Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen

Published 9/23/2013
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Chemistry

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Summary

Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture.

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Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

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Abstract

Methoden für die schnelle Oberfläche Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Orientierung und Immobilisierungsdichte für Biosensor und Microarray-Anwendungen sehr wünschenswert. In dieser Studie verwenden wir eine hocheffiziente kovalente bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz), um den mikrofluidischen Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten Moleküle ermöglichen . Wir überwachen den Prozess in Echtzeit unter Dauerdurchflussbedingungen mit Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Reversible Immobilisierung zu ermöglichen und sich die experimentellen Bereich der Sensorfläche verbinden wir eine nicht-kovalente Antigen-Antikörper-Einfang-Komponente mit der Cycloaddition. Durch abwechselndes präsentiert TCO oder Tz Einheiten an die Sensoroberfläche, mehrere Capture-Cycloadditionen nun auf einer Sensoroberfläche für On-Chip-Aufbau und Wirkungsstudien zu einer Vielzahl von Mehrkomponentenstrukturen. Wir illustrate dieses Verfahren mit zwei verschiedenen Experimenten Immobilisierung auf einem Biosensorchip, ein kleines Molekül, AP1497, die FK506-bindendes Protein 12 (FKBP12) bindet und die gleiche kleine Molekül als Teil eines immobilisierten und in situ-funktionalisierten Nanopartikel.

Introduction

Effizienten Konjugationsreaktionen sind wertvolle Werkzeuge für die Befestigung bioaktiver Moleküle auf Oberflächen für eine Vielzahl von Anwendungen der Biotechnologie. Vor kurzem hat die sehr schnell bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz) wurde verwendet, um Zelloberflächen subzellulärer Strukturen, Antikörpern und Nanopartikeln zu markieren ein. - 7 Hier verwenden wir die [4 +2]-Cycloaddition in Verbindung mit Antigen / Antikörper-Capture (GST / anti-GST) für reversible on-Chip-Synthese von Mehrkomponenten-Strukturen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Interaktionsanalyse und Überwachung der Prozess in Echtzeit (Abbildung 1). 8,9 Insbesondere die Einnahme-Cycloaddition Strategie ermöglicht Regeneration Oberfläche mit einem festgelegten Protokoll. 8 Als Folge Montage stabile Sensorflächen mit der Kontrolle über Liganden Orientierung und Dichte für eine Vielzahl von neuen Tests Formate ist nun möglich. MitDiese Strategie, die wir zeigen die Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten kleine Moleküle und zeichnen die Cycloaddition Raten in einer Vielzahl von Pufferbedingungen. Wir wählten die bekannte Interaktion zwischen FKBP12 und einem Molekül, das AP1497 10-12 FKBP12 bindet, als ein Beispiel, um zu überprüfen, dass das Capture-Cyclo Strategie erhält die Fähigkeit des kleinen Moleküls um sein Ziel zu interagieren, wenn entweder direkt an immobilisierte GST-Antigene gebunden oder immobilisiert Nanopartikel (NP).

Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Zuerst wird nun die reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen auf Sensorchips möglich. Zweitens TCO / Tz Immobilisierung kleiner Moleküle ermöglicht auch markierungsfreie Interaktionsstudien, die die Ausrichtung der kanonischen SPR Studien umzukehren, und kann eine komplementäre Ansicht eines Bindungswechsel bieten. Drittens, ermöglicht dieses Verfahren die mikrofluidische Synthese gezielt Nanopartikel und sofortige Auswertung ihrer Binding Eigenschaften. Dies verspricht, die Effizienz der Auswertung oder Screening-Nanopartikel gezielt zu verbessern und auch eine Verringerung der Mengen von Nanopartikeln erforderlich. 13-15 Viertens, kann dieser Ansatz die Reaktionskinetik der bioorthogonale Cycloadditionsreaktionen in Echtzeit unter Dauerstrom zu messen. Schließlich ist die TCO / Tz Immobilisierung Chemie in Gegenwart von Serum robust. Insgesamt erwarten wir, dass dieses vielseitige Ansatz wird allgemein erleichtern Aufbau stabiler Sensorflächen für eine Vielzahl von mikrofluidischen Studien mit Relevanz für die in-vitro-und in-vivo-Zellanwendungen.

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Protocol

1. Herstellung von GST und Nanopartikel (NP) Konjugate

  1. GST-TCO Zubereitung:
    1. Hinzufügen 8 ul TCO-NHS-Lösung (50 mM in DMSO) und 100 &mgr; l GST (1 mg / ml in PBS) hinzugefügt und bei RT für 1 Stunde.
    2. Überschüssiges Reagens unter Verwendung einer Zeba Spin Entsalzungssäule. Das zurückgewonnene Filtrat, das das GST-TCO-Konjugat wird bei 4 ° C vor der Verwendung gelagert.
  2. GST-Tz Zubereitung:
    1. Sie 6 ul Tz-NHS-Lösung (25 mM in DMF) und 75 &mgr; l GST (1 mg / ml in PBS) hinzugefügt und bei RT für 1 Stunde.
    2. Verdünne das Reaktionsgemisch mit 25 &mgr; l PBS und Reinigung unter Verwendung einer Spin-Säule entsalzt. Das Filtrat, das das GST-Tz-Konjugat wird bei 4 ° C vor der Verwendung gelagert.
    Hinweis: Massenanalysen (MALDI-TOF) zeigt, dass im Durchschnitt ~ 10 Tz oder TCO-Moleküle wurden an GST konjugiert.
  3. NP-TCO Zubereitung:
    1. 100 l TCO-NHS-Lösung (50 mM in DMSO), um150 ul aminierten Nanopartikel (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml in PBS, 3 nm Eisenkern ~ 8.000 Fe / NP) und schüttelt bei RT für 1 Stunde.
    2. Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Gelfiltration unter Verwendung einer NAP-10-Säule mit PBS-Puffer eluiert. Sammeln Sie die farbigen Bande, die das NP-TCO Produkt.
    3. Das Filtrat wird bis zu einem Endvolumen von ~ 150 &mgr; l unter Verwendung einer Filterzentrifuge (100 K MWCO).
    4. Dann werden 50 ul Bernsteinsäureanhydrid (0,1 M in DMSO) mit dem NP-TCO-Lösung und Schütteln bei RT für 1 h (anhydrid mit den verbliebenen Amine terminalen Carbonsäuren reagiert. Dies verhindert unspezifische Wechselwirkungen mit dem Dextran-Oberfläche).
    5. Reinige den NP-TCO-Produkts mit Hilfe einer NAP-10-Säule, wobei mit PBS. Bewahren Sie die Lösung von NP-TCO bei 4 ° C vor der Verwendung.

2. Oberflächenvorbereitung

Alle Oberflächen-Plasmonresonanz-Tests werden auf einem Biacore T100 Gerät (GE Healthcare) durchgeführt, bei25 ° C unter Verwendung eines CM5-Sensorchip und P-PBS als Laufpuffer, sofern nicht anders vermerkt. Biacore Steuer-und Auswerte-Software mit dem Gerät geliefert werden, zum Aufbau von Versuchen und Analyse von Daten beschäftigt. Zwei Betriebsarten, Anwendungs ​​Assistenten und Handlauf für die Oberflächenvorbereitung und-überwachung auf dem Chip-Capture-Cycloaddition verwendet werden. Die Methode builder-Modus wird für die Einrichtung umgekehrter Orientierung und Bindungsexperimente zur Messung Cycloaddition Reaktionsraten verwendet werden. Daten sind doppelt Referenz subtrahiert und kinetische Analysen werden mit einem 1:1 Langmuir Bindungsmodell durchgeführt.

  1. Verwenden Sie den Assistenten Vorlage Amin Immobilisierung und wählen Immobilisierung auf Flusszellen 1 (Referenz) und 2 (Nachweis). Verfahren zum Modifizieren Amin Oberfläche Carboxylgruppen durch Injektion einer 1:1-Lösung von 0,4 M EDC aktivieren: 0,1 M NHS für 480 Sekunden bei einer Flussrate von 10 &mgr; l / min. Stellen Sie die Injektion von Ethanolamin zu verbleibenden aktivierten Ester bis 420 sec Kontaktzeit bei stilleneine Durchflussrate von 10 &mgr; l / min.
  2. Eingangs Ligand Name, anti-GST (18 &mgr; g / ml in Acetatpuffer, pH 5,0) eingestellt, und für eine Kontaktzeit von 420 Sekunden bei einer Flussrate von 10 &mgr; l / min injiziert.
  3. Zeigen Lösung erforderlich Fläschchen in Reagenzhalter 2 dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Speichern und starten Immobilisierung.
    Hinweis: Das Ausführen des Assistenten Immobilisierung auf diese Weise führt in anti-GST Immobilisierung Ebenen im Bereich von ~ 14.000 bis 17.000 RU.
  4. Bearbeiten Sie die Immobilisierung Assistenten, um nur zu injizieren GST-Liganden (20 ug / ml)-Lösung für 420 s bei 5 ul / min über Referenzflusszelle ein.

3. Überwachung On-Chip-Capture-Cycloaddition funktionalisierter Moleküle

  1. Überwachung On-Chip-Capture-Cycloaddition in Echtzeit (Abbildung 2).
    1. Zeigen GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) und Regeneration (10 mM Glycin, pH = 2,0)-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2. Wählen Sie den Mannmanuelle run-Methode, stellen Sie die Durchflussmenge bis 5 ml / min und Strömungspfad zu Zelle 2 fließen.
    2. Inject Lösung von GST-Gesamtbetriebskosten für 420 sek.
    3. Inject Lösung von Tz-BnNH 2 für 600 Sekunden.
    4. Generieren Sie die Oberfläche mit zwei Injektionen von 30 Sekunden Regenerationslösung.
  2. Überwachen on-Chip-Montage von Mehrkomponentenstrukturen in Echtzeit (Fig. 3):
    1. Platzieren GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 &mgr; M) und die Regeneration (10 mM Glycin, pH = 2,0) Lösung in Ampullen Reagenzienrack 2. Wählen Sie das Instrument Handlauf-Methode das Durchflussmenge bis 5 ml / min und der Strömungspfad zu Zelle 2 fließen.
    2. Spritzen Sie eine Lösung von GST-Tz 60 Sekunden.
    3. Spritzen Sie eine Lösung von NP-TCO für 60 Sekunden.
    4. Spritzen Sie eine Lösung von Tz-BnNH 2 für 60 Sekunden.
    5. Generieren Sie die Oberfläche mit zwei Injektionen von 30 Sekunden Regenerationslösung.

4. MONITORING Immobilisierung Dichte und Bestimmung von Cyclo Preise

  1. Charakterisierung von niedermolekularen Cycloaddition Raten (Abbildung 4).
    1. Wählen neuen Verfahren und Eingabe allgemeinen Parameter. In der Testschritte Panel einen neuen Schritt an und nennen Sie es Sample. Stellen Sie den Zweck und Schließen Basis-Einstellungen zu probieren.
    2. In der Platte Zyklustypen erstellen einen neuen Zyklus Schritt und setzen Sie die folgenden Befehle, Capture-, Probe, Regeneration 1 und 2 Regeneration.
    3. Wählen Sie den Befehl Capture-, Eingabe-Ligand-Namen (GST-TCO, 20 pg / ml), der Kontaktzeit 120 s bei 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wählen Sie den Befehl Muster; Eingang 180 Sek. Kontaktzeit, 60 Sek. Dissoziation Zeit, 30 ml / min Volumenstrom und Strömungspfad gesetzt: Beides. Wählen Sie den Befehl Regeneration 1, Eingang Regenerationslösung Namen (10 mM Glycin-HCl pH 2,0), der Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wiederholen Sie den Befehl für 2 Regeneration. </ Li>
    4. Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen nächste und füllen Beispielliste mit Analyt-Lösung (Tz-BnNH 2) und Konzentrationsreihe (0,3-10 uM, 1:2 Verdünnung). Wählen Sie neben Position Panel Rack. Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Bindungsdaten und kinetische Analyse sind in Fig. 4 gezeigt.
  2. Charakterisierung von NP-Cycloaddition Raten (Abbildung 4).
    1. Öffnen Sie die gespeicherte Methodenvorlage von oben und ändern Sie die folgenden Parameter. Wählen Sie das Aufnahmefenster; Änderung Ligand Namen GST-Tz, 20 ug / ml. Wählen Sie die Mustertafel; Änderung Kontaktzeit auf 120 Sekunden Kontaktzeit und Dissoziation Zeit, um 120 Sekunden.
    2. Wählen Sie die Beispielliste, ändern Analyten NP-TCO und Konzentrationsreihe (7-224 nM, Verdünnung 1:2). Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Bindungsdaten und kinetische Analyse sind in Fig. 4 gezeigt.

5. Die Messung der Bindung von FKBP12 immobilisiert AP1497

Umgekehrt Orientierung Bindungsstudien beschäftigen FKBP12 als Analyt und Verbindung AP1497 als immobilisierte Liganden (Abbildung 5). Die allgemeine Methode für diesen Test ist wie folgt mit der Methode Builder-Tool einstellen:

  1. Wählen neuen Verfahren und Eingabe allgemeinen Parameter. In der Testschritte Platte erstellen und benennen Capture-, Muster-und Regenerationsschritte. Wählen entsprechenden Zweck und Schließen Basis-Einstellungen.
  2. Wählen Zyklustypen Platte und erstellen 3-Zyklus vor: Capture-, Probe-und Regeneration.
  3. Legen Sie die Capture-Befehl zweimal unter Capture-Schritt-Zyklus. Wählen Sie das Capture-1-Panel und wählen Sie Capture-Lösung als variable, gesetzt Kontaktzeit auf 300 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wählen Sie das Capture-2-Panel und wählen Sie Capture-Lösung, wie variabel, bei einer Flussrate von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad gesetzt Kontaktzeit 250 Sek.: Zweiter.
  4. Legen Sie die Probe unter dem Befehl Musterzyklusschritt. Wählen Sie die Mustertafel; Satz Kontaktzeit auf 60 sec, Dissoziation Zeit auf 200 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Beides.
  5. Setzen Sie den Befehl Regeneration zweimal unter der Regeneration Zyklusschritt. Wählen Sie die Regeneration ein Tafel; Eingangsregenerationslösung Namen (10 mM Glycin-HCl pH 2,0), der Kontaktzeit von 30 Sekunden bei 30 ml / min eingestellt und Strömungspfad: Zweiter. Wiederholen Sie das gleiche für die Regeneration 2-Panel.
  6. Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen nächste und Input-Capture-Lösung Namen (GST-TCO und AP1497-Tz), Probennamen (FKBP12), Konzentrationsreihe (0,020 bis 5 g / ml, Verdünnung 1:2) und MW (13.000). Platz-Lösung in Ampullen reAgent Rack 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Kinetischen Analysedaten sind in Fig. 5 gezeigt.

6. Die Messung der Bindung von FKBP12 an AP1497 an immobilisiertes NPs angebaute

Das allgemeine Verfahren zur Immobilisierung von Nanopartikeln, kleines Molekül Derivatisierung und FKBP12-Bindungstest wird wie folgt mit der Methode Builder-Tool-Set-up:

  1. Öffnen Sie die gespeicherte Methodenvorlage von oben und ändern. Legen Sie eine zusätzliche Capture-Befehl unter Capture-Schritt-Zyklus. Wählen Sie das Capture-1 Tafel; deaktivieren Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 1 (GST-Tz). Set Kontaktzeit bis 60 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad zum Zweiten. Wählen Sie das Capture-2-Panel, deaktivieren Sie Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 2 (NP-TCO). Satz Kontaktzeit auf 90 s bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 &mgr; l / min undgesetzt Strömungspfad auf den zweiten. Wählen Sie das Capture-3-Panel; deaktivieren Capture-Lösung als Variablenname und Capture-Lösung 3 (AP1497-Tz). Set Kontaktzeit auf 180 s bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min eingestellt und Strömungspfad zum Zweiten.
  2. Wählen Sie Setup ausführen und Strömungspfad zu: 2-1. Wählen Sie zweimal auf Weiter. Platz-Lösung in Ampullen Reagenzhalter 2 und Verdünnungsreihe in 96-Well-Platte dafür, dass die Positionen mit der Inhaltsliste übereinstimmen. Sparen Methodenvorlage und starten Bindungsassay. Kinetischen Analysedaten sind in Fig. 5 gezeigt.

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Representative Results

Daten und Zahlen wurden von der Referenz 8 angepasst.

Effiziente reversible Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Ausrichtung und Dichte spielt eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Anwendungen in der Biosensorik. Verwendung des schnellen bioorthogonalen Reaktion zwischen TCO und Tz beschreiben wir ein Verfahren zur schrittweisen Aufbau und Regeneration von Ligand Oberflächen unter Beibehaltung der biologischen Aktivität. Fig. 2 zeigt die Echtzeit-Überwachung der Tz-BnNH 2 Immobilisierung. Eine Lösung von GST-TCO über einen vorimmobilisiert anti-GST-Oberfläche, was zu ~ 400 RU Anstieg in Reaktion injiziert. Eine zweite Injektion mit Tz-BnNH 2 zeigt eine schnell ~ 15 RU Anstieg in der Antwort. Kein Dissoziation des derivatisierten Antigen nach dem Umschalten auf Laufpuffer Nachweis für die Strukturstabilität beobachtet. Die Oberfläche wird im letzten Schritt des Zyklus regeneriert, um mehrere Capture-Cyclozyklen zu ermöglichen. Unsten dieses Verfahren und Austausch der Tz-BnNH 2-Einheit mit dem AP1497-Tz Molekül erzeugt eine bioaktive Oberfläche für die Interaktionsstudien mit seinen Ziel FKBP12 (Abbildung 5) verwendet. Unterbrechung des Antikörper / Antigen-Wechselwirkung (wie in Fig. 2 gezeigt) regeneriert den anti-GST-Oberfläche, so dass eine neue molekulare Anordnung aufgebaut werden. In diesem Fall wird ein GST-Tz Injektion (Erfassung von ~ 800 RU) mit einer Injektion von NP-TCO (Cyclo ~ 600 RU) gefolgt, effektiv Immobilisierung der Nanopartikel an die Sensoroberfläche (Fig. 3). Nicht umgesetztes TCO-Gruppen auf der NP sind für Cycloaddition mit injiziert Tz-BnNH 2 (~ 22 RU) zur Verfügung. Alternativ AP1497-Tz wird verwendet, um funktionalisierte Nanopartikel-FKBP12-Wechselwirkungen (Fig. 5) zu überwachen. Keine Spaltung der Mehrkomponentenstrukturen (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) beobachtet Nachweis für Strukturstabilität und Bioaktivität (b AP1497-Tz/FKBP12Inding).

Mit Funktionen für die Echtzeit-Immobilisierung (Cycloaddition) Reaktionsüberwachung und Oberflächenerneuerung, die einfache Charakterisierung der Assoziationsrate k a (Cycloaddition Rate) erreicht, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kenntnis der Reaktionskinetik enthält Richtlinien für die Steuerung Immobilisierungsdichte (Kontaktzeit und Konzentration), ein wichtiger Parameter für die Biosensor-Assays. Injizieren steigenden Konzentrationen von Tz-BnNH 2 oder NP-TCO in Doppel GST-TCO oder GST-TZ Oberflächen bzw. erzeugt die Bindungsdaten (rote Linien). Die Bindungsdaten für zwei aufeinanderfolgende Analyten Proben der gleichen Konzentration über die gleiche Oberfläche sind nahezu deckungs reflektieren minimalen Verlust von Antikörper-Bindungskapazität durch mehrere Zyklen von Capture-Cycloaddition und Regeneration. Das Evaluation-Software bietet die Best-Fit-kinetische Analysen (schwarze Linien ) für die cycloaddition Reaktionsgeschwindigkeiten k in Abbildung 4 dargestellt ein.

Figur 1
Fig. 1 ist. Bioorthogonalen Konjugation Strategie zur reversiblen Immobilisierung von derivatisierten Molekülen. A. [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) Einheiten, die an die 1,4-Dihydropyridazin-Addukt . B. Versuchsschema für die reversible Immobilisierung von Tz / TCO markierte Moleküle. C. Versuchsschema für die reversible Immobilisierung und Funktionalisierung von Nanopartikeln. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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2. 2) Aufnahme vorge immobilisierten anti-GST von eingespritztem GST-TCO durch anti-GST-Antikörper (t = 0-420 sec), gefolgt von der Injektion von Laufpuffer (t: Echtzeit-Überwachung von Kleinmolekül-Immobilisierung 1) Ausgangs.. . = 420-540 sec), die Persistenz der Interaktion 3)-Cycloaddition zwischen erfassten GST-TCO und tetrazin (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU Anstieg der Reaktion t = 540-1,140 sec). Keine Signalabschwächung tritt trotz Umschalten der mobilen Phase auf Laufpuffer (t = 1,140-1,820 s). 4) Regeneration der anti-GST-Oberfläche mit 2 kurzen Injektionen von 10 mM Glycin, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 s).

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3. Echtzeit-Überwachung von Nanopartikel-Immobilisierung und Funktionalisierung. 1) Baseline. 2) Erfassung des eingespritzten GST-Tz (t = 0-60 sec). 3)-Cycloaddition zwischen erfassten GST-Tz und injiziert NP-TCO (t = 135-195 sec), gefolgt von der Injektion von Laufpuffer ohne Abklingen des Signals (t = 195 bis 300 sec). 4)-Cycloaddition zwischen immobilisierten NP-TCO-und Tz-BnNH 2 injiziert (~ 22 RU Anstieg der Reaktion, T = 300-360 sec). Es gibt keine Signalabfall trotz Wechsel der mobilen Phase zu Laufpuffer (t = 360 bis 480 sec) den Nachweis für Mehrkomponenten-Stabilität.

Fig. 4
4. Repräsentative Sensorgramme, die binding Daten (rote Linie) und kinetische Analysen (schwarze Linien) für die Cycloadditionsreaktion zwischen Tz und TCO-markierte Moleküle in Gegenwart oder Abwesenheit von 100% FBS. Tabelle fasst Association (Cycloaddition) Geschwindigkeitskonstanten k a.

Figur 5
5. SPR-Studien von kleinen Molekül / Protein-Interaktionen in unterschiedlichen Konfigurationen (Top) Synthetische Derivate von FK506:. AP1497 und AP1497-Tz. Die Tabelle zeigt, kinetische und Gleichgewichtskonstanten von Bindungsdaten abgeleitet. Daten von Bindungsexperimenten, bei denen das Protein immobilisiert ist (dh herkömmlichen SPR-Experimente) sind zum Vergleich eingeschlossen.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode Capture-Cycloaddition ermöglicht eine schnelle, reversible Immobilisierung von modifizierten Nanopartikeln und kleine Moleküle für markierungsfreie Chip-basierte Interaktion und kinetische Untersuchungen. Die Immobilisierung Protokoll kann in Minuten erfordern <10 uM Konzentrationen von niedermolekularen Liganden durchgeführt werden. Durch Modulation Liganden-Konzentration und Kontaktzeit Immobilisierung Dichten genau kontrolliert werden. Unsere Daten zeigen, dass auf dem Chip bioorthogonale Reaktionen erhalten die Fähigkeit der in-situ-funktionalisierten Nanopartikeln immobilisiert oder kleinen Molekülen, um mit ihren Zielen zu interagieren. Wir haben auch zwei kleine Moleküle (TCO und Tz) mit niedrigem Molekulargewicht gekennzeichnet bimolekularen Cycloaddition Raten. Wir stellen uns vor, dass ähnliche Tests durchgeführt, um zu messen und vergleichen Preise von anderen schnell bioorthogonale Reaktionen werden.

Reversible, kontinuierlichen On-Chip-Nanopartikel-Immobilisierung und in-situ-Funktionalisierung provides schnellen Zugriff auf eine Vielzahl von modifizierten Nanopartikeln für Screening-und Interaktionsanalyse alle im gleichen Experiment. 13-15 im Vergleich zu herkömmlichen Synthese von Nanopartikeln, die verschiedene Schritte zur Reinigung, Immobilisierung und Screening erfordert, stark unsere Methode Eingangsgrößen von Biomaterialien, Lösungsmittel reduziert und Reagenzien, bei gleichzeitiger Reduzierung der Umweltbelange, die sich mit Nanopartikeln Verwendung und Entsorgung. 16. Wichtig ist, dass Nanopartikel Funktionalisierungen robust Gegenwart von Serumkonzentrationen typischerweise für Zellkulturexperimente verwendet werden, und auch eine extrem hohe Serumkonzentrationen. Diese Funktion kann von Struktur-Wirkungs-Beziehungen für Nanopartikel Design in Gegenwart von Serum (das die Proteinkorona und Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel beeinflussen können) zu erleichtern. 17,18

In den meisten SPR-Assays, in denen Protein-Kleinmolekül-Wechselwirkungen untersucht werden, ist das Protein (Ligand)durch einen Affinitäts-Tag (GST, Biotin, etc.) oder durch kovalente Amidbindungen immobilisiert. Der Analyt wird dann über die Ligandenbindungsergebnisse geleitet, wo der Oberflächenmassenvariationen, die als Änderungen des Brechungsindex festgestellt werden. Die Umkehrung der kanonischen SPR Ausrichtung und Fixierung des kleinen Moleküls in eine bequeme und reversibel bietet einfachen Zugang direkte Bindung von löslichen makromolekularen Ziele zu studieren und stellt klar, phasenspezifische (immobilisiert vs löslich) Artefakte. 19,20 Assay-Formate dieser Art sind vor allem wertvoll für die Hemmung und Wettbewerbsstudien. 21. Umkehr der Orientierung kann auch vorteilhaft sein, unter mehreren Umständen, dh a) mit Analyten mit niedrigem Molekulargewicht, wenn man bedenkt, dass die Bindung Signal proportional zur Oberflächenmassenänderung b) Aggregation und Nicht-Spezifität von hydrophoben Analyten 22 eliminiert macht Datenanalyse einfach c) Charakterisierung von hochaffinen Bindemittel könneneine Herausforderung aufgrund der langen Aufenthaltszeiten (langsam off-Tarife, vor allem beim Umgang mit kovalenten Inhibitoren) 23 und die Notwendigkeit zur Regeneration Oberflächenbeschaffenheit in der Vorbereitung für den nächsten Analysezyklus d) Regenerationsmittel können erniedrigende Wirkung auf die Struktur oder Funktion des haben immobilisierten Protein.

Durch die Einbindung der bioorthogonale Capture-Cycloaddition Verfahren als Teil unserer Strategie Immobilisierung, zu umgehen, haben wir einige der Schwierigkeiten, die mit herkömmlichen kleinen Molekül Immobilisierungstechniken verbunden. Diese erfordern viel höher Liganden-Konzentrationen, da elektrostatische Anziehung, die zu Oberflächen typisch für Proteinimmobilisierung Protokolle vor-Konzentrationen sind unwirksam, mit kleinen Molekülen. Dementsprechend steigenden Konzentrationen von Liganden führt zu einer zunehmenden Verhältnissen von organischen Co-Lösungsmittel für die Liganden Auflösung. Beide Bedingungen sind nicht mit Mikrofluid-Strömungssystemen kompatibel und als Folge können herkömmliche immobilizations müssen außerhalb des Gerätes, wo Echtzeit-Überwachung ist nicht möglich. Schließlich 24, im Falle einer erfolgreichen konventionellen Immobilisierung verhindert kovalente Oberflächenmodifizierung Oberfläche Regeneration und begrenzt den experimentellen Bereich von Biosensor-Oberflächen, was zu erhöhten Investitionen in Zeit, Aufwand durchgeführt werden und Kosten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Wir erkennen die Finanzierung von NIH (NHLBI Vertrag Nr. HHSN268201000044C Rw, SH und SYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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