内皮细胞​​被暴露在一个恒定的介质流量的2-4天之间。为了形象化后的细胞细胞培养,我们标记膜染色的细胞和细胞核染色的染料,这些染料具有较低的细胞毒性58。我们在芯片中的单层贴壁培养细胞染色。一个完整的1X PBS清洗是必要的,以防止多余的染料,被困在里面的芯片。

总之,通过回流温度的光致抗蚀剂技术和PDMS复制的组合,研发的多微通道网络的深入近似的圆形表面,并在每个分叉的通道直径近似服从默里定律。在不同的分支水平的剪切应力的变化可以最小化在制造的微流体通道网络。另外,从细胞培养的结果表明内皮细胞的健康状况。因此,开发的内皮化微通道上的一个芯片提供了一种快速,重现性的方法来创建圆形的横截面的多分支和微通道网络multidepth,它模仿体内微血管的几何形状。这个过程说明了如何使用先进的显微制造的独特的功能和微流体技术,创建一个微血管一项长期,连续灌注控制,以及高品质的实时成像能力模型。随着细胞生物学,组织工程,生物工程应用的微流体通道的效用增加,内皮化微单芯片是一种潜在的检测微血管研究。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

部分支持这项研究是由美国国家科学基金会(NSF 1227359),西弗吉尼亚的EPSCoR程序由美国国家科学基金会(EPS-1003907),西弗吉尼亚ADVANCE办公室主办,由美国国家科学基金会(1007978),和WVU PSCoR的分别。 WVU共享研究设施(无尘室设施)和微流控结合蜂窝片上实验室(芯片实验室)在西弗吉尼亚大学的研究工作是在微细。聚焦成像做在WVU显微镜成像设备。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510

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References

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