Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yönlendirme ve immobilizasyon yoğunluğu üzerinde kontrol ve biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hızlı yüzey hareketsizleştirilmesi için yöntemler biyosensör ve mikro-dizi uygulamalar için oldukça tercih edilir. Bu çalışmada, TCO / TZ-türevli moleküllerin mikroakışkan immobilizasyon sağlamak için son derece verimli bir kovalent bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo reaksiyon ve 1,2,4,5-tetrazin (TZ) kullanın . Biz, yüzey plazmon rezonans (SPR) kullanılarak sürekli akış koşulları altında, gerçek zamanlı olarak işlem izler. Geri immobilizasyon sağlamak ve sensör yüzeyinin deneysel aralığını genişletmek için, ile siklo ilave reaksiyonu, bir kovalent olmayan bir antijen-antikor yakalama bileşeni birleştirir. Alternatif olarak sensör yüzeyine TCO veya Tz parçaları sunarak, birden çok yakalama-siklo işlemleri, çok-bileşenli yapıların çeşitli yonga montaj ve etkileşim çalışmaları için, bir sensor yüzeyi üzerinde artık mümkün. Biz i, küçük molekül, FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) bağlanan AP1497,, iki, bir biyo-algılayıcı çip üzerinde farklı hareketsiz kılma deneyleri ile bu yöntemi llustrate ve aynı küçük molekül, bir hareketsiz kılınmış ve in situ işlevselleştirilmiş nanoparçacık parçası olarak kullanılabilir.

Introduction

Etkili dönüşüm reaksiyonları biyoteknoloji çeşitli uygulamalar için yüzeylerine biyoaktif moleküllerin bağlanması için değerli araçlardır. Son zamanlarda, çok hızlı bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu ve 1,2,4,5-tetrazin (Tz) hücre yüzeyleri, alt-hücresel yapılar, antikorlar ve nanopartiküller etiketlemek için kullanılmıştır: 1. - Burada 7, biz Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) etkileşim analizi için çok bileşenli yapıların geri çip üzerinde sentezi için, antijen / antikor yakalama (GST / anti-GST) ile kombinasyon içindeki [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu kullanmak ve monitör gerçek zamanlı olarak işlem (Şekil 1). yeni deneyinin çeşitli ligand yönelim ve yoğunluğu üzerinde kontrol ve stabil sensor yüzeylerinin bir sonucu olarak, montaj olarak 8,9 Kayda değer şekilde, yakalama-siklo strateji kurulu bir protokol kullanılarak yüzey yenilenme sağlar. 8 biçimleri artık mümkün. KullanmaBu strateji, biz TCO / Tz türetilmemiş küçük moleküllerin immobilizasyon göstermek ve tampon koşulları çeşitli siklo oranları karakterize eder. Bu, ya doğrudan hareketsiz antijenlere GST bağlandıklarında yakalama-siklo stratejisi hedefiyle etkileşim için küçük molekülün yeteneğini korur doğrulamak için bir örnek olarak FKBP12 10-12 bağlanan terimi, FKBP12'nin ve bir molekül AP1497 arasında iyi bir etkileşime seçtik ya da hareketsiz nanopartiküller (NPS).

Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, sensör çipi küçük moleküllerin geri dönüşümlü hareketsiz mümkündür. İkinci olarak, küçük moleküllerin TCO / Tz hareketsizleştirici da kurallı SPR çalışmalar yönünü tersine etiketi içermeyen etkileşim çalışmaları sağlayan ve bağlayıcı bir etkileşim tamamlayıcı bir görünüm sağlayabilir. Üçüncü olarak, bu yöntem, hedefli nanopartiküllerin mikroakışkan sentezini ve bunların bağlanma özelliğinin hemen değerlendirilmesini sağlarg özellikleri. Bu, hedefli nanopartiküller değerlendirilmesi ya da tarama verimliliğini artırmak ve aynı zamanda gerekli nanopartiküllerin miktarlarını azaltmak için söz. Dördüncü 13-15, bu yöntem sürekli akışı altında, gerçek zamanlı olarak bioorthogonal siklo reaksiyonların reaksiyon kinetiği ölçebilir. Son olarak, TCO / Tz immobilizasyon kimya serum mevcudiyetinde sağlamdır. Birlikte ele alındığında, bu çok yönlü yaklaşım, genel olarak in vitro ve in vivo hücre uygulamalarında alaka ile mikroakışkan çalışmaları geniş bir yelpazede için kararlı sensör yüzeylerinin yapımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. GST ve nanopartikül (NP) Konjugatlarının Hazırlanması

  1. GST-TCO hazırlık:
    1. GST (PBS içinde 1 mg / ml) 100 ul TCO-NHS solüsyonu 8 ul (DMSO içinde 50 mM) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır.
    2. Bir Zeba eğirme tuz giderme kolonu kullanılarak, fazla belirtecin çıkarın. GST-TCO eşleniği ihtiva eden geri Süzülen madde, kullanımdan önce 4 ° C'de saklanır.
  2. GST-Tz hazırlanması:
    1. GST (PBS içinde 1 mg / ml) 75 ul Tz-NHS çözeltisi 6 ul DMF (25 mM) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır.
    2. PBS içinde 25 ul reaksiyon karışımının seyreltin ve bir dönüş tuz giderme kolonu kullanılarak saflaştırılması. GST-Tz eşleniği ihtiva eden süzüntü, kullanımdan önce 4 ° C'de saklanır.
    Not: Kütle analizi (MALDI-TOF) ortalama ~ 10 Tz veya TCO molekülleri GST konjuge edilmiş olduğunu göstermiştir.
  3. NP-TCO hazırlık:
    1. Için TCO-NHS çözeltisi 100 ul (DMSO içinde 50 mM) ilave150, amine nanopartikül (NP-NH2, PBS içinde 8.7 mg Fe / ml, 3 nm demir çekirdek ~ 8.000 Fe / NP) ul ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır.
    2. PBS tamponu ile elüe bir NAP-10 kolonu kullanılarak jel süzme ile, fazla belirtecin çıkarın. NP-TCO ürünü içeren renkli bant toplayın.
    3. Bir santrifüj filtre cihazı (100 k MWCO) kullanılarak ~ 150 ul'lik nihai bir hacme kadar filtrat konsantre edilir.
    4. NP-TCO çözeltisine süksinik anhidrit, 50 ul (DMSO içinde 0.1 M) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır (anhidrid terminal karboksilik asitleri oluşturmak için kalan aminler ile reaksiyona girer. Bu dekstran yüzeyi ile spesifik olmayan etkileşimleri önleyen).
    5. PBS ile yıkanarak bir NAP-10 kolonu kullanılarak NP-TCO ürün saflaştırılır. Kullanımdan önce 4 ° C'de NP-TCO çözümünü saklayın.

2. Yüzey Hazırlama

Tüm yüzey plazmon rezonans deneyleri, bir Biacore T100 cihazı (GE Healthcare) üzerinde gerçekleştirilmiştir25 ° C çalışan tamponu gibi bir CM5 sensör çipi ve PBS-P kullanarak aksi belirtilmedikçe. Alet ile birlikte Biacore Kontrol ve Değerlendirme yazılımı deney kurma ve veri analizi için kullanılmaktadır. İki çalışma modu, uygulama sihirbazlar ve manuel çalışma yüzey hazırlama ve izleme on-chip yakalama-sikloadisyonu için kullanılacaktır. Bu yöntem şekli, ters yön oluşturucu bağlanma deneyleri kurma ve siklo-ilave reaksiyonu oranlarını ölçmek için kullanılacaktır. Veriler çift referans çıkartılır ve kinetik analizleri 1:1 'lik bir Langmuir bağlanma modeli kullanılarak gerçekleştirilir vardır.

  1. Akış hücreleri üzerinde amin immobilizasyon sihirbaz şablonu seçin ve hareketsizlik 1 (referans) ve 2 (algılama) kullanın. 0.4 M EDC 1:1 'lik bir çözeltinin püskürtülmesiyle yüzey karboksilik grupları aktif hale getirmek için bir yöntem amin değiştirin: 480 saniye boyunca 0,1 M NHS 10 ul / dk' lık bir akış hızında. 420 saniye temas süresi kalan aktive edilmiş esterler sönmesi için etanolamin enjeksiyonu ayarlama10 ul / dk 'lık bir akış hızı.
  2. Giriş ligand isim, anti-GST (asetat tamponu, pH 5.0, 18 ug / ml) ve 10 ul / dak 'lık bir akış oranında, 420 saniyelik bir temas süresi boyunca enjekte ayarlanır.
  3. Içerik listesi ile pozisyonları maç emin reaktif rafa 2'de gerekli çözüm şişeleri yerleştirin. Kaydet ve immobilizasyon başlar.
    Not: ~ 14,000 17.000 RU aralığında anti-GST hareketsizleştirme seviyelerinde Bu şekildeki hareketsizleştirici sihirbazı Çalıştırma.
  4. Sadece referans Akış hücresinin üzerinde 1 5 ul / dk 420 sn (20 ug / ml) çözeltisi GST ligand enjekte immobilizasyon sihirbazı düzenleyin.

3. Fonksiyonlu Moleküllerin İzleme On-chip Yakalama sikloeklenme

  1. On-chip gerçek zamanlı yakalama sikloeklenme (Şekil 2) İzleme.
    1. GST-TCO (20 ug / ml), Tz BnNH-2 (10 uM) ve rejenerasyon (10 mM glisin, pH = 2.0) reaktif raf 2 çözüm şişeler yerleştirin. Adam seçinual çalışma yöntemi, 5 ul / dk akış hızını ayarlamak ve hücre 2 Flow akış yolu.
    2. 420 sn için GST-TCO çözüm enjekte.
    3. 600 sn için Tz-BnNH 2 çözümü enjekte edilir.
    4. Rejenerasyon çözeltisi iki kez 30 saniye enjeksiyonu ile yüzey yeniden.
  2. Gerçek zaman (Şekil 3), çok-bileşenli yapıların yonga montaj İzleme:
    1. GST-tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz BnNH-2 (10 uM) ve rejenerasyon (10 mM glisin, pH = 2.0) reaktif raf 2 çözüm şişeler yerleştirin. Alet manuel çalışması yöntemini seçin, hücre 2 Akış için 5 ul / dk ve akış yolu akış hızını ayarlamak.
    2. 60 saniye için GST-Tz bir çözelti enjekte edilir.
    3. 60 saniye için NP-TCO bir çözelti enjekte edilir.
    4. 60 saniye için Tz-BnNH 2 ihtiva eden bir çözelti enjekte edilir.
    5. Rejenerasyon çözeltisi iki kez 30 saniye enjeksiyonu ile yüzey yeniden.

4. Msiklokatılma Oranlarının İmmobilizasyonu Yoğunluğu ve Kararlılık ZLEME

  1. Küçük molekül siklo-ilave reaksiyonu oranları (Şekil 4) karakterizasyonu.
    1. Yeni yöntem ve girdi genel parametrelerini seçin. Tahlil adımlar panelinde yeni bir adım ve adını örnek oluşturun. Amaç ayarlayın ve Numune taban ayarları bağlayın.
    2. Döngüsü Türleri panelinde yeni bir döngü adımı oluşturun ve aşağıdaki komutları yerleştirin; Yakalama, Numune, Rejenerasyon 1 ve Yenilenme 2.
    3. Yakalama komutunu seçin; giriş ligand adı (GST-TCO, 20 ug / ml), 5 ul / dk ve set akış yolu da temas süresi 120 sn: İkinci. Örnek komutunu seçin; giriş 180 sn temas süresi, 60 sn ayrışma süresi, 30 ul / dk akış hızı ve ayarlanmış akış yolu: Her ikisi de. Rejenerasyon 1 komutunu seçin; giriş yenilenmesi çözüm adı (10 mM glisin-HCl pH 2.0), 30 ul / dk ve ayarlanmış akış yolu 30 saniye temas süresi: İkinci. Rejenerasyon 2 komut için aynı tekrarlayın. </ Li>
    4. Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki seçin ve analit çözeltisi (TZ-BnNH 2) ve konsantrasyon serisi (0.3-10 mM, 1:02 seyreltme) ile örnek listesini doldurun. Pozisyon panelini raf yanındaki seçin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde reaktif raf 2 ve seyreltme serisi yer çözeltisi viyaller içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Bağlanma verileri ve kinetik analizi, Şekil 4 'de gösterilmiştir.
  2. NP Siklokatılma reaksiyon oranları (Şekil 4) Karakterizasyonu.
    1. Yukarıda kaydedilen yöntem şablonu açın ve aşağıdaki parametreleri değiştirin. Yakalama panelini seçin, GST-TZ, 20 ug / ml değişiklik ligand isim. Örnek panelini seçin; değişiklik temas süresi 120 saniye temas süresi ve ayrışma zaman 120 sn.
    2. Örnek listesini seçin, NP-TCO ve konsantrasyon serisi (7 nM 224, 1:02 seyreltme) analit değiştirin. Reaktif rafta yer çözelti şişeler2 ve içerik listesi ile durumlarına göre emin 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltme serisi. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Bağlanma verileri ve kinetik analizi, Şekil 4 'de gösterilmiştir.

5. İmmobilize AP1497 için terimi, FKBP12'nin Binding ölçülmesi

Ters-yönlendirme bağlanma çalışmaları immobilize ligand olarak analit ve bileşik AP1497 (Şekil 5) halinde FKBP12'nin kullanır. Yöntem, oluşturucu aracı kullanarak, aşağıdaki gibi, bu deney için genel bir yöntem ayarlanır:

  1. Yeni yöntem ve girdi genel parametrelerini seçin. Tahlil adımlar panelinde oluşturmak ve isim Yakalama, Numune ve Rejenerasyon adımlar. Ilgili Amaç seçin ve baz ayarları bağlayın.
  2. Çevrim Tipleri panelini seçin ve 3 döngüsü adımları oluşturabilirsiniz: Yakalama, Numune ve Rejenerasyon.
  3. Yakalama döngüsü adım altında iki Yakalama komutu yerleştirin. Variabl olarak Yakalama 1 panelini seçin ve yakalama çözümü seçinİkinci: e, 5 / dakika ve set ul akış yolunun bir akış hızında temas süresi 300 saniyeye ayarlanır. İkinci: 5 ul / dk ve set akış yolunun bir akış hızında 250 sn temas zamanını ayarlamak değişken olarak Capture 2 panelini basıp yakalama çözümü seçin.
  4. Örnek döngüsü adım altında örnek komutu yerleştirin. Örnek panelini seçin; 60 saniyeye set temas süresi, 30 ul / dk akış hızı ve ayarlanmış akış yolu 200 sn ayrışma zamanı: Her ikisi de.
  5. Rejenerasyon modu adım altında iki Yenilenme komutu yerleştirin. Rejenerasyon 1 panelini seçin; giriş yenilenmesi çözüm adı (10 mM glisin-HCl pH 2.0), 30 ul / dk ve ayarlanmış akış yolu 30 saniye temas süresi: İkinci. Yenilenme 2 panel aynı tekrarlayın.
  6. Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki ve giriş yakalama çözüm adları (GST-TCO ve AP1497-TZ), örnek adı (FKBP12), konsantrasyon serisi (,020-5 ug / ml, 1:02 seyreltme) ve MW (13.000) seçin. R yer çözelti şişeler96 oyuklu bir plaka içerisinde eagent raf 2 ile seyreltme serisi içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Kinetik analizi verileri, Şekil 5'te gösterilmiştir.

6. İmmobilize NPlerin Bağlı AP1497 için FKBP12'yi Binding Ölçme

Nanoparçacık hareketsizleştirme, küçük molekül, türevi ve FKBP12 bağlama tahlili için genel yöntem set-up yöntem oluşturucu aracı kullanarak, aşağıdaki gibi:

  1. Yukarıda kaydedilen yöntem şablonu açın ve değiştirin. Yakalama döngüsü adım altında ek bir yakalama komutu yerleştirin. Yakalama 1 panelini seçin, değişken ve isim yakalama çözeltisine 1 (GST-TZ) olarak yakalama çözümü kaldırın. Bir 5 ul / dak akış hızı ve saniye olarak ayarlanmış akış yolu 60 saniye temas süresi olarak ayarlayın. Yakalama 2 panelini seçin, değişken ve isim yakalama solüsyonu 2 (NP-TCO) olarak yakalama çözümü kaldırın. Set temas süresi 5 ul / dk 'lık bir akış oranında 90 saniye veayarlamak akış yolu ikinci. Yakalama 3 panelini seçin, değişken ve isim yakalama çözeltisine 3 (AP1497-TZ) olarak yakalama çözümü kaldırın. Bir 5 ul / dak akış hızı ve saniye olarak ayarlanmış akış yolu 180 saniye temas süresi olarak ayarlayın.
  2. Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki iki kez seçin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde reaktif raf 2 ve seyreltme serisi yer çözeltisi viyaller içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Kinetik analizi verileri, Şekil 5'te gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Veriler ve rakamlar referans 8 adapte edilmiştir.

Yönelim ve yoğunluğu üzerinde kontrol ve biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin etkin bir şekilde geri hareketsiz yeni biyosensör uygulamaların gelişmesinde önemli bir rol oynamaktadır. TCO ve Tz arasındaki hızlı bioorthogonal reaksiyon kullanılarak, adım adım montaj ve biyolojik aktivitenin muhafaza edilmesi ile ligand yüzeylerin rejenerasyonu için bir yöntem tarif eder. 2 Tz-BnNH 2 immobilizasyon gerçek zamanlı izleme göstermektedir. GST-TCO içinde bir yanıt olarak ~ 400 RU yükselmesi ile sonuçlanan bir önceden immobilize anti-GST yüzeyi üzerine enjekte edilir. Tz-BnNH 2 olan bir ikinci enjeksiyon yanıt olarak hızlı bir ~ 15 RU artış göstermektedir. Türetilmiş antijen hiçbir ayrışma yapı kararlılığı için kanıt temin eder çalışan tampon geçtikten sonra görülmektedir. Yüzey birden çok yakalama-siklo döngüleri etkinleştirmek için döngüsünün son aşamada yeniden oluşturulur. BizeBu bir prosedür ile AP1497-Tz molekül ile Tz-BnNH 2 grubu değiştirme ve hedef terimi, FKBP12'nin (Şekil 5) ile etkileşim çalışmalar için kullanılan biyolojik olarak aktif bir yüzey oluşturur. , Antikor / antijen etkileşiminin bozulması (Şekil 2'de gösterildiği gibi) yeni bir molekül takımı inşa edilmesi için izin anti-GST yüzey oluşturur. Bu durumda, bir GST-Tz enjeksiyon (~ 800 RU yakalama) etkili sensör yüzeyine nanoparçacık (Şekil 3) hareketsiz, NP-TCO (siklo ~ 600 RU) bir enjeksiyon ile takip edilir. NP üzerinde reaksiyona girmemiş TCO grupları enjekte Tz-BnNH 2 (~ 22 RU) ile sikloadisyonu için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, AP1497-Tz işlevselleştirilmiş nanopartikül-FKBP12 etkileşimleri (Şekil 5) izlemek için kullanılır. Çok bileşenli yapı hiçbir ayrılma (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2.) yapısının stabilitesi ve biyo-(AP1497-Tz/FKBP12 b için kanıt temin eder gözlendi veINDING).

Gerçek zamanlı hareketsizleştirme (siklo) tepkime izleme ve yüzey yenilenmesi için yetenekleri olan, birleşme oranının basit karakterizasyonu, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir (siklo oranı) gerçekleştirilir k. Reaksiyon kinetiği Bilgi immobilizasyon yoğunluğu (temas süresi ve konsantrasyon), biyosensör deneyleri için önemli bir parametre kontrolü için yönergeler sağlar. GST ya da GST-TCO-TZ yüzeyleri üzerinde iki kez Tz-BnNH 2 veya NP TCO artan yoğunluklarda enjekte sırasıyla bağlama veri (kırmızı çizgi) oluşturur. , Aynı yüzey üzerinde aynı konsantrasyonda iki ardışık analit örnekleri için bağlama verileri hemen hemen üst üste nedeniyle yakalama-siklo-ve yenilenme çok devriyle bağlama kapasitesi antikorun en az kaybını yansıtmaktadır. Değerlendirme Yazılım en uygun kinetik analizleri (siyah çizgiler içerir ) cycloaddition reaksiyon oranları, Şekil 4'te gösterilen k.

Şekil 1
Şekil 1. Türevlendirilmiş moleküller. A., trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu ve 1,2,4,5-tetrazin (Tz) kısımları, 1,4-dihidropiridazin ilave maddeyi vermek üzere geri çevrilebilir immobilizasyonu için Bioorthogonal birleşme strateji . Tz / TCO tersinir immobilizasyon B. Deneysel düzeni molekülleri etiketledi. çevrilebilir nanoparçacık hareketsizlik ve fonksiyonlandırmalar C. Deneysel düzeni. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

mg src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" alt = "Şekil 2" fo: src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />: fo içerik-width = "4.5in"
Şekil 2. . Küçük molekül immobilizasyon Gerçek zamanlı izleme 1) Temel:. Çalışan tampon (t enjeksiyonu takiben anti-GST antikoru (t = 0-420 sn) tarafından enjekte GST-TCO önceden hareketsiz-anti-GST 2) Yakalama, yanıt ~ 15 RU yükselişi;; t 540-1,140 sn =). yakalanan GST-TCO ve tetrazin (TZ-BnNH 2 arasında = 420-540 sn) etkileşim sebat gösteren 3) Siklokatılma. Sinyal çürüme. 4), 10 mM glisin, pH 2.1 (t = 1,820-2,000 saniye) 2 kısa enjeksiyonu ile anti-GST yüzeyinin Rejenerasyon tamponu (t = 1,140-1,820 sn) çalışan mobil faz geçiş rağmen gerçekleşir.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Şekil 3,. Yakalanan GST-Tz ve NP-TCO (t = 135-195 enjekte arasına enjekte GST-TZ (t = 0-60 sn nanoparçacık immobilizasyon ve işlevsel gerçek zamanlı izleme. 1) Baseline. 2) Yakalama). 3) Siklokatılma sn), sinyalde herhangi bir çürüme ile çalışan tampon püskürtülmesiyle, ardından (t = 195-300 saniye). 4) siklo NP-TCO hareketsiz ve Tz-BnNH 2 enjekte edildi (~ karşılık olarak 22 RU artış, t = 300-360 arasında sn.) Sinyal çürüme çok-bileşenli stabilite için kanıt temin eder tamponu (t = 360-480 saniye) çalışan mobil faz geçiş rağmen bulunmaktadır.

Şekil 4,
Şekil 4. B gösteren Temsilcisi sensogramlarTz ve TCO ile siklo ilave reaksiyonu için inding verileri (kırmızı çizgi) ve kinetik analizleri (siyah çizgiler) 100% FBS varlığında veya yokluğunda molekülleri etiketlendi. Tablo ilişkisi (siklo) hızı sabitleri özetler, bir k.

Şekil 5,
Şekil 5,. . AP1497 ve AP1497-TZ: farklı konfigürasyonlarda küçük molekül / protein etkileşimleri (Üst) FK506'nın Sentetik türevlerinin SPR çalışmaları. Tablo kinetik gösterir ve bağlama verilerinden türetilen denge oranı sabitleri. Protein hareketsizleştirildiği bağlanma deneylerinde (örneğin geleneksel SPR deneyler) veri karşılaştırma için dahildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan yakalama-siklo yöntemi etiket içermeyen yonga bazlı etkileşim ve kinetik çalışmalar için modifiye edilmiş nano ve küçük moleküller, hızlı, tersine çevrilebilir immobilizasyon sağlar. Hareketsizleştirme protokol <küçük moleküllü ligandlann 10 uM konsantrasyonlarda gerektiren dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ligand konsantrasyonu ve temas süresi hareketsizleştirme yoğunluklara modüle tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilebilir. Verilerimiz çip üzerinde bioorthogonal reaksiyonlar kendi hedefleri ile etkileşim için in situ fonksiyonalize nanopartiküller ya da hareketsiz küçük moleküllerin içinde yeteneğini korumak göstermektedir. Ayrıca, düşük moleküler ağırlıklara sahip iki küçük moleküller, (TCO ve Tz) arasında iki moleküllü siklo oranları tanımlanmıştır. Bu deneyler, benzer diğer hızlı bioorthogonal reaksiyonların oranlarını ölçmek ve karşılaştırmak için yapılan edilebilir öngörülüyor.

Tersinir, sürekli akış on-chip nanoparçacık immobilizasyon ve in-situ fonksiyonlandırmalar provides tüm arıtma, hareketsizlik ve tarama için farklı adımlar gerektiren geleneksel nanoparçacık sentezi ile karşılaştırıldığında, aynı deneyi. 13-15 tarama ve etkileşim analizi için modifiye nanopartikülleri çeşitli hızlı erişim, bizim yöntem büyük ölçüde biyomalzeme girdi miktarları, solventler azaltır ve reaktifler, aynı anda nanoparçacık kullanımı ve atılması ile ilgili çevresel kaygılar düşürürken. 16. Önemli olarak, nano partiküler fonksiyonalizasyon reaksiyonları, tipik olarak, hücre kültürü deneyleri için kullanılan serum konsantrasyonlarının varlığında sağlam ve hatta son derece yüksek serum konsantrasyonları. Bu özellik, serum mevcudiyetinde (nanoparçacık protein korona ve yüzey özelliklerini etkileyebilir) içinde nanopartikül tasarım için yapı-faaliyet ilişkileri kolaylaştırabilir. 17,18

Protein-küçük molekül etkileşimleri incelenmiştir burada en SPR deneylerinde, protein (ligand) birbir afinite etiketi (GST, biotin, vb) yoluyla veya kovalent amid bağları aracılığıyla hareketsiz. Analit daha sonra ligand geçirilir burada kırılma endeksi değişiklikler olarak bulunur yüzey kütle oynamaları, bağlayıcı ile sonuçlanır. Kanonik SPR yönünü ters ve uygun ve geri dönüşümlü bir şekilde küçük bir molekülü hareketsizleştirir çözünebilen makromoleküler hedeflerin doğrudan bağlanma incelemek için kolay erişim sağlar ve eserler (çözünür vs hareketsiz) faz-spesifik açıklar. Bu tip 19,20 Deneyi biçimleri özellikle önlenmesi ve rekabet çalışmaları için bir. yönelim 21 ters çevrilmesi de çeşitli koşullar altında avantajlı olabilir, yani a) bağlayıcı bir sinyal kütle değişimi b) toplanmasını ve hidrofobik analitlerin 22 olmayan yüzey özgüllük ile orantılı olduğu dikkate alındığında, düşük moleküler ağırlığa sahip analit ile yüksek afinite bağlayıcı veri analizi basit c) karakterizasyonu can yapıyor elimine edilirnedeniyle uzun bekleme süreleri (kovalent inhibitörleri ile ilgili, özellikle yavaş off-hızları) 23 ve bir sonraki analiz çevrimi d) rejenerasyon maddeleri yapısı veya fonksiyonu üzerinde etkilere sahip olabilir kırıcı için hazırlık olarak yüzey yenileme koşulları için ihtiyaç zor hareketsiz protein.

Bizim immobilizasyon stratejisinin bir parçası olarak bioorthogonal yakalama sikloeklenme yöntemi ekleyerek, biz geleneksel küçük molekül immobilizasyon teknikleri ile ilgili bazı zorlukları aşmak. Protein immobilizasyonu protokoller için tipik ön konsantrasyonları yüzey açan elektrostatik mekan küçük moleküller ile etkisiz olduklarından, bu çok daha yüksek ligand konsantrasyonları gerektirir. Bu duruma göre, ligandların artan konsantrasyonları ligand çözünmesi için organik yardımcı-çözücü oranı arttıkça yol açar. Bu koşulların her ikisi de mikro-akışkan akış sistemleri ile uyumlu olarak değil bir sonucu olarak, geleneksel bir immobilizations gerçek zamanlı izleme. 24. Son olarak, başarılı bir geleneksel immobilizasyon durumunda, kovalent bir yüzey modifikasyonu yüzey rejenerasyon önler ve zaman, çaba artan yatırımlar ile sonuçlanan biyo-sensör yüzeylerinin deneysel sınırlandırır mümkün değildir aletin dış gerçekleştirilmelidir ve maliyetleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

Biz NIH (UKAKE Kontrat No HHSN268201000044C, SH ve SYS RW) fon kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats