역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

Published 9/23/2013
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Chemistry

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Summary

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

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Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

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Abstract

방향과 고정 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 빠른 표면 고정화하는 방법은 바이오 센서 및 마이크로 어레이 응용 프로그램에 매우 바람직하다. 이 연구에서, 우리는 TCO / TZ-유도체 분자의 미세 고정을 가능하게하는 매우 효율적인 공유 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)를 사용 . 우리는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 연속적인 유동 조건에서 실시간으로 프로세스를 모니터링한다. 리버시블 고정화를 활성화 센서 표면의 실험 범위를 확장하기 위해, 우리는 고리 화 반응과 비공유 항원 항체 캡처 컴포넌트를 배합. 교대 센서 표면에 TCO 또는 Tz 일 잔기를 제시함으로써, 다 캡처-사이클로 공정은 다 성분 다양한 구조의 온 - 칩 어셈블리와 상호 작용 연구를 위해 하나의 센서면에 지금은 가능하다. 우리 나작은 분자, FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)를 결합 AP1497, 2 개의 바이오 센서 칩에 다른 고정화 실험으로이 방법을 llustrate과 같은 작은 분자 고정화에 현장 기능화 나노 입자의 일환으로.

Introduction

효율적인 결합 반응은 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 표면에 생체 활성 분자를 연결하는 중요한 도구입니다. 최근 매우 빠른 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)은 세포 표면, 세포 내 구조, 항체 및 나노 입자를 레이블로 사용 된 1. - 여기에 7, 우리는 표면 플라스 몬 공명 (SPR)의 상호 작용 분석을위한 다 성분 구조의 가역적 인 온 - 칩 합성 항원 / 항체 캡처 (GST / 안티 GST)와 함께 [4 +2] 고리 화 반응을 사용하여 모니터 실시간 프로세스 (그림 1). 새로운 분석의 다양한 리간드의 방향과 밀도를 제어 안정 센서 표면의 결과, 어셈블리로 8,9 특히, 캡처 - 사이클로 전략 수립 프로토콜을 사용하여 표면의 재생을 가능하게한다. 8 형식은 지금 가능합니다. 사용이 전략은 우리는 TCO / TZ-유도 된 작은 분자의 고정화를 설명하고 버퍼 다양한 조건에서 사이클로 속도를 특징. 우리는 직접 고정 된 GST 항원에 부착 할 때 캡처 - 사이클로 전략 목표와 상호 작용하는 작은 분자의 기능을 유지하는지 확인하기 위해 예를 들어 FKBP12 10-12 바인딩 FKBP12 및 분자 AP1497의 잘 알려진 상호 작용을 선택했다 또는 고정 된 나노 입자 공단에.

이 방법은 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 센서 칩에 작은 분자의 가역적 고정이 가능하게되었습니다. 둘째, 작은 분자의 TCO /는 TZ 고정화는 정식 SPR 연구의 방향을 반전 라벨없는 상호 작용의 연구를 가능하게하고, 결합 상호 작용의 상보적인 뷰를 제공 할 수있다. 셋째,이 방법은 대상 나노 입자의 미세 합성, 그들의 bindin의 즉각적인 평가를 가능하게G 속성. 이는 대상 입자를 평가하거나 선별 효율을 향상시키고, 또한 필요한 나노 입자의 양을 감소 약속한다. 넷째 13-15,이 방법은 연속 흐름 하에서 실시간 bioorthogonal 고리 화 반응의 반응 속도를 측정 할 수있다. 마지막으로, TCO /는 TZ 고정화 화학 혈청의 존재하에 강력하다. 이와 함께, 우리는이 다양한 접근 방식은 크게 생체 외 및 생체 내 세포의 응용 프로그램에서의 관련성과 미세 유체 연구의 다양한 안정 센서 표면의 구축을 용이하게 할 것으로 예상.

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Protocol

1. GST 및 나노 입자 (NP) 결합체의 제조

  1. GST-TCO 준비 :
    1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 100 μL로 TCO-NHS 솔루션의 8 μL (DMSO에 50 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. Zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거합니다. GST-TCO 복합체를 포함하는 복구 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
  2. GST-는 TZ 준비 :
    1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 75 μL에 TZ-NHS 용액을 6 μL (DMF 25 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. PBS 25 μL로 반응 혼합물을 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제. GST-는 TZ 접합체를 포함하는 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
    참고 : 질량 분석 (MALDI-TOF)이 평균 10 ~ Tz 일 또는 TCO 분자가 GST에 접합 된 것으로 나타났다.
  3. NP-TCO 준비 :
    1. 에 TCO-NHS 용액 100 μL (DMSO에 50 mm)를 추가150 아미 노화 나노 입자 (NP-NH 2, PBS에 8.7 밀리그램 철 / ㎖, 3 nm의 철심 ~ 8,000 페 / NP)의 μL와 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. PBS 버퍼로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 과잉 시약을 제거합니다. NP-TCO 제품을 포함하는 컬러 밴드를 수집합니다.
    3. 원심 분리 필터 장치 (100 K MWCO)를 이용하여 ~ 150 μL의 최종 부피로 여과 액을 농축.
    4. NP-TCO 용액에 숙신산 무수물 50 μL, (DMSO 중 0.1 M)를 첨가하고 1 시간 동안 RT에서 동요 (무수물 단자 카르 복실 산을 형성하기 위해 남아있는 아민들과 반응한다.이 덱스 트란 표면에 비특이적 상호 작용을 방지한다).
    5. PBS로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 NP-TCO 생성물을 정제 하였다. 사용하기 전에 4 ° C에서 NP-TCO의 솔루션을 저장합니다.

2. 표면 처리

모든 표면 플라즈몬 공명 분석법에 비아 코어 T100 악기 (GE 헬스 케어)에서 수행됩니다25 ° C는 실행 버퍼로 CM5 센서 칩과 PBS-P를 사용하여 별도의 언급이없는 한. 악기와 함께 제공되는 비아 코어 제어 및 평가 소프트웨어는 실험을 설정하고 데이터를 분석에 이용된다. 두 가지 동작 모드, 응용 프로그램 마법사 및 수동 실행은 표면 처리 및 모니터링 온칩 캡처 - 사이클로 사용됩니다. 방법 빌더 모드는 역방향 방향 결합 실험을 설치와 고리 화 반응 속도를 측정하는데 사용된다. 데이터를 두 번 참조 감산 및 운동 분석이 1:1 랭 뮤어 결합 모델을 사용하여 수행됩니다.

  1. 흐름 세포에 아민 고정화 마법사 템플릿을 선택 고정 1 (참조), 2 (검출)를 사용합니다. 0.4 M EDC의 1:1 용액을 주입하여 표면 카르 복실 그룹을 활성화하는 방법을 수정 아민 : 480 초 동안 0.1 M NHS를 10 μL / 분의 유속. 에서 420 초 접촉 시간에 남아있는 활성 에스테르를 해소하기 위해 에탄올의 주입을 설​​정10 μL / 분의 유속.
  2. 입력 리간드 이름, 항-GST (아세테이트 완충액, pH 5.0으로 18 μg / ㎖) 및 10 μL / 분의 유속으로 420 초 접촉 시간 동안 주입 세트.
  3. 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 시약 랙 2에 필요한 솔루션 튜브를 놓습니다. 저장 및 고정화를 시작합니다.
    참고 : ~ 14,000 17,000 RU의 범위에서 안티 GST 고정화 수준에서이 방식으로 결과에 고정화 마법사를 실행합니다.
  4. 참고 흐름 전지 (1)에 5 μL / 분에서 420 초 (20 ㎍ / ml) 용액을 GST 리간드를 주입​​하는 고정 마법사를 편집합니다.

3. 기능화 분자의 모니터링에 칩 캡처 - 사이클로

  1. 온칩 실시간으로 캡처 - 사이클로 (그림 2) 모니터링.
    1. GST-TCO (20 ㎍ / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 사람을 선택연간 실행 방법은 5 μL / 분으로 유량을 설정하고 셀 2 흐름 경로를 흐른다.
    2. 420 초 동안 GST-TCO의 솔루션을 주입한다.
    3. 600 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다.
    4. 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생.
  2. 리얼 타임 (그림 3)의 다 성분 구조의 온 - 칩 어셈블리를 모니터링 :
    1. GST-Tz 일 (20 ㎍ / ㎖), NP-TCO (100 μg 철 / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 악기 수동 운전 방법을 선택, 셀 2 흐름에 5 μL / 분 유로에 유량을 설정합니다.
    2. 60 초 동안 GST-Tz 일의 용액을 주입한다.
    3. 60 초 동안 NP-TCO의 솔루션을 주입.
    4. 60 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다.
    5. 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생.

4. 엠사이클로 환율의 고정화 밀도 및 결정을 onitoring

  1. 작은 분자 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성.
    1. 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 새로운 단계로 이름 샘플을 만들 수 있습니다. 목적을 설정하고 샘플에 기본 설정을 연결합니다.
    2. 사이클 유형 패널에서 새로운 사이클 단계를 작성하고 다음 명령을 삽입, 캡처, 샘플, 재생 1과 재생 2.
    3. 캡처 명령을 선택, 입력 리간드 이름 (GST-TCO, 20 ㎍ / ㎖) 5 μL / 분으로 설정 유로의 접촉 시간 120 초 : 초. 샘플 명령을 선택, 입력 180 초 접촉 시간, 60 초 해리 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로 : 양쪽 모두. 재생 1 명령을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생이 명령에 대해 동일한 작업을 반복합니다. </ 리>
    4. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 선택 및 분석 솔루션 (TZ-BnNH 2) 농도 시리즈 (0.3 ~ 10 μM 1:2 희석)와 샘플 목록을 입력합니다. 위치 패널 랙 옆에 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다.
  2. NP 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성.
    1. 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 다음 매개 변수를 변경합니다. [캡처] 패널을 선택, GST-Tz 일, 20 ㎍ / ㎖의로 변경 리간드 이름입니다. 견본 패널을 선택, 변화의 접촉 시간 120 초 접촉 시간 및 분리 시간 120 초에.
    2. 샘플 목록을 선택, NP-TCO 및 농도 시리즈 (7 nm의 224에 1:2 희석)에 분석을 변경할 수 있습니다. 시약 랙에 배치 솔루션 유리 병2와 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 96 - 웰 플레이트에 희석 시리즈. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다.

5. 고정화 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정

반전 지향 결합 연구는 고정 된 리간드와 분석 및 복합 AP1497 (그림 5)로 FKBP12를 사용합니다. 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이 분석의 일반적인 방법은 설정되어 있습니다 :

  1. 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 생성하고 이름을 캡처, 샘플 및 재생 단계. 해당 목적을 선택하고 기본 설정을 연결합니다.
  2. 사이클 종류의 패널을 선택하고 3주기 단계 생성 : 캡처, 샘플 및 재생을.
  3. 캡처주기 단계에서 두 번 캡처 명령을 삽입합니다. variabl로 캡처 한 패널을 선택 캡처 솔루션을 선택둘째, 전자, 5 / 분 μL 및 설정 유로의 유량으로 접촉 시간을 300 초로 설정합니다. 둘째로 5 μL / 분으로 설정 유로의 유량으로 250 초에 접촉 시간을 설정 변수로 캡처 2 패널 선택 캡처 솔루션을 선택합니다.
  4. 샘플주기 단계에서 샘플 명령을 삽입합니다. 견본 패널을 선택, 60 초에 설정 접촉 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로에서 200 초에 분리 시간 : 양쪽 모두.
  5. 재생주기 단계에서 두 번 재생 명령을 삽입합니다. 재생 1 패널을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생 2 패널에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
  6. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 입력 캡처 솔루션 이름 (GST-TCO와 AP1497-Tz 일), 샘플 이름 (FKBP12), 농도 시리즈 (0.020-5 ㎍ / ㎖의 1:2 희석)와 MW (13,000)을 선택합니다. R의 장소 솔루션 유리 병96 - 웰 플레이트에 eagent 랙 2 희석 시리즈는 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다.

6. 고정화 된 국민 연금 첨부 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정

나노 입자의 고정화, 작은 분자 유도체 및 FKBP12 결합 분석을위한 일반적인 방법은 셋업하는 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이

  1. 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 수정합니다. 캡처주기의 단계에 따라 추가 캡처 명령을 삽입합니다. 캡처 한 패널을 선택, 변수 이름 캡처 솔루션 1 (GST-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 60 초에 설정 접촉 시간. 캡처 2 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 2 (NP-TCO)으로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 고정 접촉 시간 5 μL / 분의 유속으로 90 초 및설정 유로로 두 번째. 캡처 3 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 3 (AP1497-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 180 초까지 설정 접촉 시간.
  2. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음을 두 번 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다.

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Representative Results

데이터 및 수치는 기준 8에서 적응되었습니다.

방향과 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 효율적인 가역 고정 새로운 바이오 센서의 응용 프로그램의 개발에 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. TCO와 Tz 일 사이 빠른 bioorthogonal 반응을 이용하여, 우리는 단계적 어셈블리 및 생물학적 활성의 유지와 리간드 표면의 재생을위한 방법을 설명한다. 2 TZ-BnNH이 고정화의 실시간 모니터링을 나타낸 것이다. GST-TCO의 용액 님 ~ 400 RU 상승의 결과 미리 고정화 된 항-GST 표면 위에 분사된다. TZ-BnNH 2 번째 주사는 응답 빠르고 ~ 15 RU 상승을 보여줍니다. 유도 된 항원의 어떠한 해리는 구조 안정성에 대한 증거를 제공하는 버퍼를 실행으로 전환 한 후 관찰되지 않습니다. 표면은 다수의 캡처-사이클로 사이클을 활성화 사이클의 마지막 단계에서 재생된다. 우리이 절차를 보내고하고 AP1497-는 TZ 분자와 TZ-BnNH 2 부분을 교체하는 것은 그 대상 FKBP12 (그림 5)과의 상호 작용 연구에 사용되는 생리 활성 표면을 생성한다. 항체 / 항원 상호 작용의 중단 (도 2에 도시 된 바와 같은) 새로운 분자 어셈블리가 구축 될 수 있도록, 항-GST 표면을 재생한다. 이 경우에, GST-는 TZ 분사 (~ 800 RU의 캡처)을 효율적으로 센서 표면에 나노 입자 (도 3)를 고정화, NP-TCO (사이클로 ~ 600 RU)의 주입으로 이어진다. NP에 미 반응 TCO 그룹은 주입 TZ-BnNH 2 (~ 22 RU)와 사이클로 사용할 수 있습니다. 또한, AP1497-Tz 일을 기능화 나노 입자 FKBP12 상호 작용 (그림 5)를 모니터링하는 데 사용됩니다. 멀티 컴포넌트 구조 없음 해리 (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) 구조의 안정성과 생체 활성 (AP1497-Tz/FKBP12 B에 대한 증거를 제공 관찰inding).

실시간 고정화 (사이클로) 반응 모니터링 및 표면 재생을위한 기능을 통해 연관 율 간단 특성은도 4에 도시 된 바와 같이 (사이클로 레이트)가 달성된다 K. 반응 속도에 대한 지식은 고정 밀도 (접촉 시간과 농도), 바이오 센서 분석을위한 중요한 매개 변수를 제어하기위한 지침을 제공합니다. GST-TCO 또는 GST-TZ 표면에 중복 TZ-BnNH 2 NP-TCO의 농도를 증가 주입 각각 바인딩 데이터 (레드 라인)를 생성한다. 같은면에 같은 농도의 두 순차적 분석 샘플의 바인딩 데이터가 거의 겹쳐으로 인해 캡처 - 사이클로 및 재생의 여러 사이클에 용량을 결합 항체의 최소한의 손실을 반영하고 있습니다. 평가 소프트웨어는 최적의 운동 분석 (검은 라인을 제공합니다 ) C에 대한ycloaddition의 반응 속도는 그림 4를 K.

그림 1
그림 1. 유도체 분자. A. 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일) 부분 1,4 - dihydropyridazine 부가 물을 줄 수있는 가역적 고정화 Bioorthogonal 활용 전략 . Tz 일 / TCO의 가역 고정화 B. 실험 방식은 분자를 태그. 가역 나노 입자의 고정화 및 작용에 대한 C. 실험 계획은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 2. . 작은 분자 고정화의 실시간 모니터링 1) 기준 :. 실행 버퍼 (t 주입 다음 항 GST 항체 (t = 0-420 초)에 의해 주입 된 GST-TCO의 사전 고정화 방지 GST 2) 캡처, 응답 ~ 15 RU 상승,, t는 540-1,140 초 =). 캡처 GST-TCO 및 테트라 (TZ-BnNH 2 사이 = 420-540 초) 상호 작용의 지속성을 보여주는 3) 사이클로. 신호 붕괴. 4) 10 mM의 글리신, pH가 2.1 (t = 1,820-2,000 초)의 2 짧은 주사와 항 GST 표면의 재생 버퍼 (t = 1,140-1,820 초)를 실행에 이동상 전환에도 불구하고 발생하지 않습니다.

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그림 3. 캡처 된 GST-Tz 일 및 NP-TCO (t = 135-195을 주입 사이에 주입 GST-Tz 일 (t = 0 ~ 60 초 나노 입자의 고정화 및 작용의 실시간 모니터링. 1) 기준. 2) 캡쳐). 3) 사이클로 초), 신호에 부패 버퍼를 실행 주입 하였다 (t = 195-300 초). 4) 사이클로는 NP-TCO 고정화 TZ-BnNH 2 주입 (~ 응답의 22 RU 상승, t는 300-360을 = 사이 초). 신호의 붕괴 다 성분의 안정성에 대한 증거를 제공하는 버퍼 (t = 360-480 초)를 실행에 이동상 전환에도 불구하고이 없습니다.

그림 4
그림 4. B를 보여주는 대표 sensorgramsTz 일 및 TCO 사이의 고리 화 반응 inding 데이터 (레드 라인) 및 운동 분석 (검은 선)이 100 % FBS의 존재 또는 부재에 분자를 태그. 테이블 협회 (사이클로) 속도 상수를 요약, 회계 기준.

그림 5
그림 5. . AP1497 및 AP1497-Tz 일 : 다양한 구성의 작은 분자 / 단백질 상호 작용 (상위) FK506의 합성 유도체의 SPR 연구. 표 운동 정보을 데이터 바인딩 유래 평형 속도 상수. 단백질이 고정 바인딩 실험 (즉, 기존의 SPR 실험)에서 데이터는 비교를 위해 포함되어 있습니다.

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Discussion

여기에 설명 된 캡처 - 사이클로 방법은 라벨이없는 칩 기반의 상호 작용과 운동 연구에 대한 수정 된 나노 입자와 작은 분자의 빠른 가역적 고정 할 수 있습니다. 고정화 프로토콜 <저분자 리간드 10 μM 농도가 필요한 분에서 수행 될 수있다. 리간드 농도 및 접촉 시간 고정화 밀도를 변조함으로써 가깝게 제어 할 수있다. 우리의 데이타는 온칩 bioorthogonal 반응 그들의 표적과 상호 작용하는 동일계 기능화 된 나노 입자 또는 고정화 작은 분자의 능력을 보존하는 것을 보여준다. 우리는 또한 낮은 분자량이 작은 분자, (TCO와 Tz 일) 사이에 이분자 사이클로 속도를 특징으로하고 있습니다. 우리는 유사한 분석이 다른 빠른 bioorthogonal 반응의 속도를 측정하고 비교하기 위해 수행 할 수있는 상상.

뒤집을 수있는, 지속적인 흐름 온칩 나노 입자의 고정화 및 원위치 작용 홍보ovides 모든 정화, 고정 및 검사에 대한 여러 단계를 필요로 기존의 나노 입자 합성에 비해 같은 실험. 13-15에서 검사 및 상호 작용 분석을위한 개질 된 나노 입자의 다양한 빠른 액세스, 우리의 방법은 크게 생체 적합 물질의 입력 수량, 용매를 감소 및 시약은, 동시에 나노 입자 사용 및 폐기 다루는 환경 문제를 감소시키면서. 16 중요한 것은, 나노 입자의 작용 화 반응은 일반적으로 세포 배양 실험에 사용되는 혈청 농도의 존재에 견고, 심지어 매우 높은 혈청 농도. 이 기능은 혈청의 존재 (나노 입자의 단백질 코로나 및 표면 특성에 영향을 미칠 수있는)에있는 나노 입자 설계를위한 구조 - 활성 관계를 촉진 할 수있다. (17, 18)

단백질 - 작은 분자의 상호 작용을 연구하는 곳을 가장 SPR 분석에서 단백질 (리간드)입니다선호도 태그 (GST, 비오틴 등)을 통해 또는 공유 아미드 결합을 통해 고정. 분석은 다음 리간드 통해 전달되는 경우 굴절률 변화로 감지하는 표면 질량 변화, 바인딩 결과. 정식 SPR 방향을 반전하고 편리하고 가역 방식으로 작은 분자를 고정화하는 수용성 고분자 대상의 직접 결합을 연구하는 손쉬운 액세스를 제공하고 유물 (수용성 대 고정) 상 별을 명확하게. 이러한 유형의 19, 20 분석 형식은 특히 억제 및 경쟁 연구를위한 귀중한. 방향 21 환입 또한 여러 상황에서 유용 할 수 있습니다, 즉) 바인딩 신호가 대량 변경 B) 집계 소수성 분석 (22)의 비 특이성을 표면에 비례한다는 것을 고려 저 분자량의 분석과 선호도가 높은 바인더의 데이터 분석 간단한 C) 특성이 할 수있는 만들기 제거때문에 긴 체류 시간 (공유 억제제를 다루는 특히, 오프 속도를 느리게) (23)와 다음 분석주기 D) 재생 에이전트의 구조 나 기능에 저하 효과를 가지고 있습니다에 대비 표면의 재생 조건에 대한 필요성에 도전 할 고정화 된 단백질.

고정화 우리 전략의 일부로 bioorthogonal 캡처-사이클로 방식을 도입함으로써, 우리는 종래의 저분자 고정화 기술과 관련된 문제의 일부를 우회. 단백질 고정화 프로토콜에 대한 일반적인 사전 농도를 표면에 이르는 정전 관광 명소로는 작은 분자와 효과가 있기 때문에이 훨씬 더 높은 리간드 농도를 필요로합니다. 따라서, 리간드의 농도를 증가시키는 것은 리간드 용해 유기 공 - 용매의 비율 증가에 이르게한다. 이러한 조건은 모두 마이크로 유체 유동 시스템과 호환 상태로되지 않는 결과, 종래의 난mmobilizations 실시간 모니터링. 24은 마지막으로 성공적인 종래 고정화의 경우에, 공유 결합 표면 개질이 표면 재생을 방지하고 시간과 노력의 증가 투자 결과 바이오 센서 표면의 실험 범위를 제한 할 수없는 기기 외부에서 수행되어야한다 비용.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

우리는 NIH (NHLBI 계약 번호 HHSN268201000044C이, SH 및 SYS를 RW하는)에서 자금을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

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References

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