Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaksjon på reversibelt Immobilize små molekyler eller flerkomponent Profiler for Biosensor Applications

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi presenterer en fremgangsmåte for hurtig, reversible immobiliseringen av små molekyler og funksjonnanopartikkel sammensetninger for overflate-plasmonresonans (SPR) undersøkelser, ved hjelp av sekvensiell on-chip bioorthogonal cycloaddition kjemi og antistoff-antigen fangst.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metoder for rask overflate immobilisering av bioaktive små molekyler med kontroll over retningen og immobilisering tetthet er svært ønskelig for biosensor og microarray-applikasjoner. I denne studien bruker vi en svært effektiv kovalent bioorthogonal [4 2] cycloaddition reaksjon mellom trans-cyclooctene (TCO) og 1,2,4,5-tetrazine (TZ) for å aktivere microfluidic immobilisering av TCO / Tz-derivatized molekyler . Vi overvåke prosessen i sanntid i henhold til kontinuerlige strømningsbetingelser ved å bruke overflate-plasmonresonans (SPR). For å muliggjøre reversibel immobilisering og forlenge forsøksområdet til sensoroverflaten, vi kombinerer en ikke-kovalent antigen-antistoff-fangst komponent med cycloaddition reaksjonen. Ved vekselvis å presentere TCO eller Tz rester til sensoroverflaten, flere fangst-cykloaddisjon prosesser er det nå mulig på en sensorflaten for on-chip monterings-og interaksjons studier av en rekke flerkomponent-strukturer. Vi illustrate denne metoden med to forskjellige immobilisering eksperimenter på en biosensor chip, et lite molekyl, AP1497 som binder FK506-bindende protein 12 (FKBP12), og den samme lille molekyl som en del av en immobilisert, og in situ-funksjonalisert nanopartiklene.

Introduction

Effektiv konjugeringsreaksjoner er verdifulle verktøy for å feste bioaktive molekyler til overflater for en rekke av bioteknologi. Nylig har meget rask bioorthogonal [4 2] cycloaddition reaksjon mellom trans-cyclooctene (TCO) og 1,2,4,5-tetrazine (TZ) blitt brukt til å merke celleoverflater, subcellulære strukturer, antistoffer og nanopartikler en. - 7 Her bruker vi [4 +2] cycloaddition reaksjon i kombinasjon med antigen / antistoff fangst (GST / anti-GST) for reversibel on-chip syntese av flerkomponent strukturer for Surface Plasmon Resonans (SPR) interaksjonsanalyse og overvåke Prosessen i sanntid (figur 1). 8,9 Spesielt muliggjør fangst-cycloaddition strategi overflate regenerering ved hjelp av en etablert protokoll. 8. Som følge av monteringen av stabile sensoroverflater med kontroll over ligand retning og tettheten for forskjellige nye assay formatene er nå mulig. Brukedenne strategien vi demonstrere immobilisering av TCO / Tz-derivatized små molekyler og karakterisere cycloaddition priser i en rekke bufferbetingelser. Vi valgte velkjente interaksjon mellom FKBP12 og et molekyl som binder AP1497 FKBP12 10-12 som et eksempel for å verifisere at fangst-cycloaddition strategi bevarer evnen av den lille molekylet for å interagere med dens target når enten direkte festet til immobilisert GST antigen eller til immobilisert nanopartikler (NPS).

Denne metoden gir flere fordeler. For det første er det nå mulig den reversible immobiliseringen av små molekyler på sensorbrikker. Sekund, TCO / Tz immobilisering av små molekyler kan også label-free interaksjonsstudier som reverserer retningen på kanoniske SPR studier, og kan gi en utfyllende visning av en forpliktende samhandling. For det tredje gir denne metoden microfluidic syntese av målrettede nanopartikler, og øyeblikkelig vurdering av deres binding egenskaper. Dette lover å forbedre effektiviteten av å evaluere eller screening målrettede nanopartikler, og også redusere mengden av nanopartikler som kreves. 13-15 Fjerde, kan denne tilnærmingen måle reaksjonskinetikken bioorthogonal cycloaddition reaksjoner i sanntid under kontinuerlig flyt. Endelig er den TCO / Tz immobilisering kjemi robust i nærvær av serum. Til sammen forventer vi at denne allsidige tilnærming vil grovt rette for bygging av stabile sensoroverflater for et bredt utvalg av microfluidic studier med relevans til in vitro og in vivo cellulære applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av GST og nanopartikler (NP) Konjugater

  1. GST-TCO forberedelse:
    1. Tilsett 8 mL av TCO-NHS-løsning (50 mM i DMSO) til 100 mL av GST (1 mg / ml i PBS) og ryste blandingen ved RT i 1 time.
    2. Fjern overflødig reagens ved hjelp av en Zeba spin avsalting kolonne. Det utvunnede filtratet inneholdende GST-TCO konjugatet lagres ved 4 ° C før bruk.
  2. GST-Tz forberedelse:
    1. Tilsett 6 mL av Tz-NHS-løsning (25 mM i DMF) i 75 mL av GST (1 mg / ml i PBS) og ryste blandingen ved RT i 1 time.
    2. Fortynn reaksjonsblandingen med 25 mL PBS og rens ved hjelp av en spin avsalting kolonne. Filtratet inneholdende GST-Tz-konjugatet lagres ved 4 ° C før bruk.
    Merk: Mass analyser (MALDI-TOF) viste at i gjennomsnitt ~ 10 Tz eller TCO molekyler ble konjugert til GST.
  3. NP-TCO forberedelse:
    1. Tilsett 100 ul av TCO-NHS-løsning (50 mM i DMSO) til150 pl av aminert nanopartikkel (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml i PBS, 3 nm jernkjerne ~ 8000 Fe / NP) og blandingen ristes ved RT i 1 time.
    2. Fjern overskudd av reagens ved gelfiltrering ved bruk av en NAP-10 kolonne eluert med PBS-buffer. Samle den fargede bånd som inneholder NP-TCO produktet.
    3. Konsentrer filtratet til et endelig volum på ~ 150 pl ved hjelp av en sentrifugal-filteranordning (100 k MWCO).
    4. Tilsett 50 pl av ravsyreanhydrid (0,1 M i DMSO) til NP-TCO-oppløsning og ristes ved RT i 1 time (anhydrid reagere med eventuelle gjenværende aminer for å danne klemme karboksylsyrer. Dette forhindrer ikke-spesifikke interaksjoner med dekstran-flaten).
    5. Rense NP-TCO-produkt med en NAP-10 kolonne eluering med PBS. Oppbevar løsningen av NP-TCO ved 4 ° C før bruk.

2. Overflatebehandling

Alle overflate plasmonresonansen analysene er utført på en Biacore T100 instrument (GE Healthcare) på25 ° C ved hjelp av en CM5 sensorbrikken, og PBS-P som den rennende buffer, med mindre annet er angitt. Biacore kontroll og evaluering programvare som følger med instrumentet er ansatt for å sette opp eksperimenter og analysere data. To driftsformer, søknads veivisere og manuell løp vil bli brukt for overflatebehandling og overvåking on-chip-fangst-cycloaddition. Metoden byggmester modus vil bli brukt til å sette opp reverse orientering bindingsforsøk og for å måle cycloaddition reaksjonshastigheter. Dataene er dobbelt referanse trukket og kinetiske analysene er utført ved hjelp av en 1:01 Langmuir bindende modell.

  1. Bruk amin immobilisering veiviseren mal og velg immobilisering på Flow celler 1 (referanse) og 2 (deteksjon). Modifiser amin fremgangsmåte for å aktivere overflaten karboksylgrupper ved injeksjon av en 1:1-oppløsning av 0,4 M EDC: 0,1 M NHS i 480 sekunder ved en strømningshastighet på 10 mL / min. Sett injeksjon av etanolamin for å slukke gjenværende aktiverte estere til 420 sek kontakttid påen strømningshastighet på 10 mL / min.
  2. Inngangs ligand navn, anti-GST (18 mikrogram / ml i acetat-buffer, pH 5,0) og satt til å sprøyte inn i en kontakttid på 420 sek ved en strømningshastighet på 10 mL / min.
  3. Plasser nødvendige løsnings ampuller i reagens stativ 2 og pass på å matche de posisjoner med innholdslisten. Lagre og starte immobilisering.
    Merk: Kjøring av immobilisering veiviser på denne måten fører til anti-GST immobilisering nivåer i rekkevidden av ~ 14 000 til 17 000 RU.
  4. Redigere immobilisering veiviseren for å bare injisere GST ligand (20 mikrogram / ml) oppløsning til 420 sek på 5 mL / min i mer enn referanse Flow celle en.

Tre. Overvåking On-chip Capture-cycloaddition av Functionalized Molekyler

  1. Overvåking on-chip-fangst-cycloaddition i sanntid (figur 2).
    1. Plasser GST-TCO (20 pg / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) og regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0)-løsning i ampuller reagens stativ 2.. Velg mannenUAL kjøre metoden, satt strømningshastigheten til 5 mL / min og flyt sti til Flow celle to.
    2. Injisere løsning av GST-TCO for 420 sek.
    3. Injisere løsning av Tz-BnNH 2 for 600 sek.
    4. Regenerer overflaten med to 30 sek injeksjoner av regenerering løsning.
  2. Overvåking on-chip montering av flerkomponent-strukturer i sanntid (figur 3):
    1. Plasser GST-Tz (20 pg / ml), NP-TCO (100 mikrogram Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) og regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0)-løsning i ampuller reagens stativ 2.. Velg instrumentet manuell løp metode, angir strømningshastigheten til 5 ul / min, og strømningsbanen til strømningscellen 2..
    2. Injisere en løsning av GST-Tz for 60 sek.
    3. Injisere en løsning av NP-TCO i 60 sek.
    4. Injisere en løsning av Tz-BnNH 2 for 60 sek.
    5. Regenerer overflaten med to 30 sek injeksjoner av regenerering løsning.

4. Monitoring Immobilization Tetthet og Bestemmelse av cycloaddition priser

  1. Karakterisering av små molekyl cycloaddition reaksjonen priser (figur 4).
    1. Velg Ny metode og innsats generelle parametere. I assaytrinnene panel opprette et nytt skritt og gi den navnet Sample. Sett Formål og Koble baseinnstillingene Sample.
    2. I Cycle Typer panelet Opprett en ny syklus skritt og sette inn følgende kommandoer, Capture, Sample, Regeneration en and Regeneration to.
    3. Velg Capture kommando; innspill ligand navn (GST-TCO, 20 mg / ml), kontakttid 120 sek på 5 mL / min og satt strømningsbanen til: Second. Velg Eksempelkommando, inngang 180 sek kontakttid, 60 sek dissosiasjon tid, 30 mL / min flow rate og satt strømningsbanen til: Begge deler. Velg Regeneration en kommando; innspill regenerering løsning navn (10 mM glysin-HCl pH 2,0), kontakttid på 30 sek på 30 mL / min og satt strømningsbanen til: Second. Gjenta det samme for Regeneration 2 kommando. </ Li>
    4. Velg Setup Run og satt strømningsbanen til: 2-1. Velg neste og fyll eksempelliste med analytten løsning (TZ-BnNH 2) og konsentrasjon serien (0,3 til 10 mikrometer, 1:02 fortynning). Velg ved siden av stativposisjon panel. Place løsning ampuller i reagens stativ 2 og fortynning serie i 96-brønners plate og pass på å matche de posisjoner med innholdslisten. Spar metode mal og starte bindingsanalyse. Bindingsdata og kinetisk analyse er vist i figur 4..
  2. Karakterisering av NP cycloaddition reaksjonen priser (figur 4).
    1. Åpne den lagrede metode mal ovenfra og endre følgende parametere. Velg Capture panel, endre ligand navn til GST-Tz, 20 mikrogram / ml. Velg eksempel panel, endre kontakttiden til 120 sek kontakttid og dissosiasjon tid til 120 sek.
    2. Velg eksempelliste, endre analytt til NP-TCO og konsentrasjon serie (7-224 nM, 1:02 fortynning). Place løsning ampuller i reagens stativ2 og fortynning serie i 96-brønners plate og pass på å matche de posisjoner med innholdslisten. Spar metode mal og starte bindingsanalyse. Bindingsdata og kinetisk analyse er vist i figur 4..

5. Måle Binding of FKBP12 til Immobilisert AP1497

Reversert-orientering Bindingsstudier benytter FKBP12 som analytten og forbindelse AP1497 som immobilisert ligand (figur 5). Den generelle metode for dette assay er satt opp på følgende måte ved hjelp av metoden genereringsverktøy:

  1. Velg Ny metode og innsats generelle parametere. I assaytrinnene panel opprette og navn Capture, Sample og regenerering trinn. Velg det tilsvarende formål og Koble baseinnstillingene.
  2. Velg Cycle typer panel og opprette tre sykkel trinn: Capture, Sample og regenerering.
  3. Sett Capture kommandoen to ganger etter Capture cyklustrinn. Velg Capture ett panel og velg fange løsning som variable, sett kontakttiden 300 sek ved en strømningshastighet på 5 ul / min, og strømningsbanen for å angi: Såmaskin. Velg Capture 2 panel og velg fange løsning som variabel, satt kontakttid til 250 sek med en strømningshastighet på 5 mL / min og satt strømningsbanen til: Second.
  4. Sett Eksempelkommando under Sample cyklustrinn. Velg eksempel panel; sett kontakttid til 60 sek, dissosiasjon tid til 200 sek med en strømningshastighet på 30 mL / min og satt strømningsbanen til: Begge deler.
  5. Sett Regeneration kommandoen to ganger under Regeneration cyklustrinn. Velg Regeneration en panel; innspill regenerering løsning navn (10 mM glysin-HCl pH 2,0), kontakttid på 30 sek på 30 mL / min og satt strømningsbanen til: Second. Gjenta det samme for Regeneration 2 panel.
  6. Velg Setup Run og satt strømningsbanen til: 2-1. Velg neste og inngangs fange løsning navn (GST-TCO og AP1497-Tz), utvalgets navn (FKBP12), konsentrasjon serie (0,020 til 5 pg / ml, 1:02 fortynning) og MW (13 000). Place løsning ampuller i reagent stativ 2 og fortynning serie i 96-brønners plate og pass på å matche de posisjoner med innholdslisten. Spar metode mal og starte bindingsanalyse. Kinetisk analyse av data er vist i figur 5..

6. Måle Binding of FKBP12 til AP1497 Festet til immobilisert NPs

Den generelle fremgangsmåte for nanopartikkel immobilisering, lite molekyl derivatisering og FKBP12 bindingsanalysen er satt opp på følgende måte ved hjelp av metoden genereringsverktøy:

  1. Åpne den lagrede metode mal ovenfra og endre. Sett en ekstra Capture under kommando Capture cyklustrinn. Velg Capture ett panel, fjerne merkingen fange løsning som variabel og navn fange løsning 1 (GST-Tz). Set kontakttid på 60 sekunder ved en strømningshastighet på 5 ul / min, og setter strømningsbanen til det andre. Velg Capture 2 panel, fjerne merkingen fange løsning som variabel og navn fange løsning 2 (NP-TCO). Set kontakttid på 90 sek ved en strømningshastighet på 5 ul / min, ogsatt strømningsbanen til andre. Velg Capture 3 panel, fjerne merkingen fange løsning som variabel og navn fange løsning 3 (AP1497-Tz). Set kontakttid på 180 sek ved en strømningshastighet på 5 ul / min, og setter strømningsbanen til det andre.
  2. Velg Setup Run og satt strømningsbanen til: 2-1. Velg neste to ganger. Place løsning ampuller i reagens stativ 2 og fortynning serie i 96-brønners plate og pass på å matche de posisjoner med innholdslisten. Spar metode mal og starte bindingsanalyse. Kinetisk analyse av data er vist i figur 5..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data og figurer har blitt tilpasset fra referanse 8.

Effektiv reversibel immobilisering av bioaktive små molekyler med kontroll over retningen og tetthet spiller en nøkkelrolle i utviklingen av nye biosensor applikasjoner. Ved hjelp av den raske bioorthogonal reaksjon mellom TCO og Tz, beskriver vi en metode for trinnvis montering og regenerering av ligand overflater med oppbevaring av biologisk aktivitet. Figur 2 viser sanntids overvåking av Tz-BnNH to immobilisering. En oppløsning av GST-TCO injiseres i løpet av en pre-immobiliserte anti-GST overflate resulterer i ~ 400 RU økning i responsen. En ny injeksjon med Tz-BnNH 2 viser en rask ~ 15 RU økning i respons. Ingen dissosiasjon av derivatisert antigen er observert etter bytte til buffer som gir bevis for stabilitet struktur. Overflaten blir regenerert i det siste trinnet i syklusen å aktivere flere fangst-cycloaddition sykluser. Ossing denne prosedyren og erstatte Tz-BnNH 2-delen med AP1497-Tz molekyl genererer en bioaktive overflate brukes for interaksjonsstudier med sitt mål FKBP12 (figur 5). Forstyrrelse av antistoff / antigen-interaksjon (som vist i figur 2) regenererer den anti-GST overflate, slik at en ny molekylær sammenstilling som skal bygges. I dette tilfellet er et GST-Tz-injeksjon (fangst av ~ 800 RU), etterfulgt med en injeksjon av NP-TCO (cycloaddition ~ 600 RU), effektivt immobilisering av nanopartikkel til sensorflaten (figur 3). Ureagert TCO grupper på NP er tilgjengelig for cycloaddition med injisert Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Alternativt, er AP1497-Tz brukes til å overvåke functionalized nanopartikkel-FKBP12 interaksjoner (figur 5). Ingen dissosiasjon av de flerkomponentstrukturer (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) er observert å gi bevis for struktur stabilitet og bioaktivitet (AP1497-Tz/FKBP12 binding).

Med evner for sanntids immobilisering (cycloaddition) reaksjon overvåking og overflate regenerering, den enkle karakterisering av krets sats k a (cycloaddition rate) er oppnådd, som vist i figur 4. Kjennskap til reaksjonskinetikk gir retningslinjer for styring av immobilisering tetthet (kontakttid og konsentrasjon), en viktig parameter for biosensor-analyser. Injeksjon av økende konsentrasjoner av Tz-BnNH 2 eller NP-TCO i duplikat i løpet GST-TCO eller GST-TZ-flater, henholdsvis genererer bindingsdata (rød linje). De bindende data for to påfølgende analyseprøver av den samme konsentrasjon over den samme overflaten er nesten superimposable reflekterer minimalt tap av antistoffbindende kapasitet på grunn av gjentatte behandlinger med fangst-cykloaddisjon og regenerering. Evaluerings programvare gir de best tilpasning kinetiske analyser (sorte linjer ) til cycloaddition reaksjonshastigheter k en er vist i figur 4..

Figur 1
Figur 1. Bioorthogonal konjugering strategi for reversibel immobilisering av derivatized molekyler. A. [4 2] cycloaddition reaksjon mellom trans-cyclooctene (TCO) og 1,2,4,5-tetrazine (TZ) grupper for å gi den 1,4-dihydropyridazine addukt . B. Experimental ordning for reversibel immobilisering av Tz / TCO tagget molekyler. C. Experimental ordning for reversibel nanopartikkel immobilisering og funksjonalisering. Klikk her for å se større figur .

mg src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" alt = "Figur 2" fo: content-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />
Figur 2. . Sanntidsovervåkning av små molekyl immobilisering 1) Referanse:. Pre-immobiliserte anti-GST 2) Rensing av injisert GST-TCO med anti-GST-antistoff (t = 0 til 420 sek), fulgt av injeksjon av rennende buffer (t . = 420-540 sek) viser utholdenhet av interaksjon 3) cycloaddition mellom fanget GST-TCO og tetrazine (TZ-BnNH 2; ~ 15 RU økning i respons, t = 540-1,140 sek). Ikke noe signal nedbrytning oppstår til tross for veksling den mobile fase for å rennende buffer (t = 1,140-1,820 sek.) 4) Regenerering av anti-GST overflate med to korte injeksjoner av 10 mM glycin, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 sek).

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Real-time overvåkning av nanopartikkel immobilisering og funksjonalisering. 1) Baseline. 2) Fangst av injisert GST-Tz (t = 0-60 sek). 3) cycloaddition mellom fanget GST-Tz og injisert NP-TCO (t = 135-195 sek), fulgt av injeksjon av rennende buffer uten nedbrytning i signal (t = 195 til 300 sek.) 4) cyklo-addisjonen mellom immobilisert NP-TCO og injisert Tz-BnNH 2 (~ 22 RU økning i responsen, t = 300-360 sek). Det er ikke noe signal råte tross bytte den mobile fase for å rennende buffer (t = 360 til 480 sek) å tilveiebringe bevis for multi-komponentstabilitet.

Figur 4
Figur 4. Representative sensorgrams viser binding data (røde linjer) og kinetiske analyser (svarte linjer) for cycloaddition reaksjon mellom Tz og TCO merket molekyler i nærvær eller fravær av 100% FBS. Tabell oppsummerer forening (cycloaddition) hastighetskonstanter, k en.

Figur 5
Figur 5. SPR studier av små molekyl / protein interaksjoner i varierende konfigurasjoner (Top) syntetiske derivater av FK506:. AP1497 og AP1497-Tz. Tabellen viser kinetisk og likevekts hastighetskonstanter avledet fra bindingsdata. Data fra bindende eksperimenter hvor proteinet er immobilisert (dvs. tradisjonelle SPR eksperimenter) er inkludert for sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fangst-cycloaddition metoden beskrevet her muliggjør rask, reversibel immobilisering av modifiserte nanopartikler og små molekyler for label-fri chip-basert samhandling og kinetiske studier. Immobiliseringen protokollen kan utføres på få minutter som krever <10 uM konsentrasjon av små-molekyl ligander. Ved modulering av ligandkonsentrasjon og kontakttid immobilisering tettheter kan reguleres nøye. Våre data viser at on-chip bioorthogonal reaksjoner bevare muligheten for in situ functionalized nanopartikler eller immobilisert små molekyler til å samhandle med sine mål. Vi har også preget bimolecular cycloaddition priser mellom to små molekyler, (TCO og Tz) med lav molekylvekt. Vi ser for oss at lignende analyser kan utføres for å måle og sammenligne prisene med andre raske bioorthogonal reaksjoner.

Reversibel, kontinuerlig flyt på brikken nanopartikkel immobilisering og in-situ funksjon provides rask tilgang til en rekke modifiserte nanopartikler for screening og interaksjonsanalyse alle i det samme eksperimentet. 13-15 Sammenlignet med konvensjonelle nanopartikkel-syntesen, noe som krever forskjellige trinn for rensing, immobilisering og screening, reduserer foreliggende fremgangsmåte sterkt inngangsstørrelsene av biomaterialer, løse og reagenser, og samtidig redusere miljøhensyn arbeider med nanopartikkel bruk og deponering. 16. Viktigere, nanopartikkel funksjonalise reaksjoner er robuste til tilstedeværelse av serum-konsentrasjoner som typisk anvendes for cellekultur eksperimenter, og til og med for svært høye serumkonsentrasjoner. Denne funksjonen kan lette struktur-aktivitetsrelasjoner for nanopartikkel utforming i nærvær av serum (som kan påvirke protein korona-og overflate-egenskaper av nanopartikler). 17,18

I de fleste SPR assays, hvor protein-lite molekyl interaksjoner er studert, er det protein (ligand)immobilisert gjennom en affinitet tag (GST, biotin, etc.) eller gjennom kovalente amidbindinger. Den analytt blir så ført over ligand hvor bindingen resulterer i overflatemassevariasjoner som detekteres som brytningsindeksendringer. Reversere den kanoniske SPR orientering og immobilisering av den lite molekyl i en praktisk og reversibel måte gir lettvinte tilgang til å studere direkte binding av løselig macromolecular mål og klargjør fase-spesifikke (immobilisert vs løselige) gjenstander. 19,20 Analyse formater av denne typen er spesielt nyttig for inhibering og konkurransestudier. 21. Tilbakeføring av orientering kan også være fordelaktig under flere omstendigheter, dvs. a) med analytter med lav molekylvekt, med tanke på at bindingssignal er proporsjonalt med overflatemasseendring b) aggregering og ikke-spesifisitet av hydrofobe analytter 22 elimineres slik at dataanalyse grei c) å karakterisere høy affinitet bindemidler kanvære utfordrende på grunn av lang oppholdstid (bremse off-priser, spesielt når du arbeider med kovalente hemmere) 23 og behovet for overflate regenerering forholdene i forberedelsene til neste analyse syklus d) regenerering agenter kan ha nedverdigende effekter på struktur eller funksjon av immobilisert protein.

Ved å inkorporere bioorthogonal fangst-cycloaddition fremgangsmåte som en del av immobilisering strategi, vi omgå noen av de problemer forbundet med konvensjonelle små molekyl immobilisering teknikker. Disse krever mye høyere ligand konsentrasjoner siden elektro attraksjoner som fører til overflaten pre-konsentrasjoner typiske for protein immobilisering protokoller er ineffektiv med små molekyler. Følgelig økende konsentrasjoner av ligander fører til økende forhold av organisk ko-løsningsmiddel for ligand oppløsning. Begge disse forhold er ikke kompatible med mikro fluidic strømningssystemer, og som en konsekvens, i konvensjoneltmmobilizations må utføres utenfor instrumentet der sanntids overvåking er ikke mulig. 24 Til slutt, i tilfelle av en vellykket konvensjonell immobilisering, hindrer kovalente overflaten ombygging overflaten regenerering og begrenser den eksperimentelle rekke biosensor overflater resulterer i økte investeringer i tid, krefter og kostnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi erkjenner midler fra NIH (NHLBI kontrakt nummer HHSN268201000044C til RW, SH og SYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats