عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

1Department of Biological Sciences, University of Delaware
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

حقن مكروي إلى خلايا الأجنة وهو أسلوب شائع يستخدم لدراسة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في هذه الطريقة يتم تحميل كمية صغيرة من محلول معالجة في إبرة حقن مكروي الذي يستخدم لحقن الخلايا جسديا يجمد الفردية أو الأجنة. على الرغم من الحاجة إلى التدريب الأولي لتنفيذ هذا الإجراء للتسليم الإنتاجية العالية، حقن مكروي يوفر أقصى قدر من الكفاءة والتسليم استنساخه من مجموعة واسعة من حلول معالجة (بما في ذلك مخاليط معقدة من عينات) في الخلايا، والبيض أو الأجنة. وتشمل التطبيقات لإبر دقيقة جدا تسليم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، البروتينات المؤتلف، وزيادة وظيفة، وفقدان وظيفة الكواشف. يتم إضافة صبغة الفلورسنت أو اللونية في حل حقن لتمكين التصور لحظة من التنفيذ الفعال وكذلك أداة للتطبيع موثوق لمبلغ من الحل تسليمها. الطريقة الموصوفة تمكن Microinjection من 100-400 البحر قنفذ ضygotes في غضون 10-15 دقيقة.

Introduction

كفاءة وقابلة للتكرار تقديم العلاج هي واحدة من التحديات المنهجية الرئيسية للباحثين. وقد وضعت عدة طرق لتقديم حلول عابر العلاج في البيض والأجنة، والخلايا. وتشمل هذه الأساليب التثقيب الكهربائي (على أساس توليد المسام عابرة في غشاء باستخدام النبضات الكهربائية قصيرة) 1،2، lipofection (تسليم من خلال مزيج من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على العلاج مع الغشاء) وعجلت microparticle القصف 1 (DNA على ميكرون الجسيمات الحجم المعدنية التي تستخدم بعد ذلك لاختراق الخلايا بسرعة عالية)، وتنبيغ (يتم استخدام فيروس كوسيلة إيصال الجينات المحورة). في هذه اللحظة، حقن مكروي هو النهج الوحيد الذي يحمل ميزة تقديم أي حل مع كفاءة 100٪ مع الحد الأدنى من الكواشف. علاوة على ذلك، حل حقنة واحدة يمكن أن تتكون من مزيج معقد من العلاجات. وقد استخدمت هذه التقنية لنجاحmicroinject لاي البيض والأجنة من العديد من الأنواع مثل قنافذ البحر 3،4، حمار وحشي الأسماك 5، 6 الماوس، الضفدع 7، 8 والماشية وكذلك الخلايا واحد في زراعة الأنسجة 9. كما تم إجراء الحقن عن Blastomeres واحد في وقت لاحق من مراحل النمو 10-12.

وتستند الأساليب الحالية للإبر دقيقة جدا في طريقة ضغط الحقن التي تم وصفها في البداية من قبل Hiramoto 10، ولكن تم إحراز تقدم كبير نحو تعظيم الاستفادة من هذه العملية. وقد وصفت تقنيات Microinjection ممتازة في أماكن أخرى 11، وهنا نحن تصف إحدى الطرق المحددة التي يتم استخدامها حاليا لmicroinject قنفذ البحر (Strongylocentrotus purpuratus) البويضات المخصبة حديثا. لأكثر من قرن، كانت قنافذ البحر على قيمة تجريبية نموذج 15،16. ترتبط قنافذ البحر تطويريا ارتباطا وثيقا الحبليات (بما في ذلك لنا) وتحليلكشفت الجينوم الخاصة التي تحتوي عليها جميع الأسر الجينات الرئيسية مثل 17 الإنسان. أنها تنتج عدد كبير من الأجنة النامية بشكل متزامن الشفافة التي يمكن التلاعب بها بسهولة. باستخدام قنفذ البحر باعتباره النموذج الحي، وقد ساهم المجتمع قنفذ البحر في فهمنا لعملية الإخصاب 18-21، 22-24 خلية العمليات البيولوجية، والشبكات التنظيمية الجينات (GRNs) 25-28.

حقن مكروي إلى بيضات ملقحة قنفذ البحر يتطلب عدة خطوات. أولا، تحتاج البيض إلى أن يجمد قبل الحقن (موضح أدناه). والمغلفة أطباق حقن مكروي مع بروتامين سلفات (PS)، مما يخلق سطح موجبة الشحنة، التي يمكن أن البيض سالبة الشحنة الالتزام 3. وdejellied البيض قبل الحضانة في مياه البحر الحمضية (الرقم الهيدروجيني 5.15) لمدة 10 دقيقة، تليها اثنين يغسل في مياه البحر الطبيعية أو مياه البحر الاصطناعي (درجة الحموضة 8.0). والتجديف بعناية البيض dejellied في خط مستقيمفي منتصف الطبق PS المغلفة في وجود 1 ملم 3 aminotriazole (3-AT)، وهو مطلوب لتمنع نشاط ovoperoxidase الذي يفرز من حبيبات القشرية من البيض نتيجة للإخصاب 29. هذه الخطوة مهمة لمنع تصلب المغلف الإخصاب وتسهيل دخول إبرة حقن مكروي. كبديل ل1 ملم 3-AT، 10 ملم حمض البارامينوبنزويك (PABA) يمكن استخدامها. يتم تحميل الحل في حقن إبرة حقن مكروي باستخدام المتخصصة microloading ماصة غيض وتركيبه على حامل تعلق على مياداة مجهرية وحدة الضغط (الشكل 1). كل إبرة يمكن استخدامها لmicroinject بيضات ملقحة الفردية في تجارب متعددة في أيام منفصلة. حقن مكروي لا يمكن أن يؤديها لمدة 10-15 دقيقة حتى تتصلب بيضات ملقحة. ثم يتم غسلها بيضات ملقحة مع مياه البحر ومثقف في 15 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة الفقس الأريمة المرحلة، التي يطلقون الانزيم الذي يساعد على هضم الفقس مكونات فرtilization المغلف 30 والسماح لهم لفصل بطبيعة الحال من الطبق PS المغلفة. إذا لزم الأمر، ويمكن فصل الأجنة برفق من الطبق باستخدام ماصة باستور ماصة الفم أو عن طريق النفخ بلطف مياه البحر على الأجنة. الطريقة الموصوفة تمكن حقن مكروي فعالة وموثوق بها من 100-400 البويضات المخصبة حديثا على طبق واحد، وتوفير وسيلة الإنتاجية العالية لتحليل المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد بروتامين سلفات (PS) المغلفة أطباق

  1. تحضير محلول 1٪ من سلفات بروتامين (PS) وذلك بإضافة 0.5 غرام من PS إلى 50 مل من منزوع الأيونات والماء المقطر (DDH 2 O) في أنبوب 50 مل المخروطية. يهز جيدا بسرعة عالية على شاكر مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة لضمان حل كامل للPS. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل (تأكد من تذوب تماما مثل هلام راسب قبل كل استعمال) 3.
  2. كم تأخذ من 60 مم × 15 مم البوليسترين أطباق بتري ووضع كل من الأغطية وقيعان على مقاعد البدلاء.
  3. صب 1٪ محلول PS في كل طبق (سواء قيعان والأغطية يمكن استخدامها) ما يكفي لتغطية السطح، يترك لمدة 2 دقيقة على الأقل. الحل PS بقايا يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة في غضون 3 أشهر عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. المكان الأطباق PS المعاملة في دورق مملوء بالماء المقطر (DH 2 O). ترك الدورق تحت تشغيل DH 2 O على الأقل10 دقيقة.
  5. أطباق PS المغلفة يمكن استخدامها على الفور أو الهواء الجاف للتخزين. تغطيتها لمنع تراكم الغبار. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 شهر 3.

2. الحصول على قنفذ البحر الأمشاج وشل البيض على طبق PS المغلفة لحقن مكروي

  1. قنافذ البحر تفرخ عن طريق هز أو حقن intracoelomic تصل إلى 1 مل من 0.5٪ بوكل للحث على تقلص العضلات الملساء للافراج عن الأمشاج 3 (الشكل 2).
  2. إذا كان الحيوان هو من الذكور، كما يتبين من اللون الأبيض الحيوانات المنوية، وجمع الحيوانات المنوية الجافة من على سطح الأرض من حيوان في أنبوب 1.5 مل. ويمكن تخزين الحيوانات المنوية الجافة في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع دون خسائر كبيرة في الوظيفة البيولوجية.
  3. إذا كان الحيوان هو الأنثى، كما يتبين من اللون الأصفر بسبب محتوى صفار البيض، وجمع الأمشاج في بغمر gonopores في كوب كامل من الماء البحر. وسوف يتم الافراج عن البيض من gonopores ويستقر بفعل الجاذبية. </ لى>
  4. تحديد البيض من الحطام مثل أشواك حيوان باستخدام 80 ميكرون نايلون شبكة التصفية. يتم تحقيق أفضل النتائج إذا تم استخدام البيض في غضون 5-7 ساعة بعد وضع البيض.
  5. Dejelly البيض:
    1. إعداد 100 مل من ماء البحر الحمضية لحوالي 1 مل من البيض. استخدام 0.5 M حمض الستريك لضبط درجة حموضة مياه البحر من 8.0 درجة الحموضة 5،1-5،2 ل. منخفضة للغاية لدرجة الحموضة ستنخفض الإخصاب وسوف عالية جدا من درجة الحموضة لا تسمح البيض لنعلق على لوحات PS المغلفة.
    2. إضافة البيض (وليس أكثر من 1 مل) لمياه البحر الحمضية والسماح للبيض ليستقر على الجليد لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، إزالة هلام معطف يمكن أن تيسره يحوم طيف من البيض أثناء فترة العلاج. يمكن للمرء بشكل فعال dejelly S. البيض purpuratus في 3-4 دقيقة بهذه الطريقة.
    3. صب بعناية قبالة مياه البحر الحمضية، إضافة مياه البحر الطازجة وترك البيض يستقر على الجليد مرة أخرى. ويمكن تخزين البيض Dejellied على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة دون مشاكل الإخصاب

    3. الصف البيض

    1. 1 إعداد حل M الاسهم من 3 aminotriazole (3-AT، MW = 84.08) عن طريق إذابة 0.84 غرام من 3-AT في 10 مل من DDH 2 O. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. إعداد 1 ملم حل عمل 3-AT بإضافة 50 ميكرولتر من الحل 1 M الأسهم إلى 50 مل من ماء البحر prechilled. الحفاظ على الحل على الجليد.
    3. إعداد الفم ماصة (الشكل 3) لمعالجة طيف من البيض:
      1. يتم سحبها يدويا من غيض ماصة بال micropipettes الزجاج (100 × 1.09 مم OD). عقد micropipette بكلتا يديه على اللهب المكشوف. كما يبدأ في الذوبان الزجاج، وسحب بعناية نهايات ماصة في اتجاهات متعارضة.
      2. قم بتوصيل أحد سحبت ماصة لأنابيب البلاستيك (ID 1.14 ملم)، وختم ضيق مع parafilm. يجب أن يكون طول الأنبوب حوالي 50-70 سم.
      3. إدراج العقيمة تصفيتها P20 أو P200 تلميح في نهاية العكس أنبوب للأنابيب الزجاج لأن تستخدم قطعة الفم.
      4. مقطع نهاية من micropipette الزجاج مع مقص لضبط القطر من طرف. قطر الأمثل يتجاوز بقليل من القطر من البيض (80 ميكرون).
    4. صب 4 مل من 1 ملم 3-AT مياه البحر في كل طبق PS المغلفة (القاع أو غطاء).
    5. اتخاذ ماصة الفم، وضعت غيض P20/P200 في الفم وضمان الحصول عليها مع الأسنان. لنضح البيض، ونضح أول كمية صغيرة من مياه البحر. من خلال وجود عمود من السائل قبل تحميل البيض، واحد من السيطرة القصوى على تقنية pipetting لالفم.
    6. موقف الطرف micropipette بالقرب من البيض ونضح بلطف في عدة مئات من البيض في ماصة. حصر البيض داخل micropipette الزجاج.
    7. dejellied الصف البيض في خط مستقيم على طبق من قبل تهب بلطف لهم للخروج من ماصة الفم أثناء نقل معلومات سرية في خط مستقيم. الصف البيض الحق قبل الحقن، لأنه قد تحدث مشاكل الإخصاب بسبب عrolonged التعرض إلى 3-AT مياه البحر 3. علاوة على ذلك، يمكن لاصقة الموجبة مثل PS تكون سامة للبيض، وأنه ليس من المستحسن أن تعرض الأجنة لهذه الكواشف لفترات طويلة، وخاصة إذا تم إزالة المغلفات الإخصاب.
    8. جعل الصفر على الطبق بالقرب من خط البيض التجديف باستخدام ماصة الزجاج. وهذا الصفر من المهم كسر إبرة الحقن لضبط تدفق الحل حسب الحاجة. بدلا من ذلك، يمكن إجراء الصفر قبل صب مياه البحر 3-AT إلى الطبق.

    4. Microinjection من البحر قنفذ بيضات ملقحة

    1. تشغيل محطة حقن مكروي. نحن هنا وصف استخدام نظام حقن FemtoJet.
    2. سحب الشعيرات الدموية الحقن باستخدام مجتذب الإبرة. ويصور مثال على إبرة جيدة في الشكل 4. ملاحظة: للحصول على حقن الحمض النووي الريبي، ينبغي سابقة التجهيز الشعيرات الدموية حقن لتجنب التلوث RNAase 31:
      1. وضع الشعيرات الدموية حقن 50 مل المخروطيةأنابيب وإضافة 50 مل من الميثانول تصفيتها / حمض الهيدروكلوريك (9:1). يهز جيدا وتترك طوال الليل لمدة لا تزيد عن 10 ساعة.
      2. تخلصي من الميثانول / حامض الهيدروكلوريك وشطف الشعيرات الدموية 2X مع الميثانول تصفيتها في نفس الأنبوب.
      3. استنزاف الميثانول قدر الإمكان ويجفد الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها لضمان إزالة كاملة من الميثانول.
    3. جبل بعناية الشعرية إبرة على حامل إبرة التحميل وتحميله مع <0.5 ميكرولتر من محلول العينة باستخدام نصائح microloader. تتضمن حلول العينة عادة 20٪ الجلسرين، اعتمادا على المواد حقن 3.
    4. وضع طبق البيض مع التجديف على المسرح المجهر (البيض يجب أن تكون محاذاة عموديا عندما ينظر اليها من خلال العدسات) والتركيز على البيض.
    5. جبل بعناية الإبرة تحميلها على حامل microinjecting الإبرة وضبط الموقف من الإبرة لقمة مركزة تماما في وسط الميدان.
    6. الضغط على الزر لتطبيق الحد الأقصى للضغط FOص تنظيف الإبرة. الحل يجب أن يخرج من إبرة. ضبط ضغط إذا لزم الأمر: يجب أن يكون ضغط الحقن في نطاق 90-360 HPA، مع ضغط التعويض في ما يقرب من 1/3 من ضغط الحقن.
    7. ضبط تدفق الحل عن طريق حقن في البويضة غير المخصبة. باستخدام عصا التحكم مياداة مجهرية، وإدارة غيض من إبرة الحقن إلى بيضة غير مخصبة. لتسهيل دخول الإبرة، وإنشاء يرتجف طفيف بواسطة التنصت لطيف من المرحلة مع كائن من الصعب مثل سائق المسمار. وينبغي أن ينظر إلى بلعة حقن تشكيل داخل البويضة (الشكل 5).
    8. إذا كان بلعة حقن غير مرئية، ورفع قليلا من رأس الإبرة فوق البيض، وتحديد موقع الصفر على طبق وتعديله ليكون وضع في وسط الميدان. بلطف اضغط على طرف الإبرة إلى علامة الصفر لكسر غيض من إبرة الحقن. ضبط الضغوط حقن والتعويض لضمان أن بلعة حقن لا يتجاوز 5/1 رانه القطر من البيض (1-2 مساء).
    9. مرة واحدة يتم معايرة بلعة حقن، يخصب البيض بإضافة الحيوانات المنوية المخفف (1:1،000) أو 1-2 ميكرولتر من الحيوانات المنوية. تخلط جيدا بعناية لمنع طرد صف من البيض.
    10. تبدأ مباشرة بعد الحقن يصبح المغلف الإخصاب مرئية (الشكل 5). التحرك على طول خط البيض التجديف باستخدام وحدة تحكم المرحلة وحقن العديد من بيضات ملقحة ممكن عن طريق بدس لهم الإبرة التي يسيطر عليها عصا التحكم مياداة مجهرية.
    11. بعد 10-15 دقيقة، فإن البويضات المخصبة حديثا تصبح تصلب ولا يمكن حقن أي لفترة أطول. إزالة الطبق من مرحلة ونضح بعناية من الحيوانات المنوية في مياه البحر 3-AT باستخدام البلاستيك ماصة باستير.
    12. لا تدع بيضات ملقحة الجافة. بسرعة إضافة مياه البحر prechilled جديدة لتغطية الطبق. احتضان الأجنة في 15 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت GFP mCherry ويبني مراسل في المختبر كتب وmicroinjected في البويضات المخصبة حديثا. وحضنت الأجنة عند 15 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (حتى المرحلة الأريمة) وتصويرها باستخدام مجهر زايس المراقب Z1. لم حقن يبني مراسل لن يؤدي إلى أية عيوب التنموية (الشكل 6). لالكمي للإشارات الفلورسنت، تم إجراء الحصول على الصور في التكبير المنخفض (100X) لالتقاط الحد الأقصى بكسل الفلورسنت (أرقام 6D-F). وتم قياس كمية إشارات الفلورسنت باستخدام Axiovision 4.8.2.0. لم الأخطاء القياسية لكثافة إشارات الفلورية بين السكان من 100-200 الأريمات لا تتجاوز 1.5٪ (لا تظهر البيانات).

الشكل 1
الشكل 1. الإعداد حقن مكروي. (A) A دي المغلفة PSيقع ركلات الترجيح مع البيض يجمد على مرحلة (B) مجهر مقلوب. ويرد حقن مكروي الإبرة إلى (C) حامل الإبرة التي يتم توصيلها إلى (D) وحدة الضغط. يتم توجيه الحركة في س، ص، ض، وأبعاد باستخدام (E) ومياداة مجهرية أو (F) مناور الخشنة. (G) ويستخدم سائق المسمار ملفوفة مع المناشف الورقية للاستفادة بلطف المرحلة المجهر للحث يرتجف طفيف لتسهيل دخول الإبرة في البويضة المخصبة حديثا.

الرقم 2
الشكل 2. التفريخ من قنافذ البحر. (A) هو فعل قنفذ البحر لتسليط عن طريق الحقن intracoelomic من 0.5٪ بوكل. النقاط الإبرة لغشاء محيط بالفم المحيطة فم الحيوان، الجزء الناعم فقط من الحيوان.(ب) يتم وضع أنثى قنفذ البحر مع gonapores لها مغمورة في مياه البحر في كوب من البلاستيك لجمع البيض الأصفر. (C) يتم تحريرها الحيوانات المنوية الأبيض من gonapores من قنفذ البحر الذكور.

الرقم 3
الرقم 3. . ماصة الفم يتكون ماصة الفم من ثلاثة أجزاء: (أ) زجاج micropipette إبرة، (B) أنابيب بلاستيكية، و (C) وP20 تصفية العقيمة أو P200 تلميح. يتم إدراج micropipette الزجاج في أنابيب بلاستيكية والتي يتم توصيلها إلى P20 أو P200 قطعة الفم.

الرقم 4
الشكل 4. حقن مكروي إبرة. (A) وإبرة حقن مكروي هو PULأدى باستخدام إبرة ساحبة مع إعداد محددة. الإعداد للساحبة إبرة يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. باستخدام Narishege PC-10 إبرة ساحبة، ونحن نستخدم 72.8 درجة مئوية للحرارة الضبط 1 و 83.7 ° C لتحديد الحرارة 2. باستخدام الصفر على لوحة نحن كسر رأس الإبرة لتسهيل تدفق الحل. (ب) يجب أن يكون إبرة جيدة بطول 500-600 ميكرون من عرض 50 ميكرون عند الكتف إلى 5 ميكرومتر على الحافة.

الرقم 5
الرقم 5. حقن البيض قنفذ البحر المخصبة حديثا. تم جذف البيض Dejellied على طبق المغلفة PS والمخصبة. تم حقن البويضات المخصبة حديثا واحدا تلو الآخر في الوقت الذي يتجه المسرح المجهر على طول خط بيضات ملقحة (من الأعلى إلى الأسفل). (أ) يعتبر حقن البلعة بوضوح إلى أن تشكيل داخل المخصبة حديثاالبيض في رأس الإبرة. (ب) يتم تشكيل مغلف شفاف الإخصاب عند الإخصاب. (C) الحيوانات المنوية تظهر نقاط صغيرة سوداء في الخلفية. شريط النطاق هو 50 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
الرقم 6. بيضات ملقحة Microinjected تطورت الأريمات دون عيوب التنموية أو المورفولوجية. تم حقن البويضات المخصبة حديثا مع علامات الفلورسنت التي تسمح لهم يمكن تمييزها بوضوح من الأجنة uninjected (كما هو موضح من قبل السهام). (AC) أجنة تصوير في 400X التكبير. يتم تصوير (DF) الأجنة في التكبير 100X لالتقاط معظم إشارات مضان المنبعثة لتقدير موثوق بها. بعد 24 ساعة عالتسميد معاهدة الفضاء الخارجي، تم جمع الأريمات وتعامل مع مياه البحر 2X لمدة 2 دقيقة لشل حركة الأجنة السباحة ثم من 1X غسل مياه البحر. تم الحصول على الصور مع المراقب زايس Z1 المجهر والكاميرا AxioCam monochromic. (A، D) وصور من مدينة دبي للإنترنت الأريمات. (B، E) الصور تراكب من الأجنة في المختبر مع حقن كتب mCherry مضان في مدينة دبي للإنترنت وقنوات. (C، F) تراكب الصور من الأجنة في المختبر مع حقن كتب GFP مضان في مدينة دبي للإنترنت وقنوات. شريط النطاق هو 50 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حقن مكروي هي تقنية قوية لتقديم علاجات مختلفة مثل الحمض النووي، ومرنا، والبروتينات المؤتلف، وفقدان وظيفة وربح من الكواشف وظيفة، والأصباغ ومجموعاتها في البيض والأجنة، وخلايا الكائنات الحية المختلفة 1-7. ومع ذلك، يجب أن تبقى العديد من الاعتبارات في الحسبان عند تصميم تجربة حقن مكروي.

من الأهمية بمكان أن ينظر في ذوبان علاج تسليمها وحجم الحقن. إذا كان هذا الحل microinjected يميل إلى تشكيل راسب حتى طفيفة، سيتم انسداد الإبرة microinjecting. عموما فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي الحل لأكثر من 15 دقيقة قبل تحميلها في الإبرة للتأكد من إزالة أي راسب من الحل 3. النهج الآخر هو لتمرير حل من خلال الأعمدة تدور ميليبور. إذا كان من غير الممكن تجنب انسداد، فإنه قد يكون من الممكن لتنشيط الإبرة التي كتبها طيف كسر غيض مرة أخرى،ولكن يصبح من الصعب السيطرة على تدفق الحل إذا غيض واسعة جدا. كمية كبيرة من الحل حقن يمكن أن تكون سامة إلى الجنين، علاوة على ذلك، وغيض واسعة يدخل اختلافات أكبر بين وحدات التخزين من حل حقنها في أجنة الفردية. من المهم أيضا أن كمية حقن في حجم البويضات المخصبة حديثا وتعديلها. حجم حقن يمكن معايرة عن طريق سحب الإبر على مختلف إعدادات تليها حقن حل في النفط. وهذا يسمح لقياس قطرها (وبالتالي حجم) من الحبرية 32. نجد أن مبلغ مقبول من الحل حقن في البويضة المخصبة حديثا يجب أن لا تتجاوز 1/5 قطر البيضة الملقحة كما هو مبين في الشكل 5.

النصيحة الرئيسي هو لتحميل الإبرة الحق قبل الحقن، إلى العمل بسرعة، وكثير من الأحيان إلى استخدام الزر تنظيف ظيفة من حاقن الذي يؤدي تطبيق أقصى قدر من الضغط المتاحة للمخرج فيأجل طرد حقن إبرة المحظورة.

في بعض الأحيان قد تسد الإبرة من الخارج، وعندما الحيوانات المنوية والحطام من البيض حقن سابقا التمسك غيض من الإبرة. في هذه الحالة، فإنه من المفيد لرفع الإبرة على طول الطريق حتى من الماء 3-AT في الطبق عن طريق الحقن. عادة ما يكون التوتر الناجم عن واجهة السائل الهواء ما يكفي لازالة الانقاض. بدلا من ذلك، بالفرشاة بلطف إبرة الحقن ضد الصفر على لوحة الحقن قد يساعد أيضا. في الحالة القصوى، فمن الممكن لمسح رأس الإبرة مع Kimwipe الرطب نازف. ومع ذلك، مثل المسح يتطلب الحذر الشديد والممارسة.

الأصباغ الفلورية مثل 10،000 ميغاواط تكساس الأحمر يسين اتهم ديكستران (2 ملغ / مل) تنتج إشارة قوية التي يمكن أن يتم الكشف عن وتستخدم لتطبيع موثوقة من الحل حقن. عندما مرنا هو ليتم حقنه، فمن المستحسن أن coinject مع mCherry أو GFP mRNAs وجنبا إلى جنب مع مرنا لفيterest لضمان عدم تدهور مرنا وقعت. في هذه الحالة التصور للإشارة الفلورسنت تعتمد على ترجمة mCherry أو GFP. إذا كان استخدام الأصباغ أو يبني الفلورسنت غير ممكن، فمن المستحسن الصف كمية صغيرة من البيض على كل طبق على حدة للتأكد من أن جميع البويضات المخصبة حديثا على هذا الطبق يتم حقن.

في الختام، حقن مكروي هو أداة قيمة للبحوث في مجال علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية والخلوية، والتنموية. باستخدام هذه التقنية، جعلت المجتمع قنفذ البحر مساهمة كبيرة في فهمنا للخلية والبيولوجيا التطورية مثل مواصفات مصير الخلايا، وظيفة الجين، تنظيم الجينات والمسارات البيوكيميائية التطور الجنيني الأساسي 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.

Acknowledgements

نشكر سانتياغو سواريز لقراءة نقدية للمخطوطة وبيتي Cowgill للحصول على مساعدات في التصوير الفوتوغرافي. كما نشكر المراجعين المجهول لملاحظاتهم حرجة. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث جامعة ولاية ديلاوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  2. Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
  3. Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
  4. Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
  5. Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
  6. Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
  7. Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
  8. O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
  9. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. (2011).
  10. Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
  11. Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
  12. Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
  13. Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
  14. Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
  15. Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
  16. McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
  17. Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
  19. Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
  20. Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
  21. Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
  22. Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
  23. Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
  24. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
  25. Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
  26. Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
  27. Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
  28. Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
  29. Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
  30. Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
  31. Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics