Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Odling och underhålla

1, 1, 1

1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Clostridium difficile är en patogen bakterie som är en strikt anaerob och orsakar antibiotika associerad diarré (AAD). Här, metoder för isolering, odling och underhålla C. difficile vegetativa celler och sporer beskrivs. Dessa tekniker kräver en anaerob kammare, som kräver regelbundet underhåll för att garantera lämpliga förhållanden för optimal C. difficile odling.

    Date Published: 9/14/2013, Issue 79; doi: 10.3791/50787

    Cite this Article

    Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

    Abstract

    Clostridium difficile är en grampositiv, anaerob, sporogenic bakterie som är primärt ansvarig för antibiotikaassocierad diarré (AAD) och är en viktig nosokomial patogen. C. difficile är notoriskt svårt att isolera och odla och är extremt känslig för även låga halter av syre i miljön. Här, metoder för att isolera C. difficile från avföringsprover och därefter odling av C. difficile för beredning av glycerol lager för långtidslagring presenteras. Tekniker för att förbereda och räkna spor bestånden i laboratoriet för en mängd olika tillämpningar i senare led, inklusive mikroskopi och djurstudier beskrivs också. Dessa tekniker kräver en anaerob kammare, som upprätthåller en konsekvent anaerob miljö för att garantera lämpliga förhållanden för optimal C. difficile tillväxt. Vi tillhandahåller protokoll för överföring av material in och ut ur kammaren utan Camed hjälp av betydande förorening syre tillsammans med förslag på regelbundet underhåll som krävs för att upprätthålla en lämplig anaerob miljö för effektiv och konsekvent C. difficile odling.

    Introduction

    Clostridium difficile är en grampositiv, sporbildande bakterie som är en obligat anaerob och en potentiellt livshotande gastrointestinal patogen för människor och djur. Inledningsvis beskrivs 1935 som kommen organism som finns i avföringsprover från nyfödda 1, C. difficile har senare visat sig vara den orsakande agent för pseudomembranös kolit i samband med antibiotikabehandling 2. C. difficile infektioner (CDI) är oftast föregås av antibiotikabehandling som resulterar i avbrott i den normala kolon floran, skapa en nisch för C. difficile att blomstra 2. C. difficile överförs som ett vilande spor via den fekala-orala vägen och därefter gror i mag-tarmkanalen och att producera vegetativa celler i stånd att alstra flera toxiner och orsakar svår sjukdom och kolit 3. CDI är ofta eldfasta till konventionell behandling och dessa iFections ofta återkommande 4. Som ett resultat, CDI ansvarar för upp till $ 4,8 miljarder sjukvårdskostnader i USA 5-7.

    C. difficile är mycket känsliga för även låga nivåer av syre i miljön. För C. difficile att finnas kvar i miljön och effektivt överförs från värd till värd, är bildandet av ett metaboliskt inaktiva sporer kritisk 8. Eftersom laboratorie underhåll och manipulering av C. difficile kräver en kontrollerad, anaerob miljö, dessa tekniker kräver användning av en anaerob kammare. Användning av anaeroba kammare har lett till ökad återvinning och isolering av obligata anaerober 9-11, och har gjort ett antal molekylära tekniker som ska utföras i en anaerob miljö.

    Förutom C. difficile, den anaeroba kammar användning och underhåll som beskrivs här gällertill andra obligata anaerober såsom andra klostridie arter (t.ex. C. perfringens), andra gastrointestinala arter (t.ex. Bacteroides arter 12) och parodontala patogener (t.ex. Peptostreptococcus arter 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    Notera: C. difficile är en människa och djur patogener som kan orsaka mag-tarmsjukdomar. Experiment med C. difficile måste utföras med lämpliga biologiska säkerhetsrutiner (BSL-2).

    1. Anaerob Chamber Användning och underhåll

    C. difficile är en strikt anaerob och är extremt känslig för även låga halter av syre i atmosfären. Därför behövs en styrd, anaerob miljö för sin framgångsrika manipulation. Användningen av en anaerob kammare (Figur 1 A) ger den mest stabila miljö och goda förutsättningar för effektiv odling av C. difficile och andra anaeroba bakterier 14. Här kan en atmosfär innehållande en gas-blandning (5% CO2, 10% H2, 85% N 2) upprätthållas stabilt.

    Att införa några objekt in i kammaren utan betydande förorening syre,en luftsluss måste användas (Figur 1B). Detta fungerar enheten som en gas utbyte och fungerar automatiskt, halv manuellt eller manuellt. Luftslussen har två dörrar: en som ger tillgång till utsidan av luftslussen och den andra som ger tillgång till det inre av den anaeroba kammaren. Beroende på utförande kan luftslussen har ytterligare en dörr, som kan erbjuda tillgång till ett angränsande anaerob kammare, vilket sparar kostnaden för en separat luftsluss. Om inte aktivt flytta poster i eller ut ur kammaren, bör båda dörrarna förblir stängda hela tiden för att undvika kontaminering syre. Luftslussen besitter en på / av-knapp på framsidan och en panel med fyra knappar. Gasledningarna och vakuumpumpslangen ansluts i den bakre delen av luftslussen, i närheten av panelen där switcharna för full manuell drift av enheten befinner sig. Det rekommenderas att två reningscykler med användning av kvävgas (N2), används innan du fyller utbytet med gasblandning (5% CO2, 10% H2, 85% N2) för att minska den mängd syre som införs i kammaren. Det är också viktigt att aldrig lämna antingen dörren öppen under längre tid än den tid som krävs för att flytta föremål i och ur utväxlings och mängden noggrant planera experiment för att minska frekvensen av rörliga objekt i och ut ur kammaren. De olika operativa förfaranden för vinyl anaeroba kammare beskrivs nedan. Innan du följer dessa protokoll, se till att dessa är förenliga med tillverkarens instruktioner som följer med kammaren.

    1. Automatiskt läge
      Detta är en programmerbar och anpassningsbar läge och är helt utförs av luftslussen. För att programmera luftslussen, finns i tillverkarens instruktioner. Ett rekommenderat program för typiska inträde i kammaren innebär två rensningscykler med hjälp av kvävgas följt av påfyllning luftslussen med en gasblandning som nästan matchar stämningen bibehålls i chamber. Under varje vakuumcykel, föreslår den standard fabriksförfaranden drar ett vakuum till 20 inHg och utrensning till 1 inHg.
      1. Se till att den inre luftslussen dörren är helt stängd.
      2. Öppna den yttre luftslussen dörren.
      3. Placera föremål i luftslussen och stänger ytterluftslussen dörren. Om införa vätska, skruva bort locken halvvägs för att säkerställa ett effektivt gasutbyte. Förseglade förpackningar och behållare skall öppnas före början av cykeln, att avstå från att göra det kan varp och skada plasten och containrar. För att bibehålla sterilitet, öppna paketen tillräckligt att endast tillåta ett effektivt gasutbyte.
      4. Tryck på Start-knappen.
      5. Vänta tills luftslussen har cyklat igenom programmet och displayen visar "Anaerob."
      6. Öppna innerluftsluss dörren.
      7. Flytta objekt i kammaren.
      8. Stäng innerdörren.
    2. Semi-manuella läget
      Det här läget kan användas när du flyttar poster i eller ut ur kammaren och är nödvändigt när cycling gasen inuti kammaren krävs.
      1. Se till att den inre luftslussen dörren är helt stängd.
      2. Öppna den yttre luftslussen dörren.
      3. Placera föremål i luftslussen och stänger ytterluftslussen dörren. Om införa vätska, skruva bort locken halvvägs för att säkerställa ett effektivt gasutbyte. Förseglade förpackningar, som man ympar loopar och 96-brunnars plattor, måste öppnas före början cykeln.
      4. Tryck på Meny.
      5. Tryck på Start. Luftslussen visar funktionen för varje knapp och reagerar inte förrän det är klar:
        • Pil upp: aktiverar vakuumpumpen.
        • Pil ned: initierar kväve (rensning) gasflöde.
        • Start: initierar gasblandningen flödet.
        • Meny: återgå till standarddisplayen.
      6. Tryck på "Upp" tar bort gasen från luftslussen, tills displayen visar 20 inHg.
      7. Tryck på "Down", att fylla luftslussen med kväve, tills displayen visar mindre än 1 inHg. Inte overshoot, eftersom detta kommer att skapa positivt tryck i luftslussen, vilket kan påverka dess integritet.
      8. Upprepa steg 6 och 7 för att utföra ytterligare en utrensning cykel.
      9. Tryck på "Up" tills displayen visar 20 inHg.
      10. Tryck på "Start", fylla utbyte med gasblandningen, tills displayen visar mindre än 1 inHg.
      11. Öppna innerluftsluss dörren.
      12. Flytta objekt i kammaren.
      13. Stäng innerdörren.
    3. Manuellt läge
      Det här läget kan användas när de automatiska eller halv manuella lägen inte fungerar eller det inte finns någon ström till luftslussen. Detta läge fungerar inte när luftslussen är på, och därför är det svårt att bestämma trycket i luftslussen. Eftersom vakuumet dra och gas reningstider är beroende av vakuum och gasflöden, respektive, krävs användning av en tryckmätare i utbyte för att övervaka trycket och minska risken för personskador och skador på luftslussen.
      1. Se till att den inre luftslussen dörren är helt stängd.
      2. Öppna den yttre luftslussen dörren.
      3. Placera objekt, inklusive tryckmätaren, in i luftslussen och stänger ytterluftslussen dörren. Om införa vätska, skruva bort locken halvvägs för att säkerställa ett effektivt gasutbyte. Förseglade förpackningar, som man ympar loopar och 96-brunnars plattor, måste öppnas före början cykeln.
      4. Leta reda på de tre omkopplarna på baksidan av luftslussen märkt "Manuella Kommando-." Dessa är individuellt märkta som:
        • För vakuum
        • Kväve
        • Gas Mix
      5. Vänd på att dammsuga vippströmbrytare tills manometern läser cirka 20 inHg.
      6. Vänd på Kväve vippströmbrytare tills manometern läser cirka 1 inHg.
      7. Vänd på att dammsuga vippströmbrytare tills manometern läser cirka 20 inHg.
      8. Vänd på Kväve vippströmbrytare tills manometern läser cirka 1 inHg.
      9. Vänd på att dammsuga vippströmbrytare tills manometern läser cirka 20 inHg.
      10. Vänd på Gas Mix vippströmbrytare tills manometern läser cirka 1 inHg.
      11. Öppna innerluftsluss dörren.
      12. Flytta objekt i kammaren.
      13. Stäng innerdörren.

    2. Odling, räkna och lagra C. difficile från avföringsprov

    Detta förfarande är utformat för att återhämta C. difficile från avföringsprover som innehåller sporer och i fortsättningen upprätthålla isolerade kolonier som vegetativa celler eller sporer i långtidslagring som glycerol lager. Alternativt kan detta förfarande användas för att räkna upp antalet C. difficile finns i avföringsprov (t ex från djurstudier). För att selektivt och differentiellt anrika C. difficile, är taurokolat-cefoxitin-cykloserin-fruktos agar (TCCFA) som används för att hämma tillväxten av normala fekal flora 15-16. Cykloserin är bakteriostatisk för Gram-negativa bakterier, samtidigt cefoxitin inhiberar bredare tillväxten av både Gram-negativa och-positiva bakterier, med undantag för C. difficile och de flesta anger cocci stammar. En pH-indikator, neutralrött, kan ingå i mediet, som fermenteringen av fruktos kommer att resultera i en minskning i pH och en efterföljande färgförändring från röd / orange till gult. För att effektivt återvinna sporer av C. difficile eftersom vegetativa bakterier är gallsaltet natriumtaurocholat användas för att inducera groning 17-18. Eftersom C. difficile bildar sporer, alkohol eller värmebehandling av prov kan användas för att minska eller eliminera vegetativa celler, vilket begränsar tillväxten av kontaminerande flora, vilket kan öka effektiviteten i C. difficile återhämtning 19. Såsom nämnts ovan, är det viktigt att i förväg minska alla plattorna under minst 1-2 tim i den anaeroba kammaren före användning för att säkerställa avlägsnandet av kvarvarande syre. Luft drying plattorna före användning i kammaren kan minska kondensation. Flytande medium kan behöva upp till 24 timmar för att minska beroende på volymen och förhållandet surface-to-air av behållare som används.

    Innan du börjar, bör följande punkter placeras i den anaeroba kammaren:

    • Avföringsprov
    • Sterila bomullstoppar
    • Sterila ympar slingor
    • 1x PBS (se Material)
    • TCCFA plattor (se Material)
    • BHIS (Brain Heart Infusion medium med jästextrakt)-plattor och-buljong (se Material)
    • 50% glycerol (steriliserad)
    • 10% L-cystein (steriliserad)
    • Kryorör lagrings

    * Alternativt kan isolerade kolonier spridas på BHIS agarplattor och därefter skrapades av och återsuspenderades i BHIS flytande medium med 15% glycerol för långtidslagring vid -80 ° C. ** Det är viktigt att notera att Gram-färgning är inte en effektiv strategi för att identifiera C. difficile direkt från avföringsprov 23 C. difficile måste först isoleras från andra växter som är närvarande i avföring.

    1. Resuspendera avföringsprov i 1x PBS (detta kan utföras i aeroba förhållanden), och se till att avföringsprovet är helt återsuspenderades i 1x PBS genom virvling. Om räkna C. difficile från pallen, väga avföringsprovet före tillsatsen av 1 x PBS.
    2. Gör seriespädningar av den återsuspenderade avföringsprov i 1 x PBS under lämplig isolering eller räkning av kolonibildande enheter (CFU) per gram avföring.
    3. Använd aseptisk teknik och tillämpa 100 pl av varje seriespädning till TCCFA plattor.
    4. Med hjälp av en serie av sterila ympa loopar, strimmig den tillämpade kulturen för isolerade kolonier eller jämnt den tillämpade kulturen på ytan av TCCFA Platta för räkning av kolonier.
    5. Inkubera plattan anaerobt under 48 h vid 37 ° C. Det är möjligt att upptäcka och identifiera C. difficile kolonier inom 24 tim baserat påden platta, oregelbundna, slipat glas utseende kolonierna 15, även om mer korrekt identifiering och räkning uppnås efter 48 timmar.
    6. Använda sterila ympa loopar, subkultur några kolonier som verkar vara C. difficile på pre-reducerad BHIS agarplattor, kompletterat med 0,03% L-cystein 20. Välj en enskild koloni, och strimma på plattan i kvadranter, med en ny steril inokulering slinga för varje kvadrant, för att erhålla isolerade kolonier. Alternativt, räkna C. difficile kolonier av varje spädning (detta kan utföras i aeroba förhållanden), och beräkna antalet kolonibildande enheter per gram avföringsprov.
    7. Bekräfta C. difficile identifiering via Gram-färgning. Efter gramfärgning, C. difficile visas som lila stavar och en del celler kan innehålla terminal endosporer. Polymeraskedjereaktion (PCR) identifiering av de gener som kodar för toxin B kan ge ytterligare en bekräftelse påtoxinbildande stammar av C. difficile 21 medan multilocus sekvens typning (MLST) är framgångsrikt för identifiering och korrekt typning av okända och nontoxigenic stammar av C. difficile 22.
    8. För att upprätthålla ett lager av C. difficile vid -80 ° C, plocka en enskild, isolerad koloni från BHIS agarplatta med en steril inokulering slinga och resuspendera koloni i 10 ml av pre-reducerad BHIS vätskemedium kompletterat med 0,03% L-cystein. *
    9. Inkubera över natten anaerobt vid 37 ° C, eller tills odlingen blir grumlig.
    10. Lägg till 333 l av 50% glycerol och 666 pl av C. difficile kultur till en 1,8 ml kryogen röret för att skapa en 15% glycerol lager av isolerad stam.
    11. Tätt cap kryogena rör, blanda väl och omedelbart ta bort lager från den anaeroba kammaren och plats i en -80 ° C frys för långtidslagring.

    3. Odling av C. difficile

    Detta förfarande innebär återvinning av C. difficile från glycerollager som lagrats vid -80 ° C. Eftersom upprepade frysnings-upptiningscykler kan döda vegetativa celler, är det viktigt att hålla glycerolstam frysta vid alla tidpunkter. Vi rekommenderar inte användningen av torris för att överföra stammar in och ut ur kammaren, såsom avdunstning av torris kan förändra miljön inuti kammaren. Istället rekommenderar vi att du använder frysta kylning rack för att hålla glycerol lager frysta under transporten. Av olika selektiva och differentialändamål, är tre medier som vanligen används för odling av C. difficile. TCCFA, såsom diskuterats ovan, är selektiv med avseende på C. difficile och innehåller natriumtaurokolat, en germinationsmedel. Brain Heart Infusion kompletterat med jästextrakt (BHIS) är en vanligt förekommande, berikat, icke-selektivt medium, vilket gör det möjligt för tillväxt av ett stort antal olika organismer (figur 2A) 24. Ofta, L-cysteine sätts till BHIS som reduktionsmedel 20. Slutligen tillsats av blod till medium (figur 2B) möjliggör mer effektiv sporulering än på TCCFA och möjliggör detektering av den unika grönaktig eller chartreuse fluorescens som uppvisas av C. difficile under långvågigt ultraviolett ljus (UV) 15 (figur 2C). Vid odling av C. difficile från spor lager, är det viktigt att komma ihåg att natriumtaurokolat måste tillsättas till mediet för att säkerställa groning.

    Innan du börjar, bör följande punkter placeras i den anaeroba kammaren:

    • Fryst glycerol lager (på kylning rack)
    • Sterila ympar slingor
    • TCCFA eller BHIS plattor (se Material)
    • BHIS buljong (se Material)
    • 50% glycerol (steriliserad)
    • Kryorör lagrings
    1. Placera den frysta glycerol lager av C. difficile i en kylning rack som har förvarats vid -80 ° C prIOR att använda för att förhindra upptining.
    2. Ta med den frusna glycerol lager på torris i den anaeroba kammaren.
    3. Med användning av aseptisk teknik och en steril inokulering slinga, placera en liten mängd av det lager på plattan och strimma över en kvadrant av plattan.
    4. Vrid plattan 90 ° och, med hjälp av en ny steril inokulering slinga, fortsätter att strimma över den andra kvadranten.
    5. Upprepa för de tredje och fjärde kvadranterna för att säkerställa isolering av enskilda kolonier.
    6. Avlägsna omedelbart den frusna glycerolförråd från den anaeroba kammaren och återgå till -80 ° C.
    7. Inkubera plattan anaerobiskt över natten vid 37 ° C. Individuella isolerade kolonier bör observeras efter natten tillväxt.

    4. Renande Sporer från C. difficile

    Som sporulering krävs för att överleva i syrerika miljöer och för effektiv överföring av sjukdom 8, är ofte beredningen av spor lagern behövs för tillämpningar efter, inte begränsad till mikroskopi och djurstudier. Det är viktigt att notera att räkna sporer kräver repetition för att säkerställa reproducerbarhet av räkningar. Pipettera upp och ned flera gånger mellan späd minskar även förlust eftersom sporer följer plast väl.

    Sporulering av C. difficile är inte så snabb eller homogen som andra sporogenic arter. För att optimera spore produktion och återvinning, antingen sporulering medium (SMC) 17,25 eller 70:30 medel 26 rekommenderas. Andra medier som vanligen används är BHIS, som kräver 4-5 dagars tillväxt innan effektiv sporulering ses 27, och Clospore, ett flytande medium som producerar höga titrar av sporer (Juli 10 - Augusti 10 sporer per milliliter) efter 72 timmar av tillväxt. Andra protokoll använder iskallt vatten snarare än 1x PBS 20, men kan användandet av en isoton lösning reducera sporer fastnar på varandra och plastytor. Alternativtvissa forskare renar vidare sina sporer med hjälp av en sukrosgradient att helt ta bort vegetativa celler och skräp 29.

    Innan du börjar, bör följande punkter placeras i den anaeroba kammaren:

    • Sterila ympar slingor
    • BHIS, SMC och / eller 70:30 plattor (se Material)
    • BHIS buljong (se Material)
    • 1x PBS, filtersteriliserades (se Material)
    1. Kultur-stammar från fryst glycerolstam på förreducerade BHIS plattorna och inkuberas anaerobt över natten vid 37 ° C.
    2. Restreak på flera förreducerad SMC eller 70:30 plattor och inkubera anaerobt vid 37 ° C i 24-48 timmar. Spore Bildningen kan följas via faskontrastmikroskopi. Sporer visas fas ljus medan vegetativa och moderceller visas fas mörkt. * Som ett alternativ, kan sporer renas från 70:30 flytande mediet efter 24 till 48 timmar, vilket ger 10 5 -10 6 sporer per milliliter, beroende på strain används.
    3. Med hjälp av en steril inokulering slinga, skrapa plåtar och suspendera cellerna i 10 ml steril 1x PBS.
    4. Kasta tallrikar och ta bort sporsuspension från den anaeroba kammaren. Pelletera cellerna vid 3000 xg under 15 minuter. Tvätta cellerna två gånger i 1 x PBS, fullt återsuspendering av cellpelleten varje gång.
    5. Inkubera över natten vid 4 ° C för att hjälpa till vid lysering av vegetativa och moderceller.
    6. Inkubera vid 70 ° C under 20 min för att döda eventuella kvarvarande vegetativa celler.
    7. För att bestämma kolonibildande enheter (CFU) per milliliter, i serie späda varje spor preparatet i 1 x PBS och plattan på BHIS + 0,1% natriumtaurokolat. Inkubera plattorna i minst 24 timmar innan du räkna kolonier.
    8. Sporer kan lagras i 1x PBS vid antingen rumstemperatur eller 4 ° C för långtidsförvaring. Vid förvaring vid 4 ° C, kan det vara lämpligt att återuppvärma spor beredningen vid 55 ° C under 15 min för att återställa effektiv groning.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ett exempel på C. difficile odlas på BHIS och Columbia anaerob fårblodagar medier kan ses i figur 2. C. difficile bildar oregelbundna kolonier som är platt och besitter ett slipat glas utseende som är tydligt på båda medierna. Här, ett erytromycin känsliga kliniskt isolat av C. difficile, 630e 30, odlas på BHIS agar, ett berikat, icke-selektivt medium under 24 h vid 37 ° C (Figur 2A). Kolonier på Columbia anaerob fårblodagar likna dem som odlats på BHIS under vitt ljus (figur 2B), men tillhandahåller även användningen av detta medium för detektion av den grönaktiga eller chartreuse fluorescens som uppvisas av C. difficile under långvågigt ultraviolett ljus (UV) 15 (figur 2C). C. difficile kolonier på TCCFA agar liknar tillväxt på BHIS agar. På grund av närvaron av två antibiotika i TCCFA medium, en time tid av 48 h tillväxt är nödvändig innan räkna kolonier.

    Figur 1
    Figur 1. Den Coy Laboratories Typ C vinylkammare och dess komponenter. (A) A Coy Laboratories Typ C vinylkammare som ger arbetsyta för en enskild individ på en gång (42 tum x 32 tum). Den innehåller en katalysator fläkt box (bakre vänstra hörnet), som cirkulerar och värmer upp luften, och håller Stak-Pak innehåller palladiumkatalysator som krävs för att reducera kontaminering syre. (B) Den luftsluss fungerar som ett utbyte och ger en mekanism för överföring av material in och ut ur kammaren samtidigt förhindra betydande förorening syre i anaerob miljö. Luftslussen har två dörrar: en som ger tillgång till utsidan av luftslussen och den andra som ger tillgång till det inre av th e anaerob kammare. Luftslussen är programmerbar och möjliggör skräddarsydda cykler för inträde i kammaren. Den fungerar i automatiska, halv manuella och manuella lägen. (C) Bifogat, flexibla latexhandskar tillhandahålls som tillåter komplett utbud av rörelse och nå i kammaren. Handskarna är fästa vid en specialiserad manschetten fäst vid vinyl ärmar med vinyllim medger ersättning av handskar utan att störa den anaeroba atmosfären i kammaren. Neopren handskar finns också. (D) Den modell 10 Gas Analyzer övervakar kontinuerligt både syre-och vätenivåer ger en momentan avläsning av atmosfären i kammaren. Denna enhet möjliggör omedelbara varningar om en läcka uppstår, är en felaktig gasblandning som används eller ytterligare problem uppstår genom ljudlarm och en blinkande LED-ljus.

    ig2.jpg "/>
    Figur 2. Utseendet på C. difficile kolonier på olika medier. Den karakteristiska platta, oregelbundna, slipat glas utseende är tydlig med en erytromycin känslig kliniska isolat av C. difficile, 630e 30, odlas på BHIS agar för 24 h (A) och Columbia anaerob fårblodsagar under 48 h under vitt ljus (B) och långvågigt ultraviolett ljus (C).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De metoder som beskrivs här möjliggör enkel och snabb återhämtning av C. difficile från en mängd olika fekala prover, inklusive människor, möss och hamstrar, såväl som långtidslagring av C. difficile som glycerol eller spore bestånd. C. difficile kan vara en svår organism att odla, men noggrant underhåll av en anaerob miljö och tillämpningen av aseptisk teknik kan ge stark tillväxt och en minskning av föroreningar.

    Anaeroba kammare: Överväganden och Underhåll

    Det finns två typer av anaeroba kammare: stela kammare eller vinylkammare. Styva kammare är gjord av aluminium eller en styv polymer (t.ex. Plexiglas eller akrylmaterial), vilket möjliggör användning av frätande kemikalier. Styva kammare kan omvandlas till en gloveless stil och är mindre benägna att punkteringar, men läckage är svåra att upptäcka och hitta och stela kammare kräver en viss metod för attkompensera för gas förskjutning under användning. De polymerenheterna ofta är utrustade med en purge-bara luftsluss, som kan kosta mer att använda. För underhåll av stränga atmosfäriska förhållanden, kostnad, flexibilitet, laboratorieutrymmeskrav och enkelt underhåll, är vinyl anaeroba kammare rekommenderas (Coy Laboratory produkter, Figur 1A). Denna anaerob kammare består av en vinyl handskbox som stöds av en rörformig aluminiumstruktur och är ansluten till en luftsluss, som fungerar som en utbyta för överföring av material in och ut ur kammaren (Figur 1B), med användning av latex eller neopren handskar fäst vid vinylhylsor (figur 1C). Det är viktigt att exakt följa tillverkarens anvisningar för korrekt uppsättning av den anaeroba kammaren. Det kan vara temperaturreglerat med en (eller flera, beroende på storleken av kammaren) värmare lådenheterna som tillhandahåller luftcirkulation genom en palladiumkatalysator. Palladium catalyst tjänar till att minska kontaminering syre införes genom utbyte genom omvandling av väte och syre till vatten. Helst, är båda syre och väte nivåer övervakas med användning av en gasanalysator (figur 1D), visar syrekoncentrationen i delar per miljon (ppm) och vätekoncentrationen i procent.

    Flytande och fasta medier bör i förväg reduceras i den anaeroba kammaren före användning. Petriskålar (100 mm i diameter) kan reduceras till bara två timmar före användning 31, det ska dock flytande medier reduceras över en natt. Viktigt bör media kylas före överföringen in i kammaren för att förhindra vätske blinkande under luftsluss evakuering. Plast förbrukningsvaror såsom 96-brunnar bör vara pre-reducerad natten före användning, eftersom plast är porös och kan lagra syremolekyler 32. Beroende på program, vissa plaster måste i förväg reduceras med upp till 48 timmar före användning 33. Biohazard avfall bör be omhändertas på lämpligt sätt. En liten biohazard påse kan förvaras inne i kammaren, men bör bytas ofta.

    En vätekoncentration av åtminstone 3% måste upprätthållas inuti kammaren, eftersom detta kommer att säkerställa både god tillväxt av C. difficile och effektiv syreborttagning. Om vätekoncentrationen sjunker under 3% eller om kammaren inte har använts under flera dagar, bör en kammare cykel att utföras för att återupprätta vätekoncentrationen till önskvärda nivåer. Här används ungefär en tredjedel av gasen i kammaren sugits ut (vinylrutan kommer att tömma avsevärt) och ersattes med färsk gasblandning. Se till att luftslussen är anaerob innan. Pumpa för mycket gas i kammaren bör undvikas, eftersom detta inte bara lägger onödig stress på vinylpåsen, men kommer också att hindra användare från att nå in på baksidan av kammaren. Utför alltid denna procedur i ett väl ventilerat utrymme. Vidta ytterligare försiktighetsåtgärder om chamber hålls i en liten, dåligt ventilerat utrymme. Öppna några dörrar till rummet som gasen innehållet inuti kammaren kan orsaka kvävning användaren.

    Extra underhåll omfattar förnyelse av palladiumkatalysator för att säkerställa en effektiv borttagning syre i kammaren. När syre och väte minskar med katalysatorn kan vatten ansamlas på ytan av palladiumtäckt aluminiumpellets, vilket minskar deras effektivitet med tiden. För att lösa detta, bör de palladiumkatalysatorer regenereras åtminstone en gång i veckan genom bakning vid minst 230 ° C under en timme. Dessutom, som en följd av både syrereduktion och avdunstning av vatten från tallrikar och media, är vatten samlas ett vanligt problem inom anaeroba kammare. För att säkerställa bekväm manipulation och öka halveringstiden av utrustningen i kammaren, kan torkmedel förpackningar användas, men bör torkas ut ofta enligt samma förfarande som används för palladiumkatalysatorer. Alternativt kan en deluftfuktare kan användas som cirkulerar luft genom ett metallblock som kondenserar vattnet och samlas i en behållare. Enheten förhindrar spill av vattenbehållare, men måste avfuktare övervakas och behållarna ska tömmas när nästan full. För att rengöra vinyl kammaren, är användningen av en mjuk trasa och ett kommersiellt tillgängligt rengöringsmedel som rekommenderas för polyvinylklorid (PVC) rekommenderas (t.ex. plast Magiska Cleaner, art nr. ​​1.600.480, Coy Laboratories). För att undvika repor och skador på vinyl kammaren inte använda pappershanddukar, Kim-våtservetter eller produkter som innehåller ketoner eller andra föreningar som skadar PVC.

    Slutligen C. difficile alstrar vätesulfidgas (H2S), som är extremt reaktiva och korrosiva. Vätesulfid kan vara skadligt för instrumentering, palladiumkatalysatorn och eventuella exponerade metallerna. Om det är möjligt, inte lämnar någon instrumentering, t.ex. homogenizers och spektrofotometrar, i chamber under lång gånger för att undvika korrosion förorsakad av vätesulfid. På grund av produktion av vätesulfid, kommer föremål såsom palladiumkatalysator och gasanalysator måste periodiskt bytas ut som en del av en regelbunden kammaren underhåll. Alternativ för minskning av svavelväte nivåer inuti kammaren, till exempel med användning av aktivt kol, blyacetat, silverklorid eller silversulfat för att absorbera eller kemiskt avlägsnande av vätesulfid, har beskrivits 34 och kan användas för att fördröja korrosion av utrustning.

    Ytterligare försiktighetsåtgärder

    Öppna aldrig en dörr till luftslussen utan att se till att den andra dörren är stängd och låst för att förhindra kontaminering syre. Dessutom undviker användning av vassa föremål i kammaren för att minska risken för punktering av vinyl.

    Det är viktigt att notera att väte är en lättantändlig gas i närvaro av syre. Var försiktig när du införa poster into kammaren att höga nivåer av förorening syre inte förekommer (mer än 999 ppm). Det är viktigt att endast använda förblandad ej brandfarlig anaerob gasblandning och noga övervaka gasanalysapparaten i kammaren, särskilt när du använder en ny bensintank. Om både väte och syre koncentrationer över 4% inträffar, se till att lämpliga åtgärder vid nödsituationer, som ska anges i laboratoriets standardrutiner (SOP), följs.

    Felsökning C. difficile tillväxt

    Om dålig tillväxt av C. difficile kulturer observeras i rikt medium, är det oftast på grund av förorening syre i kammaren. Tillägget av ett reduktionsmedel (t.ex. L-cystein eller thioglycolate) till mediet kan förbättra tillväxten, men skulle frågan om föroreningar syre i kammaren måste åtgärdas. Övervakning syre och väte nivåer i kammaren med hjälp av en gas-analysator kan snabbt enLert användaren att problem innan en försening i utvecklingen och minskad produktivitet inträffar. Om föroreningar syre uppstår, snabbt identifiera källan med en gasläcka detektor (tillgänglig från Coy Laboratories) rekommenderas. För att öka chansen att hitta läget för en läcka, kan en trasa indränkt i alkohol placeras inuti kammaren eftersom gasen läckagedetektor kan identifiera ökade halter av kolväten, såväl som ökade nivåer av väte. När källan till läckan hittas, kan den repareras genom att använda lim eller silikon i enlighet med tillverkarens instruktioner.

    Ett antal organismer lätt växa i anaeroba miljöer, bland andra vanliga klostridie arter (t.ex. Clostridium perfringens) och fakultativt anaerob, Escherichia coli. Aseptisk teknik och andra strategier kan minska risken för kontaminering. Lämpliga organisationer i kammaren, till exempel att placera objekt inom räckhåll för att minska den potentiella feller spill och snabb borttagning av ackumulerat biologiskt avfall kan minska kontamineringsrisker. Dessutom kan pappershanddukar fuktade med en utspädd blekmedel lösning regelbundet förs in i kammaren för att torka av ytor och latex eller neoprenhandskar. Det är viktigt att inte lämna blekmedel eller alkohollösningar inne i kammaren under en längre tid eftersom de kan genomsyra atmosfären och fasta och flytande medier, döda C. difficile, såväl som att skada vinyl 34. Dessutom kan regelbunden ersättning av latex eller neopren handskar också minska föroreningsrisk. Som nämnts ovan, om du är osäker om en organism är C. difficile eller en förorening, ett test för närvaron av den tdcB-genen med användning av PCR kan snabbt avgöra huruvida organismen är C. difficile 21. Slutligen, om odling av flera organismer inom samma anaerob kammare, är det viktigt att notera att C. difficile kan producera metaboliska biprodukter (e. G.. Svavelväte) som hämmar tillväxten av andra anaeroba organismer och vice versa.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Vi vill tacka Coy Laboratories för vänligt ger bilder av den anaeroba kammaren. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag DK087763 (SMM) och en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Proteose Peptone no. 2 BD 212120
    Na2HPO4 Fisher S373
    KH2PO4 Fisher BP362
    NaCl Fisher S27
    MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
    á´…-Fructose Fisher L96
    Sodium taurocholate Sigma T4009
    á´…-cycloserine Sigma C6880
    Cefoxitin Fluka C4786
    Brain heart infusion medium BD 237300
    Proteose Peptone BD 211684
    (NH4)2SO4 Sigma A5132
    Tris base Fisher BP152
    Agar BD 214010
    L-cysteine Sigma C7755
    BactoPeptone BD 211684
    Columbian sheep blood agar Fisher L21928
    NaCl Fisher S27
    KCl Fisher P217
    Glycerol Fisher BP2291
    Sterile inoculating loops Fisher 22363596
    Sterile swabs Fisher 1495990
    Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
    Materials
    TCCFA agar

    Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
    Na2HPO4 5 g
    KH2PO4 1 g
    NaCl 2 g
    MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
    Fructose 6 g
    Agar 20 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    After autoclaving, add:
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
    25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
    1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

    BHIS Medium

    Brain heart infusion 37 g
    Yeast extract 5 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):

    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

    SMC Sporulation Medium

    BactoPeptone 90 g
    Protease peptone 5 g
    (NH4)2SO4 1 g
    Tris base 1.5 g
    Agar 15 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):
    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

    70:30 Medium

    BactoPeptone 63 g
    Protease peptone 3.5 g
    Brain heart infusion 11.1 g
    Yeast extract 1.5 g
    (NH4)2SO4 0.7 g
    Tris base 1.06 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

    Blood agar

    The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

    1X Phosphate buffered saline (PBS)

    NaCl 8.01 g
    KCl 0.2 g
    Na2HPO4 1.44 g
    KH2PO4 0.27 g

    Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

    References

    1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
    2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
    3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
    4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
    5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
    6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
    7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
    8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
    9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
    10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
    11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
    12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
    13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
    14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
    15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
    16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
    17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
    18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
    19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
    20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
    21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
    22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
    23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
    24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
    25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
    26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. (2013).
    27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
    28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
    29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
    30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
    31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
    32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
    33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. (2012).
    34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
    35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter