دراسة تفاعلات

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم أساليب لدراسة تأثير PSMS وغيرها من السموم التي يفرزها

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Surewaard, B. G. J., van Strijp, J. A. G., Nijland, R. Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (77), e50788, doi:10.3791/50788 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نقدم أساليب لدراسة تأثير modulins ذوبان الفينول (PSMS) وغيرها من السموم المنتجة ويفرز من قبل المكورات العنقودية الذهبية على العدلات. لدراسة الآثار المترتبة على PSMS على العدلات ونحن عزل العدلات الطازجة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يتم تحميل هذه العدلات مع صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. تفعيل العدلات بواسطة PSMS يبدأ الزيادة السريعة وعابرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة من خلال رصد مضان من صبغة محملة مسبقا أن يتفاعل مع زيادة تركيز الكالسيوم الحرة 2 +. باستخدام هذه الطريقة يمكننا تحديد تركيز PSM اللازمة لتفعيل العدلات، وقياس آثار مثبطات المحددة والعامة من تفعيل العدلات.

للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء داخل الخلايا، ثه وقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون PSMα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. والمبتلعة الذهبية من قبل العدلات، يمكن ملاحظة تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان.

Introduction

العدلات (PMNs) هي البالعات المهنية التي تلعب دورا رئيسيا في الاستجابة المناعية الفطرية ضد المكورات العنقودية الذهبية 1. وقد قاد معركة مستمرة بين المضيف وميكروب إلى سباق تسلح من الاثنين معا. مؤخرا، المجتمع المصاحب (CA) سلالات مقاومة meticillin S. العنقودية الذهبية (الجرثومة) ظهرت الذي يبدو أن تكون فعالة جدا في التحايل على العدلة مقتل 2،3. ارتبط ذوبان modulin (PSMS) الإنتاج المفرط من الفينول CA-MRSA مع ارتفاع الفوعة 4،5. ويمكن التعرف على هذه العدلات الإنسان PSMS عبر FPR2 التي تؤدي إلى تفعيل هذا البروتين يقترن G-مستقبلات 6. واحدة من أقرب الأحداث هو تعبئة مخازن داخل الخلايا من الكالسيوم (كا 2 +). كا 2 + بمثابة رسول الثانوية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك المستجيب من PMNs تحبب والبلعمة 7. ولذلك كا 2 + هو مؤشر حساس جدا للالقدرات الوظيفية للPSMS لتفعيل PMNs. لدراسة آثار PSMS على العدلات، يتم عزل العدلات الطازجة ومحملة صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة. باستخدام هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة الآثار المباشرة للمكونات السامة وغيرها من العدلات، وتحديد أقل تركيز في هذه التي هي بالموقع. بالنسبة لنا، بل هو أداة مفيدة جدا لدراسة تأثير العديد من البروتينات التي تنتجها S. المكورات المشاركة في التهرب المناعي، مثل FPR2 البروتين المثبطة (FLIPr) FLIPr مثل والانجذاب الكيميائي البروتين المثبطة من المكورات العنقودية الذهبية (رقائق) 9. وقد تبين أن كل هذه البروتينات لمنع تعبئة الكالسيوم في العدلات ملزمة لمستقبلات الاعتراف ناهض.

في الآونة الأخيرة، وقد وصفت مجموعتنا أن PSMS حرمانهم ظيفيا بواسطة البروتينات الدهنية في الدم 10 </ سوب>. هذه البروتينات الدهنية موجودة بوفرة داخل الدم والأنسجة البشرية، مشيرا إلى أن PSMS ممارسة وظيفتها في المقام الأول في البيئة داخل الخلايا. سمح بتوفر فحص تعبئة الكالسيوم لنا أن نقيس بدقة تأثير البروتينات الدهنية في الدم على تفعيل العدلات من قبل PSMS، يدل على ذلك تثبيط كبيرا من تركيزات منخفضة جدا من المصل.

منذ PSMS وتحول دون وظيفيا عن طريق المصل، ونحن افترضنا أن هناك وظيفة هامة لPSMS كما السموم داخل الخلايا. ولذلك سعينا إلى تحديد دور PSMS بعد البلعمة. للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء بين الخلايا، لقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون psmα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. تم المبتلعة الذهبية من قبل العدلات، تم ملاحظتها تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان 10. ومن الواضح أن هذا تكhnique يسمح الدراسة للتعبير عن عدد كبير من الجينات في S. المذهبة أو الجراثيم الأخرى بعد البلعمة. منذ لS. الذهبية على قيد الحياة في محراب بين الخلايا مهم جدا للتغلب على نظام المناعة الفطرية 11 10 12، ودراسة دور الجينات تفعيلها في هذا المتخصصة هي ذات أهمية كبيرة لفهم شدته.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل PMNs من دم الإنسان عن طريق الطرد المركزي الكثافة

  1. رسم 5 9 أنابيب مل من الدم الوريدي heparinized.
  2. إعداد طبقة مزدوجة Ficoll التدرجات (4 تدرجات لمدة 5 أنابيب الدم) على النحو التالي: صب 12 مل من الكثافة 1.119 غ / مل حل ficoll في أنبوب مل 50 و بعناية طبقة 10 مل من الكثافة 1.077 غ / مل حل ficoll على القمة.
  3. تمييع الدم مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني.
  4. طبقة الدم المخفف بعناية على طبقة مزدوجة Ficoll التدرج؛ 20-25 مل لكل التدرج.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 396 XG في الدوار الدلو المتأرجح، 22 ° C دون الكبح.
  6. إعداد RPMI الباردة التي تحتوي على 0.05٪ الإنسان مصل الزلال (RPMI-HSA). أيضا بإعداد 9 مل العقيمة منزوع الأيونات H 2 O. قبل بارد كل من RPMI وH 2 O على الجليد.
  7. نضح طبقة أعلى Ficoll تحتوي على البلازما (صفراء اللون) وPBMC، والطبقة الثانية من Ficoll (أبيض اللون) مع استخدام مضخة فراغ (وضع تلميح ماصة معقمة علىماصة).
  8. جمع PMNs في 50 مل أنابيب باستخدام ماصة بلاستيكية صغيرة (1 أنبوب للكسور PMN من كل التدرجات 2)، ووضعها على الجليد.
  9. إضافة الباردة RPMI-HSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 249 XG في 4 درجات مئوية.
  10. خلع طاف مع استخدام مضخة فراغ، ودوامة بلطف بيليه (الكريات الحمراء وPMNs).
  11. إضافة 9 مل العقيمة منزوع الأيونات H 2 O وبدء موقت. وقف صدمة فرط ناضح بعد 30 ثانية بالضبط، وذلك بإضافة 1 مل 10 مرات المركزة PBS. ملاحظة: 30 ثانية هي حرجة للغاية.
  12. إضافة الباردة RPMI-HSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 249 XG في 4 درجات مئوية.
  13. خلع طاف مع استخدام مضخة فراغ وجمع PMN بيليه في 1 أنبوب مع حجم محدد (1-2 مل) RPMI-HSA.
  14. تحديد كمية الخلايا وضبط تركيز إلى 1.10 7 خلية / مل. اعتمادا على الجهة المانحة، فإن العائد من PMNs معزولة يكون betweEN 5 × 10 6 و 3 × 10 7 PMNs من كل أنبوب مل 9 من الدم

2. تدفق الفحص Cytometric لتقدير تعبئة الكالسيوم في PMNs الإنسان

  1. خلايا الحمل (5 × 10 6 خلية / مل) مع 2 ميكرومتر فلوو-3-AM في RPMI-HSA واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة هزاز ببطء، وذلك باستخدام هزاز على سبيل المثال على منصة شاكر، محمية من الضوء.
  2. في هذه الأثناء بإعداد التخفيف المتسلسل (مثلا 3 أضعاف) من التحفيز في 10X تركيز النهائي. يستخدم PSMα3 في هذا البروتوكول، ولكن أي حافز النوع من الاختزال الذي يعمل على العدلات هو مناسب.
  3. إعداد المانع المركزة 10X من مستقبلات في RPMI-HSA. عندما يتصرف المانع على التحفيز (مثل HDL على PSMα3) قبل احتضان 25 ميكرولتر التحفيز مع حجم مساو من مثبط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا من خلال إضافة 10 مل من RPMI-HSA وأجهزة الطرد المركزي ل249 XG في درجة حرارة الغرفة. Resuspend الخلايا إلى 5 ×10 6 خلية / مل.
  5. فقط قبل التجربة، وتمييع الخلايا إلى الخلايا 2x10 6 / مل في RPMI-HSA وإضافة 200 ميكرولتر خلايا في أنبوب FACS. PMNs المخفف هشة جدا. سوف ابقائها فترة طويلة جدا في هذا التركيز يؤدي إلى صناعة السيارات في تفعيل، والشيء نفسه ينطبق على قوي يهز أو pipetting ل.
  6. نعلق الأنبوب إلى تدفق عداد الكريات، وانتظر 3 ثوانى وبدء الاستحواذ. بعد فترة زمنية محددة (على سبيل المثال 8 ثانية)، خلع الأنبوب بسرعة وإضافة 50 ميكرولتر التحفيز للعينة. على الفور إعادة نعلق الأنبوب على صاحب العينة ومواصلة عملية الاستحواذ.
  7. نبدأ مع أدنى ونهاية مع أعلى تركيز من التحفيز. غسل إبرة قياس التدفق الخلوي بانتظام بعد كل تشغيل مع RPMI-HSA.
  8. تحليل البيانات مع برمجيات تحليل تدفق الخلوي. مقارنة متوسط ​​إشارة مضان قبل الجمع من التحفيز لأنه بعد إضافة الحافز واستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لحساب ميلانقوة tivation لكل التخفيف قياسها.

بدلا من ذلك عندما يتصرف المانع على مستقبلات قبل احتضان الخلايا مع مثبط.

3. التحليل المجهري مضان من البكتيريا التعبير GFP بعد البلعمة من PMNs

  1. تنمو S. سلالات المكورات تحتوي على بناء مراسل الفائدة أكثر من ليلة في مرق (مع المضادات الحيوية عند الحاجة للحفاظ على مراسل البلازميد). في هذه السلالة حالة MW2 تحتوي يستخدم PSMα GFP بناء مراسل 10، ونمت في أنبوب بلاستيكي 50 مل مع 5 مل من LB مستنبت.
  2. لإزالة كل من GFP O / N التعبير، ويخفف من الثقافات إلى OD 660 0.01 وتنمو إلى OD 660 0.1. Redilute هذا 01:30 ثقافة، ورصد النمو حتى يصل إلى ثقافة OD 660 من 0.1. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ويغسل مرة واحدة في DPBS. resuspend في 01:10 من حجم الأصلي للحصول على OD 660 من 1.0 أو Roughly 5.10 8 كفو / مل.
  3. مزيج البكتيريا (1.10 7 / مل) مع PMNs المعزولة حديثا (1.10 6 / مل) في RPMI-HSA (نسبة 10:1) في microtube 1.5 مل وإضافة مصل الإنسان المجمعة إلى تركيز النهائي من 10٪. يهز على منصة تهتز لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحفيز البلعمة. تمييع PMNs محملة البكتيريا إلى 5.10 5 PMNs / مل و 250 ميكرولتر ماصة في بئر من 8 غرف جيدا انزلاق الغطاء.
  4. صورة PMNs مع البكتيريا على المجهر. مجهر مقلوب مجهزة NA الهدف 40X/0.85 يعمل بشكل جيد، وينبغي المغطى في غرفة مظلمة البيئة للحفاظ على البيئة مستقر عند 37 درجة مئوية. الحصول على صور لعدد من وظائف محددة مسبقا باستخدام الكاميرا كل 5-10 دقيقة في كل من حقل مشرق وقناة GFP لمتابعة إنتاج GFP في الوقت المناسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تدفق cytometric فحص لتقييم تعبئة الكالسيوم في PMNs الإنسان

يحتضنها العدلات مع سلسلة تركيز PSMα3 الاصطناعية مما أدى إلى تفعيل السريع مقاسا تدفق الكالسيوم، والذي يظهر من خلال زيادة في إشارة في FL-1. ما قبل الحضانة الاصطناعية PSMα3 مع 0.01٪، مصل الإنسان 0.1٪ أو 1٪ كبيرا يحول دون القدرة على انتزاع تدفقات الكالسيوم (الشكل 1).

تحليل التعبير GFP في البكتيريا بعد البلعمة من قبل PMNs باستخدام المجهر مضان

البكتيريا المبتلعة تحتوي على مراسل PSMα-GFP بناء 10 البداية ليتألق الخضراء بين 1 و 2 ساعة بعد البلعمة، مشيرا إلى التعبير من المروج PSMα. البكتيريا خارج العدلات لا يتألق، أو إظهار مضان إلا بعد أن شكلت البكتيريا خارج الخلية microcolonies الكثيفة (الشكل 2). هؤلاءوتشير البيانات إلى أن التعبير عن PSMα يتم تبديل بسرعة على عندما يتم المبتلعة البكتيريا عن طريق PMNs.

الشكل 1
الشكل 1. العدلة التنشيط من خلال PSMα3. تفعيل العدلات من قبل مجموعة تركيز PSMα3، مقاسا تعبئة الكالسيوم. عندما يتم إضافة كميات قليلة جدا من المصل هو تحول دون تفعيل العدلات، وعلى المصل 1٪ أي تفعيل بالكاد مرئيا في هذه التركيزات PSMα3 (مقتبس من مرجع 10).

الشكل 2
الشكل 2. تحريض التعبير عن PSMα بعد البلعمة.سمح العدلات في phagocytose S. الذهبية تحتوي على مراسل بناء من مروجي PSMα تنصهر إلى GFP. حوالي 1 ساعة بعد بدء البلعمة البكتيريا داخل الخلايا تبدأ في يتألق الخضراء، مشيرا إلى التعبير من PSM α الاوبرون، في حين أن البكتيريا خارج العدلة (#) لا تحث على التعبير α PSM في هذا الإطار الزمني (مقتبس من مرجع 10).

الشكل (3)
الشكل (3). نموذج تخطيطي لتجارب أجريت. تم عزل العدلات وحضنت مع PSMS لقياس تأثير تفعيل هذه اللوالب متقابلة الزمر الصغيرة في فحص تعبئة الكالسيوم. عندما تمت إضافة مصل، وتحييد PSMS والتي لم تعد تنشيط العدلات. لدراسة الخلايا expression من PSMS، سلالة تحتوي على التحام PSMα-المروج لGFP كانت مختلطة مع الدم والعدلات للسماح البلعمة. وأعقب GFP التعبير باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مضان. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الأساليب المذكورة هنا بعض الخطوات هي حرجة للغاية. سوف نسلط الضوء هذه هنا.

لعزل العدلات بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة من المهم عدم تعكير صفو طبقات أثناء أو بعد الخطوات الطرد المركزي. عندما الشفط العدلات باستخدام ماصة بلاستيكية، تأكد من عدم الضغط على البالون بينما في طبقة من الخلايا، سوف كسائل إخراج تعكر صفو طبقات. أيضا، تفقد البصر بيليه من العدلات بعد الصدمة ناضح وخطوة الطرد المركزي. إذا كان بيليه هو كان لا يزال أحمر تحلل كرات الدم الحمراء ليست فعالة بما فيه الكفاية، ويجب أن يتكرر مرة أخرى. إذا كان هذا يحدث بانتظام، وزيادة فترة حضانة مع منزوع الأيونات H 2 O بنسبة تصل إلى خمس ثوان للحصول على تحلل كرات الدم الحمراء أكثر اكتمالا.

للتعرف على طريقة تعبئة الكالسيوم من المهم أن يكون العدلات أن يتم عزل الطازجة. عموما، والخلايا التي تم تخزينها في الثلاجة لسوف يا طويل لم يستجب كذلك. لأنها إما قد تم تنشيطها يسبب بالفعل انخفاضا في تأثير التحفيز وأضاف، أو لقوا حتفهم، وسوف لا تستجيب على الإطلاق. تجميع قوي من العدلات هو إشارة إلى أنهم ليست جديدة بعد الآن، وينبغي التخلص منها.

في الإعداد المجهر العديد من الأمور الهامة. لتكون قادرة على مراقبة أي بزيادة قدرها GFP داخل البكتيريا، فمن الضروري أن بروتين GFP درجة عالية من الاستقرار وإزالتها من البكتيريا عن طريق عدة خطوات تخفيف والنمو في ظل ظروف حيث يتم التعبير عن الجينات في المصالح عند مستوى منخفض جدا أو لا على جميع. في حالتنا، كما الاوبرون psmα يعبر بكثافة عالية الخلية 13، خطوتين تخفيف المتكررة قبل الخلايا تصل إلى منتصف سجل مرحلة كافية. أيضا لهذه التجارب، فمن الأفضل أن العدلات هي جديدة، وخاصة منذ كنت قد ترغب في متابعتها لعدة ساعات في المجهر. إضافة يوديد propidium (PI) لRPMIسوف-HSA عازلة تسمح التصور من اضطراب في غشاء الخلايا المتعادلة من قبل التعبير عن PSMS. عند إضافة PI، تأكد من أن تتوفر الفلاتر المناسبة في المجهر وبالتالي فإن PI مضان أحمر لا تتداخل مع مضان GFP الخضراء. وخاصة عند استخدام مرشحات تمريرة طويلة لGFP، سوف PI تتدخل بالتأكيد. وثمة خيار آخر للاهتمام هو استخدام للصحفيين الفلورسنت متعددة في البكتيريا، مثل التكامل الكروموسومات من CFP إلى جانب وجود مراسل GFP، التي من شأنها أن تسمح لرصد جميع البكتيريا باستخدام المجهر متحد البؤر، حيث أنه من الصعب أن نرى البكتيريا غير المسمى. أيضا في مجال واسع المجهر مضان باستخدام تسميات متعددة لديها مزايا واضحة. والعيب من استخدام للصحفيين الفلورسنت مستقرة كما فعلنا هو استقرارها. دوران بطيء جدا من البروتين GFP يسمح فقط بمراقبة من ON-التبديل لمراسل، يمكن لل-OFF التبديل لا يمكن تصور بسهولة. لهذا واحد سوف تحتاج إلى استخدام تمر اقتصاداتها بمرحلة انتقاليةلها بنيات GFP عدم استقرار، أو استخدام نظام التعبير التلألؤ مدعوم من مثل لوكس الاوبرون 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Molecular Probes / Life Technologies F-1241
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 density 1.077 g/ml
Histopaque Sigma 11191 density 1.119 g/ml
RPMI 1640 Gibco, Life Technologies 52400-025 contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope Leica Microsystems, The Netherlands TCS SP5 objective: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur BD Biosciences FACSCalibur Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
  2. Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
  3. Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
  4. DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
  5. David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
  6. Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
  7. Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
  8. Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
  9. de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
  10. Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
  11. Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
  12. Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. In Press (2013).
  13. Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
  14. Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics