Mikrofluid On-chip Capture-cycloadditionsreaktion reversibelt Immobilisere små molekyler eller Multikomponenttekstilprodukter strukturer biosensoranvendelser

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi præsenterer en metode til hurtig, reversibel immobilisering af små molekyler og funktionaliserede nanopartikler forsamlinger for Surface (SPR) undersøgelser, ved hjælp af sekventiel on-chip bioorthogonal cykloaddition kemi og antistof-antigen capture.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metoder til hurtig overflade immobilisering af bioaktive små molekyler med kontrol over orientering og immobilisering tæthed er særdeles ønskeligt for biosensor og microarray applikationer. I denne undersøgelse, bruger vi en meget effektiv covalent bioorthogonal [4 +2] cykloaddition reaktion mellem trans-cycloocten (TCO) og 1,2,4,5-tetrazin (Tz) for at aktivere mikrofluid immobilisering af TCO / Tz-derivatiserede molekyler . Vi overvåger processen i realtid under kontinuerlig strømning ved hjælp af overflade (SPR). For at aktivere reversibel immobilisering og udvide den eksperimentelle sensorens overflade kombinerer vi en ikke-kovalent antigen-antistof-capture komponent med cycloaddition reaktion. Ved skiftevis at præsentere TCO eller TZ dele til sensoroverfladen, flere capture-cycloaddition processer er nu muligt på en sensor overflade for on-chip montage og interaktion undersøgelser af en række flerkomponent-strukturer. Vi illustrate denne metode med to forskellige immobiliseringsmetoder eksperimenter på en biosensor chip, et lille molekyle, AP1497, der binder FK506-bindende protein 12 (FKBP12), og den samme lille molekyle som del af et immobiliseret, og in situ-funktionaliserede nanopartikler.

Introduction

Effektive konjugeringsreaktioner er værdifulde værktøjer til fastgørelse bioaktive molekyler til overflader til forskellige bioteknologiske anvendelser. For nylig har den meget hurtige bioorthogonal [4 +2] cycloaddition reaktion mellem trans-cycloocten (TCO) og 1,2,4,5-tetrazin (Tz) blevet anvendt til at mærke celleoverflader, subcellulære strukturer, antistoffer og nanopartikler 1. - 7 Her bruger vi [4 +2] cycloadditionsreaktion i kombination med antigen / antistof-capture (GST / anti-GST) til reversibel on-chip syntese af multi-komponent strukturer for Surface (SPR) interaktion analyse og overvåge proces i realtid (Figur 1). 8,9 Især capture-cykloaddition strategi gør det muligt overflade regeneration ved hjælp af en fastlagt protokol. 8. Som følge heraf samling af stabile sensor overflader med kontrol over ligand orientering og tæthed for forskellige nye assay formater er nu muligt. Brugdenne strategi vi vise immobilisering af TCO / Tz-derivatiserede små molekyler og karakterisere cycloaddition satser i en række forskellige bufferbetingelser. Vi valgte den velkendte vekselvirkning mellem FKBP12 og et molekyle, AP1497, der binder FKBP12 10-12 som et eksempel for at kontrollere, at indfangning-cykloaddition strategi bevarer evnen af lille molekyle til at interagere med sit mål, når enten direkte knyttet til immobiliserede GST-antigener eller immobiliserede nanopartikler (NPS).

Denne metode giver flere fordele. Først reversibel immobilisering af små molekyler på sensorchips er nu muligt. For det andet, TCO / Tz immobilisering af små molekyler også mulighed label-fri interaktionsundersøgelser der vende retningen af ​​kanoniske SPR undersøgelser, og kan give en supplerende visning af en bindende interaktion. For det tredje, denne metode gør det muligt mikrofluid syntese af målrettede nanopartikler, og øjeblikkelig vurdering af deres binding eng egenskaber. Det tegner til at forbedre effektiviteten af evaluering eller screening målrettede nanopartikler, og også mindske mængden af nanopartikler, der kræves. 13-15 fjerde kan denne tilgang måle reaktionskinetik af bioorthogonal cykloaddition reaktioner i realtid under konstant flow. Endelig TCO / Tz immobilisering kemi er robust i tilstedeværelse af serum. Tilsammen forventer vi, at denne alsidige fremgangsmåde stort set vil lette konstruktion af stabile sensor overflader til en lang række mikrofluide undersøgelser med relevans for in vitro og in vivo cellulære applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fremstilling af GST og Nanopartikel (NP) Konjugater

  1. GST-TCO forberedelse:
    1. Tilføj 8 pi TCO-NHS-opløsning (50 mM i DMSO) til 100 pi GST (1 mg / ml i PBS) og omrystes blandingen ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Fjern overskydende reagens ved hjælp af en Zeba spin-afsaltningssøjle. Det udvundne filtrat indeholdende GST-TCO konjugatet opbevaret ved 4 ° C før brug.
  2. GST-Tz forberedelse:
    1. Tilsæt 6 pi Tz-NHS-opløsning (25 mM i DMF) til 75 pi GST (1 mg / ml i PBS), og ryste blandingen ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Fortynd reaktionsblandingen med 25 pi PBS og renses ved anvendelse af en spin-afsaltningssøjle. Filtratet indeholdende GST-Tz konjugatet opbevaret ved 4 ° C før brug.
    Bemærk: Masse analyser (MALDI-TOF) viste, at i gennemsnit ~ 10 TZ eller TCO molekyler blev konjugeret til GST.
  3. NP-TCO forberedelse:
    1. Tilsæt 100 ul TCO-NHS-løsning (50 mM i DMSO) til150 pi aminerede nanopartikel (NP-NH2, 8,7 mg Fe / ml i PBS, 3 nm jernkerne ~ 8.000 Fe / NP) og ryste blandingen ved stuetemperatur i 1 time.
    2. Fjern overskydende reagens ved gelfiltrering under anvendelse af en NAP-10 kolonne elueret med PBS-buffer. Saml de farvede bånd, der indeholder NP-TCO produkt.
    3. Filtratet koncentreres til et slutvolumen på ~ 150 ul under anvendelse af en centrifugal filterindretning (100 k MWCO).
    4. Der tilsættes 50 ul af ravsyreanhydrid, (0,1 M i DMSO) til NP-TCO opløsning og omrystes ved stuetemperatur i 1 time (anhydrid reagerer med de resterende aminer for at danne terminale carboxylsyrer. Dette forhindrer uspecifikke interaktioner med dextran overflade).
    5. Renses NP-TCO produkt ved hjælp af en NAP-10-søjle under eluering med PBS. Opløsningen opbevares NP-TCO ved 4 ° C før brug.

2. Forbehandling

Alle overfladeplasmonresonans analyser udføres på et Biacore T100 instrument (GE Healthcare) ved25 ° C med en CM5 sensor chip og PBS-P som løbende buffer, medmindre andet er angivet. Biacore og evaluering software følger med instrumentet er ansat til opsætning af eksperimenter og analyse af data. To driftsformer, anvendelse troldmænd og manuel sigt vil blive brugt til forberedelse af overfladen og overvågning on-chip capture-cykloaddition. Metoden bygherre tilstand vil blive anvendt til etablering af revers orientering bindende eksperimenter og til måling af cycloadditionsreaktion satser. Oplysningerne er dobbelt henvisning trækkes og kinetiske analyser udføres ved hjælp af 1:1 Langmuir bindende model.

  1. Brug amin immobilisering guiden skabelon og vælg immobilisering på Flow celler 1 (reference) og 2 (detektion). Tilpas amin metode til at aktivere overflade carboxylgrupper ved injektion af en 1:1-opløsning af 0,4 M EDC: 0,1 M NHS til 480 sekunder ved en strømningshastighed på 10 ul / min. Indstil injektion af ethanolamin at slukke de resterende aktiverede estere til 420 sek kontakttid påen strømningshastighed på 10 ul / min.
  2. Input ligand navn, anti-GST (18 ug / ml i acetatbuffer, pH 5,0) og sat til at injicere en kontakttid på 420 sekunder ved en strømningshastighed på 10 ul / min.
  3. Placer ønskede løsning hætteglas i reagensstativ 2 og sørg for at matche de stillinger med indholdslisten. Gem og starte immobilisering.
    Bemærk: Kørsel immobiliseringstiden guiden på denne måde resulterer i anti-GST immobiliseringstrin niveauer i området på ~ 14.000 til 17.000 RUC.
  4. Rediger immobilisering guiden kun injicere GST ligand (20 ug / ml) opløsning til 420 sek ved 5 ul / min over henvisning Flow celle 1..

3. Overvågning On-chip Capture-cycloaddition af Funktionaliserede Molekyler

  1. Overvågning on-chip capture-cykloaddition i real-tid (figur 2).
    1. Placer GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) og regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0) opløsning hætteglas i reagenshylden 2. Vælg den mandUAL run metode, skal du indstille strømningshastigheden til 5 ul / min og flow sti til Flow celle 2.
    2. Injicere opløsningen af ​​GST-TCO for 420 sek.
    3. Injicere opløsningen af Tz-BnNH 2 for 600 sek.
    4. Regenerere overfladen med to 30 sek injektioner af regenerering løsning.
  2. Overvågning on-chip montering af flerkomponent-strukturer i realtid (figur 3):
    1. Placer GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) og regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0) opløsning hætteglas i reagenshylden 2. Vælg instrumentmanualen run metode, skal du indstille strømningshastigheden til 5 ul / min og strømmen sti til Flow celle 2.
    2. Indsprøjtes en opløsning af GST-Tz for 60 sek.
    3. Indsprøjtes en opløsning af NP-TCO for 60 sek.
    4. Sprøjt en opløsning af Tz-BnNH 2 for 60 sek.
    5. Regenerere overfladen med to 30 sek injektioner af regenerering løsning.

4.. MILSYN Immobilisering Densitet og Bestemmelse af Cycloaddition priser

  1. Karakterisering af småmolekyle cycloaddition reaktionshastigheder (Figur 4).
    1. Vælg Ny metode og input generelle parametre. I panelet assaytrin oprette et nyt skridt og navn det Sample. Indstil Formål og Slut baseindstillinger til prøve.
    2. I panelet Cycle Typer Opret en ny cyklus, og indsæt følgende kommandoer, Capture, Sample, Regeneration 1 og Regeneration 2.
    3. Vælg Capture kommandoen input ligand navn (GST-TCO, 20 mg / ml), kontakt tid 120 sek ved 5 ul / min og sæt strøm sti til: Second. Vælg Sample kommandoen input 180 sek kontakt tid, 60 sek dissociation tid, 30 ul / min flow og sæt strøm sti til: Both. Vælg Regeneration 1 kommandoen input regenereringsopløsning navn (10 mM glycin-HCI pH 2,0), kontakt tid på 30 sek ved 30 ul / min og sæt strøm sti til: Second. Gentag det samme for Regeneration 2 kommando. </ Li>
    4. Vælg Setup Run og indstille flow sti til: 2-1. Vælg næste og fylde prøve liste med analytopløsning (Tz-BnNH 2) og koncentration serien (0,3-10 uM, 1:2 fortynding). Vælg Næste for at rack position panel. Place løsning hætteglas i reagensstativ 2 og fortyndingsrække i 96-brønds plade og sørg for at matche de stillinger med indholdslisten. Gemmemetoden skabelon og starte bindingsassay. Binding data og kinetisk analyse er vist i figur 4.
  2. Karakterisering af NP cykloaddition reaktionshastigheder (Figur 4).
    1. Åbn den gemte metode skabelon fra oven og ændre følgende parametre. Vælg Capture panelet, ændre ligand navn til GST-Tz, 20 ug / ml. Vælg Sample panel, ændre kontakt tid til 120 sek kontakt tid og dissociation tid til 120 sek.
    2. Vælge listen prøven ændre analyt NP-TCO og koncentration serien (7-224 nM, 1:2 fortynding). Place løsning hætteglas i reagensstativ2 og fortyndingsrække i 96-brønds plade og sørg for at matche de stillinger med indholdslisten. Gemmemetoden skabelon og starte bindingsassay. Binding data og kinetisk analyse er vist i figur 4.

5.. Måling af Binding af FKBP12 til Immobilized AP1497

Omvendt orientering bindingsundersøgelser ansætte FKBP12 som analytten og forbindelse AP1497 immobiliseret ligand (figur 5). Den generelle metode til denne analyse er sat op som følger ved hjælp af metoden builder værktøj:

  1. Vælg Ny metode og input generelle parametre. I panelet assaytrin oprette og navn Capture, Sample og Regeneration trin. Vælg tilsvarende Formål og Connect base indstillinger.
  2. Vælg cyklus Typer panel og skabe 3 cyklus trin: Capture, Sample og regeneration.
  3. Sæt Capture kommando to gange under trin Capture cyklus. Vælg Capture 1 panel og vælge fange løsning som variable indstille kontakttid til 300 sekunder ved en strømningshastighed på 5 ul / min og sat strømningsvej til: Anden. Vælg Capture 2 panel og vælge fange løsning som variabel, sæt kontakt tid til 250 sek ved en flowhastighed på 5 ul / min og sæt strøm sti til: Second.
  4. Sæt Sample kommando under Sample skridt cyklus. Vælg Sample panelet, sæt kontakt tid til 60 sek, dissociation tid til 200 sek ved en flowhastighed på 30 ul / min og sæt strøm sti til: Both.
  5. Sæt Regeneration kommando to gange under Regeneration cyklus trin. Vælg panelet Regeneration 1, input regenereringsopløsning navn (10 mM glycin-HCI pH 2,0), kontakt tid på 30 sek ved 30 ul / min og sæt strøm sti til: Second. Gentag det samme for panelet Regeneration 2..
  6. Vælg Setup Run og indstille flow sti til: 2-1. Vælg Næste og input fange løsning navne (GST-TCO og AP1497-TZ), prøve navn (FKBP12), koncentration serien (0,020 til 5 mg / ml, 1:2 fortynding) og MW (13.000). Place løsning hætteglas i reagent rack 2 og fortyndingsrække i 96-brønds plade og sørg for at matche de stillinger med indholdslisten. Gemmemetoden skabelon og starte bindingsassay. Kinetisk analyse data er vist i figur 5.

6.. Måling af Binding af FKBP12 til AP1497 Vedhæftet Immobilized NP'er

Den generelle metode til nanopartikel immobilisering, lille molekyle derivatisering og FKBP12 bindingsassay er sat op som følger ved hjælp af metoden builder værktøj:

  1. Åbn den gemte metode skabelon fra oven og ændre. Indsæt et ekstra Capture kommando under trin Capture cyklus. Vælg Capture 1 panelet, fravælger fange løsning som variabel og navn fange løsning 1 (GST-Tz). Sæt kontakttid til 60 sekunder ved en strømningshastighed på 5 ul / min og sat strømningsvej til det andet. Vælg Capture 2 panel, fravælge fange løsning som variabel og navn fange løsning 2 (NP-TCO). Sæt kontakttid til 90 sekunder ved en strømningshastighed på 5 ul / min ogindstillet strømningsbane til anden. Vælg Capture 3 panelet, fravælge fange løsning som variabel og navn fange løsning 3 (AP1497-Tz). Sæt kontakttid til 180 sekunder ved en strømningshastighed på 5 ul / min og sat strømningsvej til det andet.
  2. Vælg Setup Run og indstille flow sti til: 2-1. Vælg næste to gange. Place løsning hætteglas i reagensstativ 2 og fortyndingsrække i 96-brønds plade og sørg for at matche de stillinger med indholdslisten. Gemmemetoden skabelon og starte bindingsassay. Kinetisk analyse data er vist i figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oplysninger og tal er blevet tilpasset fra henvisning 8.

Effektiv reversibel immobilisering af bioaktive små molekyler kontrol over orientering og tæthed spiller en central rolle i udviklingen af ​​nye biosensor applikationer. Brug den hurtige bioorthogonal reaktion mellem TCO og Tz beskriver vi en metode til trinvis samling og regenerering af ligand overflader med bibeholdelse af biologisk aktivitet 2 viser real-time overvågning af Tz-BnNH 2 immobilisering. Figur. En opløsning af GST-TCO injiceres over en præ-immobiliseret anti-GST-overflade resulterer i ~ 400 RU stigning i respons. En anden injektion med Tz-BnNH 2 viser en hurtig ~ 15 RUC stigning i respons. Ingen dissociation af derivatiseret antigen observeres efter skift til løbebuffer fremlægge bevis for struktur stabilitet. Overfladen regenereres i det sidste trin af cyklussen for at muliggøre flere capture-cykloaddition cyklusser. Osning denne procedure og udskiftning af Tz-BnNH 2 delen med AP1497-Tz molekyle genererer en bioaktive overflade, der benyttes til interaktionsforsøg med sit mål FKBP12 (figur 5). Afbrydelse af antistof / antigen-interaktion (som vist i figur 2) regenererer anti-GST-overflade, som tillader en ny molekylær samling, der skal bygges. I dette tilfælde er en GST-Tz injektion (indfangning af ~ 800 RU) følges med en injektion af NP-TCO (cykloaddition ~ 600 RU), effektivt at immobilisere nanopartikel til sensoren overflade (Figur 3). Ureageret TCO grupper på NP er tilgængelige for cykloaddition med injiceret Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Alternativt AP1497-Tz anvendes til at overvåge funktionaliserede nanopartikler-FKBP12 interaktioner (figur 5). Ingen dissociation af de multi-komponent strukturer (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) er iagttaget fremlægge bevis for struktur stabilitet og bioaktivitet (AP1497-Tz/FKBP12 bBINDENDE).

Med kapaciteter til real-time immobilisering (cykloaddition) reaktion overvågning og overflade regenerering, den ligefremme karakterisering af foreningen rate k en (cykloaddition rate) er udført som vist i figur 4.. Kendskab til reaktionskinetik indeholder retningslinjer for styring af immobilisering densitet (kontakt tid og koncentration), en vigtig parameter for biosensor analyser. Injektion stigende koncentrationer af Tz-BnNH 2 eller NP-TCO i to eksemplarer i løbet af GST-TCO eller GST-TZ overflader henholdsvis genererer de bindende data (røde linjer). De bindende data for to sekventielle analyt prøver af den samme koncentration over den samme overflade er næsten superimposable afspejler minimalt tab af antistof bindingskapacitet på grund af flere cykler af capture-cykloaddition og regeneration. Evaluering software giver det bedste resultat kinetiske analyser (sorte linjer ) til cycloaddition reaktionshastigheder k en i figur 4 viste.

Figur 1
Figur 1. Bioorthogonal konjugation strategi for reversibel immobilisering af derivatiserede molekyler. A. [4 +2] cykloaddition reaktion mellem trans-cycloocten (TCO) og 1,2,4,5-tetrazin (TZ)-grupper for at give 1,4-dihydropyridazin adduct . B. Eksperimentel ordning for reversibel immobilisering af Tz / TCO mærkede molekyler. C. Eksperimentel ordning for reversibel nanopartikler immobilisering og funktionalisering. Klik her for at se større figur .

mg src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" alt = "Figur 2" fo: content-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />
Figur 2. . Realtidsovervågning af små molekyle immobilisering 1) Baseline:. Præ-immobiliseret anti-GST 2) Capture injiceret GST-TCO af anti-GST-antistof (t = 0 til 420 sek), efterfulgt af injektion af løbebuffer (t . = 420-540 sek), der viser vedvarende vekselvirkning 3) Cycloaddition mellem erobrede GST-TCO og tetrazin (Tz-BnNH 2, ~ 15 RUC stigning i reaktion t = 540-1,140 sek). Intet signal henfald forekommer på trods af at skifte den mobile fase til at køre buffer (t = 1,140-1,820 sek.) 4) Regenerering af anti-GST-overflade med 2 korte injektioner af 10 mM glycin, pH 2.1 (t = 1,820-2,000 sek.)

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Real-time overvågning af nanopartiklers immobilisering og funktionalisering. 1) Baseline. 2) Capture af injiceret GST-Tz (t = 0-60 sek.) 3) Cycloaddition mellem erobrede GST-Tz og injiceres NP-TCO (t = 135-195 sek), efterfulgt af injektion af løbebuffer uden henfald signal (t = 195 til 300 sek.) 4) Cycloaddition mellem immobiliseret NP-TCO og injiceret Tz-BnNH 2 (~ 22 RU stigning i respons, t = 300-360 sek.) Der er ingen signalhenfaldet trods skifte den mobile fase til at køre buffer (t = 360 til 480 sek), der beviser for flerkomponent-stabilitet.

Figur 4
Figur 4.. Repræsentative sensorgrams viser bBINDENDE data (røde linjer) og kinetiske analyser (sorte linjer) for cycloadditionsreaktion mellem Tz og TCO mærkede molekyler i nærvær eller fravær af 100% FBS. Tabel opsummerer forening (cykloaddition) hastighedskonstanter, k en.

Figur 5
Figur 5. SPR undersøgelser af små molekyle / protein interaktioner i varierende konfigurationer (øverst) Syntetiske derivater af FK506:. AP1497 og AP1497-Tz. Tabellen viser kinetiske og ligevægt hastighedskonstanter afledt fra bindingsdata. Data fra bindende eksperimenter, hvor proteinet er immobiliseret (dvs. traditionelle SPR eksperimenter) er medtaget til sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne capture-cykloaddition metode muliggør hurtig, reversibel immobilisering af modificerede nanopartikler og små molekyler til label-fri chip-baserede interaktion og kinetiske undersøgelser. Immobiliseringen protokol kan udføres på få minutter kræver <10 uM koncentration af små molekyler ligander. Ved at modulere ligand koncentration og kontakttid immobiliseringstrin tætheder kan nøje kontrolleres. Vore data viser, at on-chip bioorthogonal reaktioner bevare muligheden for in situ-funktionaliserede nanopartikler eller immobiliserede små molekyler til at interagere med deres mål. Vi har også karakteriseret bimolekylære cycloaddition satser mellem to små molekyler, (TCO og TZ) med lave molekylvægte. Vi forestiller, at lignende analyser kan udføres for at måle og sammenligne satserne for andre hurtige bioorthogonal reaktioner.

Vendbar, konstant flow on-chip nanopartikel immobilisering og in-situ funktionalisering PRovides hurtig adgang til en række af modificerede nanopartikler til screening og interaktion analyse alle i samme eksperiment. 13-15 Sammenlignet med konventionel nanopartikel syntese, som kræver forskellige trin til rensning, immobilisering og screening, vores metode i høj grad reducerer input mængder af biomaterialer, opløsningsmidler og reagenser, mens miljøhensyn beskæftiger sig med nanopartikel anvendelse og bortskaffelse samtidig faldende. 16. Det er vigtigt, nanopartikel funktionalisering reaktioner er robust over for tilstedeværelsen af serumkoncentrationer typisk anvendes til cellekultur forsøg, og endda til ekstremt høje serumkoncentrationer. Denne funktion kan lette struktur-aktivitets-relationer for nanopartikel design i nærvær af serum (som kan påvirke protein korona og overfladeegenskaber nanopartikel). 17,18

I de fleste SPR assays, hvis protein-småmolekyle interaktioner er studeret, proteinet (ligand) erimmobiliseret via et affinitetsmærke (GST, biotin, etc.) eller ved hjælp af covalente amidbindinger. Analytten passerer gennem liganden hvor bindende resultater i overfladen masse variationer, der er detekteret som brydningsindeks ændringer. Vende den kanoniske SPR orientering og immobilisere den lille molekyle i en praktisk og reversibel vis giver facile adgang til at studere direkte binding af opløselige makromolekylære mål og præciserer fasespecifik (immobiliseret vs opløselige) artefakter. 19,20 Assay formater af denne type er især værdifulde for hæmning og konkurrence undersøgelser. 21. Tilbageførsel af orientering kan også være en fordel under flere omstændigheder, dvs a) med analytter med lav molekylvægt, overvejer at bindende signal er proportional med overfladen masseændring b), sammenlægning og ikke-specificitet hydrofobe analytter 22 elimineres gør dataanalyse ligetil c) karakterisering af høj affinitet bindere kanvære udfordrende på grund af lange opholdstider (langsom off-satser, især når der beskæftiger sig med kovalente hæmmere) 23 og behovet for overfladevand regenerering forhold i forberedelse til den næste analyse cyklus d) regenerering midler kan have nedbrydende virkninger på struktur eller funktion immobiliseret protein.

Ved at indarbejde bioorthogonal capture-cykloaddition metoden som en del af vores immobilisering strategi, vi omgå nogle af de vanskeligheder, der er forbundet med konventionelle lille molekyle immobiliseringsteknikker. Disse kræver meget højere koncentrationer ligand da elektrostatiske attraktioner fører til overfladen præ-koncentrationer er typiske for protein immobilisering protokoller er ineffektive med små molekyler. Følgelig stigende koncentrationer af ligander fører til stigende forhold af organisk co-opløsningsmiddel for ligand opløsning. Begge disse forhold er ikke kompatible med mikro-strømningstekniske flowsystemer og som en konsekvens, konventionelt immobilizations skal udføres uden for det instrument, hvor real-time overvågning er ikke mulig. 24. Endelig i tilfælde af en vellykket konventionel immobilisering, kovalente overfladebehandling forhindrer overflade regenerering og begrænser den eksperimentelle vifte af biosensor overflader resulterer i øgede investeringer i tid, kræfter og omkostninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi anerkender midler fra NIH (NHLBI kontrakt nr. HHSN268201000044C til RW, SH og SYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats