Inchworming: A Novel moteur Stéréotypie dans le BTBR

Behavior

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Summary

Inchworming est un mouvement de creusement synchrone très répétitif affichée par BTBR T + RTI 3TF / J (BTBR) souris lorsqu'il est placé dans une cage de test avec une literie de sciure suffisante. La procédure est une modification du protocole d'interaction sociale des mineurs et est utilisée ici pour évaluer stéréotypies motrices répétitives pertinentes pour troubles du spectre autistique.

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Smith, J. D., Rho, J. M., Masino, S. A., Mychasiuk, R. Inchworming: A Novel Motor Stereotypy in the BTBR T+ Itpr3tf/J Mouse Model of Autism. J. Vis. Exp. (89), e50791, doi:10.3791/50791 (2014).

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Abstract

Les troubles du spectre autistique (TSA) est un trouble neurologique du développement comportemental défini caractérisé par l'interaction sociale réciproque diminué, communication anormale, et des comportements répétitifs avec intérêt restreint. Comme le diagnostic repose sur des critères cliniques, des modèles de rongeurs potentiellement pertinentes de ce trouble hétérogène devraient idéalement récapituler ces traits comportementaux divers. Le tf BTBR T + Itpr3 / J (BTBR) souris est un modèle animal établi de TSA, affichant des comportements répétitifs tels que l'augmentation de toilettage, ainsi que la rigidité cognitive. En ce qui concerne l'interaction sociale et de l'intérêt, le test de lecture mineur a été utilisée dans plusieurs modèles de rongeurs de TSA. Ici, nous montrons que lorsque les souris BTBR sont testés dans une enceinte de l'interaction sociale des mineurs contenant de la litière de sciure de bois, ils affichent un mouvement de creusement synchrone répétitif. Ce comportement répétitif du moteur, dénommé "inchworming", a été nomméen raison de la nature des mouvements stéréotypés présentées par les souris tout en déplaçant horizontalement dans le sol. Souris Inchworming doivent utiliser leurs membres antérieurs et postérieurs membres en synchronie pour déplacer la literie, l'exécution d'un minimum d'un intérieur et un mouvement vers l'extérieur. Bien que les souris (B6) BTBR C56BL/6J et présentent ce comportement, les souris BTBR démontrent une durée sensiblement plus élevée et la fréquence des inchworming et une diminution du temps de latence pour initier inchworming lorsqu'il est placé dans une enceinte lits. Nous concluons que ce comportement nouvellement décrit fournit une mesure d'une stéréotypie moteur répétitif qui peut être facilement mesurée dans des modèles animaux de TSA.

Introduction

Bien que la physiopathologie des troubles du spectre autistique (TSA) reste incertaine, le diagnostic dépend de la présence de trois grandes catégories de symptômes: la réciprocité sociale anormale, troubles de la communication, et / comportements stéréotypés répétitifs 1. La plupart des modèles de rongeurs sont incapables de reproduire simultanément les trois des symptômes chez un seul animal. Ainsi, les modèles qui peuvent simuler de manière fiable certains ou tous les aspects de la maladie détiennent une grande valeur pour le développement de stratégies préventives et thérapeutiques efficaces. Un modèle qui fait afficher les trois aspects de la TSA est le 1,2 de la souris BTBR.

En combinaison avec les vocalisations ultrasoniques et des tests d'approche sociale, le test d'interaction sociale des mineurs est couramment utilisé pour caractériser des modèles murins de TSA pédiatrique; Ces tests mesurent diminué et les comportements sociaux anormaux qui représentent les caractéristiques fondamentales de TSA. En plus du test d'interaction sociale juvénile, de nombreux autrestests ont été utilisés pour mesurer des comportements stéréotypés dans des modèles animaux de TSA. Par exemple, le test d'enfouissement de marbre, qui examine la tendance d'un animal à déplacer litière utilisant le museau et les pattes avant dans l'effort pour couvrir un objet, est pensé pour mesurer des comportements stéréotypés compulsifs qui se produisent en réponse à des stimuli aversif 3,4. Par conséquent, les tests de creusement ont été mises en œuvre pour quantifier ce comportement répétitif dans des modèles animaux de TSA et différentes espèces de rongeurs 3,5-7. Comportements de creusement sont définies comme des actions dirigées évidentes du museau ou les pattes pour déplacer des matériaux de litière et ont été émis l'hypothèse d'être un paramètre sensible du comportement moteur répétitif 4.

Nous rapportons ici un type de creusement de roman, que nous avons appelé "inchworming," dans la souche BTBR de souris. La caractérisation de ce nouveau problème peut fournir une mesure robuste d'un comportement moteur répétitif qui peut être utilisé pour de plus amples vallidation des modèles de rongeurs tels que les TSA, «la maladie de Huntington ou le comportement obsessionnel-compulsif 8,9. Nous définissons le "inchworming" comme au moins un mouvement synchrone des parties avant et des membres postérieurs vers l'intérieur, suivi par un déplacement synchrone vers l'extérieur, ce qui conduit au déplacement du matériau de litière. Cela diffère de comportement typique de creusement de plusieurs façons. En premier lieu, le comportement inchworming est généralement observée comme une combinaison d'épisodes plutôt qu'un seul événement isolé. En revanche, le trou peut se produire seul mouvement coordonné soit la biche ou pattes antérieures 3. En outre, les mouvements inchworming tendance à se produire à l'horizontale à travers le plancher de l'enceinte, par opposition à des positions fixes qui sont caractéristiques de creuser des comportements. Enfin, le comportement inchworming décrit ci-dessous se produit fréquemment dans la souche pure de souris BTBR mais est rarement identifié dans la souche témoin de B6, tandis que les comportements de creusement typiques sont communs dans les souches B6 et BTBR de souris 1.

Étant donné que l'enfouissement de marbre, creuser, et le jeu des mineurs ont établi la valeur de mesure de comportement anormal dans des modèles murins de TSA, le comportement de inchworming complète ces mesures précédemment définies de comportements stéréotypés. En particulier, le comportement inchworming fournit une mesure utile de la baisse des stéréotypies motrices de l'ordre qui sont couramment identifiés dans les TSA 8,11. En outre, cette nouvelle procédure de inchworming peut fournir aux chercheurs un outil supplémentaire précieux pour l'analyse des comportements moteurs répétitifs pertinentes à des troubles du développement tels que les TSA.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées en accord avec le Comité de protection des animaux du Canada et approuvés par l'Université de Calgary Comité de protection des animaux.

1. Préparation des animaux

  1. Isoler les souris la nuit (12 h) avant le test. Pour ce faire, placer tous les BTBR et souris B6 (P35-P40) nécessaires à l'analyse expérimentale dans des cages par eux-mêmes, le jour avant le test.
  2. Placer la souris isolée dans la chambre d'analyse comportementale 30 min avant le test de sorte que les animaux ne s'habituent au nouvel environnement.

2. Préparation du matériel

  1. Placez les cm en plexiglas 30 x 30 box avec un couvercle amovible dans la salle d'examen. Placer la boîte sur une table et la position de la caméra vidéo à un angle à partir du bas de 45 °; cet endroit de la caméra permettre une visualisation de la totalité du sol de l'enceinte et la souris. Utilisez un éclairage infrarouge pour aider à minimiser les reflets de la paroi dela boîte.
  2. Utilisez une caméra vidéo qui possède une fonction de zoom élevé avec des capacités infrarouges pour optimiser le tournage dans un environnement de faible lux. Mise au point sur l'enceinte agrandissement de l'image de sorte que les souris sont visualisées à travers la boîte entière.
  3. Couvrir tout le plancher de la boîte avec de la literie de la sciure de bois (qui devrait être d'environ 1 pouce de profondeur).

3 Procédure de test

  1. Placer une paire intra-souche de souris (BTBR - BTBR ou B6-B6) à l'intérieur de l'enceinte d'essai.
  2. Éteignez les lumières dans la salle d'examen.
  3. Lancer la caméra vidéo pour enregistrer et quitter la salle. Cela permettra d'éviter expérimentateur influence sur le comportement des souris. Enregistrer l'activité de 11 min.
  4. Une fois l'enregistrement terminé, re-entrer dans la salle d'essai et revenir les souris dans leurs cages à domicile d'origine.
  5. Disposer de la litière de sciure de bois, laver la zone d'essai entière avec 70% d'éthanol, et placer une nouvelle literie de sciure de bois dans le fond de l'essaienceinte.
  6. Répétez toute la procédure pour le reste des paires intra-tache et retourner les souris dans leurs cages à domicile d'origine.

Remarque: Pour vérifier la fiabilité des données de inchworming, la procédure peut être répétée les jours suivants avec différents BTBR-BTBR et B6-B6 combinaisons de paires. Cela permettra d'assurer que le comportement observé ne dépend pas de partenaire spécifique dans l'enceinte, mais l'individu inchworming.

4. Analyse des données

  1. Inchworming est défini comme le mouvement synchrone vers l'intérieur et vers l'extérieur de l'avant-et pattes postérieures de l'animal, avec un minimum d'une co-occurrence vers l'intérieur puis mouvement vers l'extérieur ultérieure qui déplace efficacement la literie. Manuelle regarder et marquer chaque vidéo deux fois (une fois pour chaque souris) afin de déterminer la durée totale, la fréquence et la latence à arpenteuse dans les 10 min vidéo. Manuel de notation inchworming durée, la fréquence et la latence devrait être basé sur le suiviment définitions:

    Inchworming Durée: Est défini comme le temps total de chaque souris dépense engagé dans le comportement de inchworming. Pour marquer cet aspect de inchworming, utiliser une minuterie qui peut être démarré et arrêté. Commencer le chronométrage lorsque la souris commence à arpenteuse et arrêter le chronomètre lorsque la souris s'arrête inchworming. Quand et si la souris commence à arpenteuse de nouveau, re-départ et ré-arrêter le chronomètre. Répéter le démarrage et l'arrêt de la minuterie pour la durée de 10 min de la période d'observation chaque fois que les arpenteuses de la souris. Cela va générer un score de durée de inchworming qui est 0:00-10:00 min.

    Fréquence Inchworming: est défini comme le nombre de fois que la souris met en prise dans le comportement inchworming dans la période d'observation de 10 min. Un compte unique est attribué à chaque démarrage de la souris et les arrêts inchworming. Le score de fréquence inchworming sera un nombre entre 0 et ∞.

    Latence de Inchworm: Est défini comme le temps eau passe avant la première apparition de inchworming. Lancer le chronomètre lorsque la vidéo commence, ce sera le temps de 0:00, et arrêter le chronomètre lorsque les arpenteuses de la souris pour la première fois. Si la souris ne s'affiche pas le comportement inchworming la latence à arpenteuse sera 10h00. Lors de l'analyse de latence à arpenteuse, un score 0:01-10:00 min sera obtenu. Les souris qui ne arpenteuse pendant la durée de la période de test doivent être retirés de la population de l'échantillon afin de s'assurer que les résultats sont pertinents pour une population de souris qui présentent le comportement de inchworming.

  2. Calcul de la fréquence et de la durée totale de inchworming pour chaque souris dans la vidéo. Calculer le temps nécessaire pour la première souris dans la paire de chenille arpenteuse de la latence à arpenteuse pour cette paire spécifique de la souris. Ces paramètres sont basés sur le travail méthodologique préalable liée à des comportements de creusement répétitives chez la souris 6.
  3. Calculer la durée moyenne, la fréquence,et la latence de creuser pour chaque groupe expérimental dans l'analyse (par exemple BTBR vs B6). Utilisez une analyse de variance ou un test t de comparer les données entre les souches / groupes expérimentaux.

    Remarque: Lorsque la procédure est terminée sur une deuxième journée, utilisez une ANOVA à mesures répétées pour s'assurer qu'il n'y avait pas d'effets procès ultérieurs ou des effets d'appariement.

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Representative Results

La version modifiée du test de lecture mineur décrit ici peut être utilisé pour observer et analyser le comportement de creusement répétitif roman appelé inchworming. Inchworming est exposée à une plus grande mesure par les souris BTBR que les contrôles B6. Dans une session typique de 10 min, les souris BTBR affichera le comportement de inchworming distincte (synchrone vers l'intérieur et vers l'extérieur mouvement des pattes dans un effort pour déplacer la litière de sciure de bois) pendant environ 5 minutes, soit la moitié de la période d'observation. En outre, le temps de latence à arpenteuse est significativement plus courte pour les souris BTBR - ils commencent typiquement inchworming l'intérieur de la 10 première section de début de la session enregistrée. En revanche, les souris témoins (B6) ont un temps de latence moyen de chenille arpenteuse de 4 min et passent très petites portions de leur temps à afficher réellement le comportement. Ces résultats sont similaires aux données des études antérieures sur les comportements de creusement répétitives chez les rongeurs 3,6.

Figure 1 illustre la bonne expérimental mis en place des procédures de test. figure 2 montre la durée de inchworming moyenne (A), la fréquence (B) et la latence (C) à chenille arpenteuse pour les souris BTBR et la souche B6 de commande. Tous les paramètres sont significativement différentes entre les souches. Dans l'expérience rapportée ici, le test a été administré inchworming sur une période d'essai de 2 jours, avec des associations de remplacement de la deuxième journée, et les résultats de chaque jour ont été comparés. Aucune différence significative n'a été trouvée, assurant ainsi que les effets ne sont pas dépendant soit appariements de souris spécifiques ou la répétition de l'essai. Enfin, la figure 3 contient encore des photos de différentes souris engagés dans les deux principales composantes du comportement de inchworming.

Figure 1 Figure 1. Équipement mis en place pour l'expérience de inchworming. Matériel mis en place pour l'expérience de inchworming. Une boîte en plexiglas de 30 cm cube est fixé sur une table devant une caméra zoom infrarouge positionné à un angle de 45 °. Le fond de l'enceinte est recouverte entièrement d'une couche uniforme d'au moins 1 cm de la sciure de bois.

Figure 2
Figure 2. Durée de inchworming moyenne, la fréquence et la latence affichée par paires de BTBR et des souris B6. L'BTBR (n = 8) et B6 (n = 8), les souris ont été testées à P35-P40 sur une période d'essai de deux jours et ont marqué pour inchworming comportement. A) La souche BTBR affiché une durée significativement plus longue moyenne de inchworming que la souche de contrôle de la B6 (p <0,001). B) Les souris BTBR affichés une significfréquence antly ultérieure de inchworming par rapport aux témoins B6 (p <0,001). C) Il y avait une différence significative dans BTBR (n = 8) et B6 (n = 7), la latence de creuser avec BTBR affichage d'une diminution marquée du temps a eu pour afficher le comportement par rapport aux témoins B6 (p = 0,001).

Figure 3
Figure 3. Représentation illustrative de souris différente dans les deux aspects du comportement de inchworming. Le panneau supérieur est un exemple de la souris dans la phase d'extension du comportement inchworming, tandis que le panneau inférieur est, par exemple, des souris dans la phase de contraction du comportement de inchworming . Inchworming est défini comme le mouvement vers l'extérieur vers l'intérieur synchrone et synchrone de l'avant et de derrière les membres de la souris pour déplacer la literie.

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Discussion

Inchworming est un roman mesure du comportement répétitif qui peut être utilisée pour étudier de nombreux troubles qui présentent des stéréotypies tels que les TSA. Il ya 4 étapes qui sont d'une importance cruciale pour générer des données de inchworming fiables du protocole d'interaction sociale des mineurs modifié: 1) la période d'isolement prolongé est essentiel à l'épreuve de inchworming et ne doit pas être retiré du protocole ou raccourcie. Cette exigence est spécifique aux tests de inchworming en paires décrites ici. 2) La caméra vidéo doit être positionné de manière appropriée et ciblée de telle sorte que les souris puissent être visualisées complètement dans toute l'enceinte en Plexiglas. 3) Le boîtier doit être nettoyé à fond entre les paires de tests pour s'assurer que les comportements actuels ne sont pas influencés par les parfums de la paire avant de la souris. 4) Le matériau de litière pour l'enceinte doit être suffisante (~ 1 pouce de profondeur) et doit être sciure; souris ne s'affiche pas le comportement inchworming avec peu / pas de litière ou lorsqueplacé sur d'autres matériaux de litière.

Bien que n'étant pas décrite ici, nous avons observé le comportement inchworming en non-isolés, souris BTBR hébergement social placés seuls (plutôt que par paires) dans une enceinte à grand lit similaire. Dans ces conditions, les souris BTBR encore arpenteuse, mais à une fréquence plus basse et la durée, ce qui indique que le comportement inchworming est un comportement stéréotypé éventuellement induite par l'anxiété sociale (données non présentées). Toutefois, étant donné que les études n'ont pas réussi à démontrer de façon fiable les différences dans l'anxiété entre le BTBR et souris témoins B6, l'anxiété est probablement une interaction avec d'autres facteurs pour induire ce comportement 12. Cependant, l'objectif de cet article était la modification méthodologique standardisé le protocole d'interaction sociale pour mineurs, car il suscite le comportement rapide et fiable, avec des différences considérables entre BTBR et souris B6. En outre, les données sont recueillies à partir de deux animaux en une seule session, augmentant ainsi la informeration obtenu à partir de chaque période de test. Dans notre laboratoire, le comportement inchworming n'a été confirmé dans la tranche d'âge de P35-P55. Bien qu'il soit possible que les souris jeunes et plus âgés affichent ce comportement répétitif, l'impossibilité d'identifier inchworming à d'autres âges peut indiquer que le comportement est spécifique aux souris adolescents et jeunes adultes.

Les données de cette expérience montrent clairement que la souche de souris BTBR s'engage dans le comportement de inchworming répétitif plus rapidement, plus fréquemment et pour des durées plus longues que les contrôles de B6. Le comportement inchworming peut donc fournir aux chercheurs une nouvelle mesure de comportements répétitifs dans d'autres TSA et des modèles de maladies. Bien qu'il n'est pas encore clair ce qui motive ce mouvement de creusement répétitif, souris BTBR affichent également des niveaux plus élevés d'auto-toilettage et évitement social 1, 9. Comme creusement est un trait inné génétiquement régulée chez la souris, le test du comportement inchworming peut be appliquée facilement à d'autres souches et a le potentiel pour être un outil précieux pour évaluer les stéréotypies motrices et comportements compulsifs dans d'autres modèles de la maladie.

Un des traits de comportement cachet qui caractérisent TSA est un comportement répétitif avec des intérêts restreints 9. En plus de souligner une stéréotypie moteur précieux, cette expérience a augmenté la validité du modèle de souris BTBR de TSA en démontrant un comportement répétitif supplémentaire similaire à la présentation clinique des stéréotypies motrices chez les patients TSA. Inchworming est affiché dans les deux souris BTBR (TSA) et les souris de contrôle de la B6, même si le comportement est relativement rare chez les souris B6. Le comportement qui ressemble le plus inchworming creuse comportements chez des rongeurs. Thomas et al. 4 suggère que pour les rongeurs, creusement sert une variété de fonctions, y compris la conservation des aliments, prédateur évasion, et la protection de l'environnement d'aversion. Comme ces fonctions ne sont pas ncasaire dans le cadre d'un laboratoire, les souris qui présentent des niveaux élevés de comportement creuser peuvent remplir un besoin compulsif du comportement 4. En outre, Silverman et al. 9 suggère que le comportement creuser devrait être intégrée dans l'analyse de l'essai juvénile de l'interaction sociale comme une mesure de l'activité non-sociale.

En résumé, inchworming est un comportement hautement répétée significativement plus fréquentes chez les souris BTBR (un modèle de TSA) par rapport à des souris B6 (souche de contrôle). Bien que l'étiologie du comportement est actuellement inconnu, il peut être une ressource précieuse pour les chercheurs examinent compulsivité et la répétition dans des modèles rongeurs de nombreuses maladies. Les techniques de procédure sont simples et peuvent être complétés avec facilité dans un délai de 24 heures. L'analyse des données est plus complexe et prend du temps, mais l'enregistrement vidéo de la procédure de test permet au chercheur de compléter l'analyse hors-ligne et de façon répétitive afin d'assurer la cohérence entre les évaluateurs etfiabilité.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

Les auteurs sont reconnaissants pour l'assistance technique et logistique et l'expertise fournie par Rose Tobias, Younghee Ahn et David N. Ruskin. Le travail décrit ici a été financé par la Fondation Hôpital de l'Alberta Children et l'Institut de recherche en santé de l'Alberta Children.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid Can be constructed
IR Camera Survshop (Calgary, Alberta) Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome Find a camera with high-resolution and zoom capabilities
DVR Supercircuits (Austin, Texas) BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner High data capacity
Sawdust Same as bedding material

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References

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