High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

1Department of Biological Sciences, University of Delaware
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Micro-injectie in cellen en embryo is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om een ​​groot aantal biologische processen te bestuderen. Bij deze werkwijze wordt een kleine hoeveelheid behandelingsoplossing in een micro-injectie naald die wordt gebruikt fysiek afzonderlijke injecteren geïmmobiliseerde cellen of embryo geladen. Ondanks de behoefte aan initiatieopleiding deze procedure voor high-throughput levering, microinjectie biedt maximale efficiëntie en reproduceerbare levering van een breed scala van behandelende oplossingen (waaronder complexe mengsels van monsters) in cellen, eicellen of embryo's. Toepassingen op micro-injecties bevatten aflevering van DNA-constructen, mRNA, recombinante eiwitten, gain of function, en functieverlies reagentia. Fluorescente of colorimetrische kleurstof wordt toegevoegd aan de geïnjecteerde oplossing directe visualisatie van efficiënte levering en een instrument voor betrouwbare normalisatie van de hoeveelheid van de geleverde oplossing mogelijk. De beschreven methode maakt micro-injectie van 100-400 zee-egel zygotes binnen 10-15 minuten.

Introduction

Efficiënte en reproduceerbare behandeling levering is een van de belangrijkste methodologische uitdagingen voor onderzoekers. Verscheidene methoden zijn vastgesteld om behandelingsoplossingen tijdelijk te leveren in de eieren, embryo's en cellen. Deze methoden omvatten elektroporatie (gebaseerd op het genereren van tijdelijke poriën in het membraan met behulp van korte elektrische pulsen) 1,2, lipofectie (leverbaar door de fusie van behandeling met liposomen met het membraan) 1, bombardement met microdeeltjes 1 (DNA wordt geprecipiteerd op het micron -sized metalen deeltjes die vervolgens worden gebruikt om de cellen bij hoge snelheid doordringen) en transductie (virus wordt gebruikt als transportmiddel van transgenen). Momenteel, micro-injectie is de enige benadering die het voordeel biedt dat iedere oplossing met 100% rendement met minimale reagentia bezit. Bovendien kan een enkele injectie oplossing bestaat uit een complexe cocktail van behandelingen. Deze techniek is gebruikt om succesvollely microinject de eieren en embryo's uit tal van soorten, zoals zee-egels 3,4, zebravis 5, 6 muis, kikker 7, en runderen 8, alsmede enkele cellen in het weefsel cultuur 9. Single blastomeren injecties in latere ontwikkelingsstadia zijn ook uitgevoerd 10-12.

De huidige werkwijzen voor micro-injecties zijn gebaseerd op de druk-injectiemethode de aanvankelijk beschreven door Hiramoto 10, maar heeft grote vooruitgang geboekt optimalisatie van dit proces. Uitstekende micro-injectie technieken zijn elders 11 beschreven, en hier beschrijven we een van de specifieke methoden die momenteel gebruikt wordt om zee-egel (Strongylocentrotus purpuratus) nieuw bevruchte eieren microinject. Al meer dan een eeuw, hebben zee-egels een waardevol experimenteel model 15,16 geweest. Zee-egels zijn evolutionair nauw verwant aan chordates (waaronder wij) en analyse vanhun genoom onthulde dat ze alle belangrijke gen families als de menselijke 17 bevatten. Ze produceren een groot aantal synchroon ontwikkelen transparante embryo dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd. Het gebruik van zee-egel als modelorganisme, heeft de zee-egel gemeenschap bijgedragen aan ons begrip van de bevruchting proces 18-21, celbiologische processen 22-24, en het gen regulerende netwerken (GRNs) 25-28.

Micro-injectie in zee-egel zygotes vereist een aantal stappen. Ten eerste moeten de eieren worden geïmmobiliseerd voor injecties (hieronder beschreven). Micro-injectie gerechten worden bekleed met protamine sulfaat (PS), dat een positief geladen oppervlak waarop de negatief geladen eieren kan hechten 3 ontstaat. De eieren worden dejellied door incubatie in zure zeewater (pH 5.15) gedurende 10 minuten, gevolgd door twee wassingen in natuurlijk zeewater of kunstmatig zeewater (pH 8,0). De dejellied eieren worden zorgvuldig geroeid in een rechte lijnin het midden van PS-gecoate schaal in aanwezigheid van 1 mM 3-aminotriazool (3-AT), die nodig is om de activiteit van ovoperoxidase dat wordt afgescheiden uit de corticale korrels van het ei als gevolg van bevruchting remmen 29. Deze stap is belangrijk om verharding van de bevruchting envelop voorkomen en micro-injectie naald toetreding bewerkstelligen. Als alternatief voor 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic zuur (PABA) worden gebruikt. De injectie-oplossing wordt in een micro-injectie naald met behulp van gespecialiseerde microloading pipettip geladen en gemonteerd op een houder bevestigd aan micromanipulator en druk unit (figuur 1). Elke naald kan worden gebruikt om individuele zygoten microinject in meerdere experimenten op verschillende dagen. Micro-injectie kan worden uitgevoerd gedurende 10-15 min tot de zygoten harden. De zygoten worden vervolgens met het zeewater en gekweekte gewassen bij 15 ° C. Wanneer het embryo bereiken uitkomen blastula stadium, geven ze uitbroeden enzym dat onderdelen van de fer verteerttilization envelop 30 en hen in staat stellen om op natuurlijke wijze los te maken van de PS-gecoate schaal. Indien nodig kan de embryo voorzichtig worden losgemaakt van de schaal met een mond pipet of Pasteur pipet zachtjes blazen zeewater op het embryo. De beschreven werkwijze maakt een efficiënte en betrouwbare micro-injectie van 100-400 bevruchte eieren op een schotel, die een high-throughput werkwijze voor downstream analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van protaminesulfaat (PS) Coated Gerechten

  1. Bereid 1% oplossing van protamine sulfaat (PS) door toevoeging van 0,5 g PS 50 ml gedeïoniseerd, gedestilleerd water (DDH 2 O) in een 50 ml conische buis. Goed schudden op hoge snelheid op een bank shaker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur tot volledige oplossing van PS waarborgen. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste 3 maanden (zorg ervoor om volledig op te lossen gelachtige neerslag voor elk gebruik) 3.
  2. Neem een ​​koker van 60 mm x 15 mm polystyreen petrischaaltjes en lay-out van beide deksels en bodems op de bank.
  3. Giet 1% PS oplossing in elke schaal (zowel bodems en deksels kunnen worden) net genoeg om het oppervlak te bedekken, laat ten minste 2 minuten. De overgebleven PS oplossing kan vele malen hergebruikt worden binnen de 3 maanden indien bewaard bij 4 ° C.
  4. Plaats PS-behandelde gerechten in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (dH 2 O). De beker onder stromend dH 2 O gedurende tenminste10 min..
  5. PS-gecoate gerechten kunnen direct of lucht droog worden gebruikt voor opslag. Dek ze af om stofophoping te voorkomen. Ze kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 maand 3.

2. Verkrijgen Sea Urchin gameten en Immobiliseer de eieren op een PS-gecoate Schotel voor Microinjection

  1. Spawn zee-egels door schudden of intracoelomic injectie tot 1 ml 0,5% KCl tot contractie van gladde spieren bewegen om gameten 3 (figuur 2) los.
  2. Als het dier een mannelijk, zoals aangegeven door de witte kleur sperma, verzamel sperma droog van het oppervlak van een dier in een 1,5 ml buis. Droog sperma kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week zonder significant verlies van biologische functie.
  3. Als het dier een vrouwelijk, zoals aangegeven door de gele kleur door het gehalte aan eigeel, verzamel de gameten door onderdompeling van de gonopores in een beker vol zeewater. De eieren zullen worden vrijgegeven gonopores en settelen door de zwaartekracht. </ Li>
  4. Filter de eieren van puin zoals dierlijke stekels met behulp van 80 micrometer Nylon filter mesh. De beste resultaten worden bereikt als de eieren worden gebruikt binnen 5-7 uur na het kuitschieten.
  5. Dejelly de eieren:
    1. Bereid 100 ml zure zeewater ongeveer 1 ml ei. Gebruik 0,5 M citroenzuur om de pH van het zeewater te passen van pH 8,0 tot 5,1-5,2. Een te lage pH zal bevruchting verminderen en een te hoge pH zal niet toestaan ​​dat eieren te hechten aan de PS-beklede platen.
    2. Eieren (niet meer dan 1 ml) toe te voegen aan zure zeewater en laat de eieren om zich te vestigen op ijs gedurende 10 minuten. Als alternatief kan de verwijdering van de gelei coat worden vergemakkelijkt door voorzichtig zwenken van de eieren tijdens de behandeling. Men kan effectief dejelly S. purpuratus eieren in 3-4 min. op deze manier.
    3. Giet voorzichtig zuur zeewater, voeg vers zeewater en laat de eieren af ​​te wikkelen weer op ijs naar beneden. Dejellied eieren kunnen worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 6 uur zonder bevruchting problemen

    3. Rij de eieren

    1. Bereid 1 M voorraadoplossing van 3-aminotriazool (3-AT, MW = 84,08) door het oplossen van 0,84 g 3-AT in 10 ml DDH 2 O. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C tot 6 maanden.
    2. Bereid 1 mM werkoplossing van 3-AT door toevoeging van 50 ui 1 M voorraadoplossing met 50 ml voorgekoeld zeewater. Bewaar de oplossing op ijs.
    3. Bereid mond pipet (figuur 3) voor een zachte behandeling van de eieren:
      1. Pipet wordt handmatig getrokken uit glas micropipetten (100 x OD 1.09 mm). Houd de micropipet met beide handen boven het open vuur. Aangezien het glas begint te smelten, zorgvuldig de uiteinden van de pipet trekken in tegengestelde richtingen.
      2. Sluit de ene trok pipet een plastic buis (ID 1,14 mm), verzegelen strak met Parafilm. De lengte van de buis moet ongeveer 50-70 cm.
      3. Plaats een steriel gefiltreerd P20 of P200 tip aan het einde van de buis tegenover de glazen buis teworden gebruikt als het mondstuk.
      4. Klem het uiteinde van de glazen micropipet met een schaar om de diameter van de tip passen. De optimale diameter enigszins groter dan de diameter van het ei (80 urn).
    4. Giet 4 ml van 1 mM 3-AT zeewater in elke PS-gecoate schaal (bodem of deksel).
    5. Neem de mond pipet, zet de P20/P200 tip in de mond en zet hem vast met de tanden. Om eieren te zuigen, eerst zuigen een kleine hoeveelheid zeewater. Door het hebben van een kolom van de vloeistof alvorens het laden van de eieren, zal een maximale controle over de mond pipetteertechniek hebben.
    6. Plaats de micropipet tip in de buurt van de eieren en Zuig voorzichtig in verscheidene honderden eieren in de pipet. Beperk de eieren in het glas micropipet.
    7. Rij dejellied eieren in een rechte lijn op een schotel door hen waait zachtjes uit de mond pipet terwijl u de tip in een rechte lijn. Rij de eieren vlak voor de injectie, omdat bevruchting problemen kunnen optreden als gevolg van prolonged blootstelling aan 3-AT zeewater 3. Bovendien kunnen kationische hechtmiddelen zoals PS giftig eieren, en is het niet raadzaam om embryo bloot deze reagentia langdurig, vooral als de bevruchting enveloppen zijn verwijderd.
    8. Maak een kras op de schotel in de buurt van de lijn van geroeid eieren met behulp van een glazen pipet. Deze scratch zal belangrijk zijn om de injectienaald te breken om de stroom van de oplossing aan te passen als dat nodig is. Als alternatief kan de kras worden gemaakt voor het storten 3-AT zeewater aan het gerecht.

    4. Micro-injectie van de Sea Urchin Zygotes

    1. Zet micro-injectie station. Hier beschrijven we het gebruik van FemtoJet injectiesysteem.
    2. Trek injectie haarvaten behulp van een naald trekker. Een voorbeeld van een goede naald is afgebeeld in figuur 4. Opmerking: Voor RNA-injecties, moet de injectie haarvaten worden voorbehandeld om RNAase besmetting 31 te voorkomen:
      1. Plaats injectie haarvaten in 50 ml conischebuizen en voeg 50 ml gefiltreerde methanol / HCl (9:1). Schud goed en laat het een nacht om niet langer dan 10 uur.
      2. Giet het methanol / HCl en spoel de haarvaten 2x met gefilterd methanol in dezelfde buis.
      3. Tap methanol zoveel mogelijk lyofiliseren de haarvaten nachts tot volledige verwijdering van methanol garanderen.
    3. Monteer voorzichtig de naald capillair op een naald laad-houder en laad het met <0,5 ul van een monster oplossing met microloader tips. Monsteroplossingen bevatten gewoonlijk 20% glycerol, afhankelijk van het geïnjecteerde materiaal 3.
    4. Zet de schaal met roeide eieren op de microscoop podium (eieren moeten verticaal worden uitgelijnd wanneer bekeken door ooglenzen) en focus op de eieren.
    5. Monteer voorzichtig de geladen naald op de naald microinjecting houder en pas de positie van de naald om een ​​haarscherpe tip hebben in het midden van het veld.
    6. Druk op de knop om de maximale druk fo toepassingr naald schoonmaken. Oplossing moet uit de naald komen. Stel de druk indien nodig: injectiedruk moet in het bereik van 90-360 hPa, de compensatie druk bij ongeveer 1/3 van de injectiedruk.
    7. Pas de oplossing stroom door het injecteren in onbevruchte eicel. Met een joystick micromanipulator, richt de punt van de injectienaald aan de onbevruchte eicel. Om naald binnenkomen, het creëren van een lichte beving door zachtjes te tikken van het podium met een hard voorwerp, zoals een schroevendraaier. Een injectie bolus die in het ei moet worden gezien (figuur 5).
    8. Als de injectie bolus niet zichtbaar is, lichtjes verhogen de punt van de naald boven de eieren, zoek de kras op de schotel en stel deze in het midden van het veld worden geplaatst. Tik voorzichtig de naald om de kras aan de punt van de injectienaald breken. Pas de injectie en compensatie druk dat de bolus injectie niet meer dan 1/5 tHij diameter van het ei (1-2 uur).
    9. Zodra de injectie bolus is gekalibreerd, bevruchten de eieren door het toevoegen van verdund sperma (1:1000) of 1-2 ul van sperma. Meng goed zorgvuldig om te voorkomen dat loskomen van de rij van eieren.
    10. Start injecties direct na de bevruchting envelop zichtbaar (figuur 5) wordt. Bewegen langs de lijn van roeiden eieren met behulp van het podium controller en injecteren zoveel zygoten mogelijk door prikken ze met de naald gecontroleerd door joystick micromanipulator.
    11. Na 10-15 minuten, zal de bevruchte eitjes gehard worden en kan niet langer worden geïnjecteerd. Haal de schotel uit het podium en zorgvuldig aspireren uit sperma in 3-AT zeewater met behulp van een plastic Pasteur pipet.
    12. Laat de zygotes droog. Voeg snel vers voorgekoeld zeewater om de schotel te dekken. Incubeer de embryo's bij 15 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GFP en mCherry reporter constructen werden in vitro getranscribeerd en micro-injectie in de bevruchte eieren. Embryo's werden geïncubeerd bij 15 ° C gedurende 24 uur (tot het blastula stadium) en afgebeeld met Zeiss Observer Z1 microscoop. Injectie van reporter constructen leidde niet tot enige defecten in de ontwikkeling (Figuur 6). Voor de kwantificering van fluorescerende signalen, werd beeldaanwinst uitgevoerd bij een lage vergroting (100X) maximaal te vangen fluorescerende pixels (figuren 6D-F). Fluorescerende signalen werden gekwantificeerd met behulp AxioVision 4.8.2.0. De standaardfouten voor de intensiteit van fluorescente signalen in de populatie van 100-200 blastulae niet meer dan 1,5% (gegevens niet getoond).

Figuur 1
Figuur 1. De micro-injectie setup. (A) A-PS gecoate dish met geïmmobiliseerde eieren ligt aan de fase van (B) een omgekeerde microscoop. Micro-injectie naald (C) een naaldhouder die is verbonden met een (D) drukeenheid bevestigd. Beweging in de x-, y-en z-afmeting is gericht met behulp van (E) de micromanipulator of (F) het grove manipulator. (G) Een schroevendraaier omwikkeld met keukenpapier wordt gebruikt om zachtjes tik op de microscoop podium te bevend ertoe te naald binnenkomst in de pas bevruchte eicel te vergemakkelijken.

Figuur 2
Figuur 2. Paai van de zee-egels. (A) Zee-egel wordt geïnduceerd te werpen door intracoelomic injectie van 0,5% KCl. De naald van de peristomial membraan rond de mond van het dier, het enige zachte deel van het dier.(B) Vrouw zee-egel is geplaatst met zijn gonapores ondergedompeld in het zeewater in een plastic beker om gele eieren te verzamelen. (C) White sperma vrijkomt uit gonapores van de mannelijke zee-egel.

Figuur 3
Figuur 3. . Mondpipet Een mond pipet bestaat uit drie delen: (A) het glas micropipet naald, (B) plastic buizen, en (C) een steriel gefiltreerd P20 of P200 tip. De glazen micropipet wordt ingebracht in de kunststof slang die verbonden is met de P20 en P200 mondstuk.

Figuur 4
Figuur 4. Micro-injectie naald. (A) De micro-injectie naald is pulgeleid via een naald trekker met een specifieke instelling. De instelling van de naald trekker moet empirisch worden bepaald. Met behulp van een Narishege PC-10 naald trekker, maken we gebruik van 72,8 ° C voor warmte-instelling 1 en 83,7 ° C voor warmte instelling 2. Met behulp van de kras op de plaat breken we de punt van de naald om de oplossing doorstroming te vergemakkelijken. (B) Het goede naald moet een lengte van 500-600 urn van een breedte van 50 urn op de schouder tot 5 urn aan het uiteinde.

Figuur 5
Figuur 5. Injectie van de nieuw bevruchte zee-egel eitjes. Dejellied eieren werden geroeid op een PS-gecoate schaal en bevrucht. Pas bevruchte eieren werden geïnjecteerd een voor een tijdens het verplaatsen de microscooptafel langs de lijn van zygoten (van boven naar beneden). (A) Injectie bolus duidelijk zichtbaar te vormen binnen de bevruchteei op de punt van de naald. (B) bevruchting transparante omhulling gevormd na bevruchting. (C) sperma als kleine zwarte stippen op de achtergrond. Schaal bar is 50 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 6
Figuur 6. Micro-injectie zygoten ontwikkeld tot blastulae zonder ontwikkeling of morfologische gebreken. Pas bevruchte eieren werden geïnjecteerd met fluorescente merkers die hen duidelijk te onderscheiden van de niet-geïnjecteerde embryo's (aangegeven door pijlen). (AC) Embryo afgebeeld bij 400X vergroting. (DF) Embryo's worden afgebeeld bij 100X vergroting meeste van de uitgezonden fluorescentie signalen vast te leggen voor een betrouwbare kwantificatie. Na 24 uur post bevruchting, blastulae werden verzameld en behandeld met 2x zeewater gedurende 2 minuten naar het zwembad embryo 3, gevolgd door 1x zeewater wassen immobiliseren. Beelden werden verkregen met Zeiss Observer Z1 microscoop en Axiocam monochrome camera. (A, D) DIC beelden van de blastulae. (B, E) Overlay afbeeldingen van embryo geïnjecteerd met in vitro getranscribeerd mCherry in fluorescentie en DIC kanalen. (C, F) Overlay afbeeldingen van embryo geïnjecteerd met in vitro getranscribeerd GFP in fluorescentie en DIC kanalen. Schaal bar is 50 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microinjectie is een krachtige techniek voor het leveren van verschillende behandelingen zoals DNA, mRNA, recombinante eiwitten, functieverlies en overexpressie-reagentia, kleurstoffen en combinaties in eieren, embryo's en cellen van verschillende organismen 1-7. Er moet echter een aantal overwegingen in gedachten worden gehouden bij het ontwerpen van een micro-injectie experiment.

Het is uiterst belangrijk om de oplosbaarheid van de geleverde behandeling en het injectievolume overwegen. Als de micro-injectie oplossing neigt zelfs een lichte neerslag vormen, zou microinjecting naald verstopt. Over het algemeen is het raadzaam om de oplossing voor meer dan 15 min centrifugeren voordat u het in de naald om te controleren of een neerslag wordt verwijderd uit de oplossing 3. De andere benadering is om de oplossing door het Millipore spinkolommen. Als het niet mogelijk is om verstopping te voorkomen, kan het mogelijk zijn om de naald door voorzichtig opnieuw breken van de tip te ontstoppenmaar wordt het moeilijk om de stroom van de oplossing controleren of de punt te breed. De grote hoeveelheid van de geïnjecteerde oplossing kan toxisch zijn voor de embryo en bovendien de brede punt brengt grotere verschillen tussen de hoeveelheden ingespoten in afzonderlijke embryo. Het is ook belangrijk dat de hoeveelheid geïnjecteerde volume in de bevruchte eitjes aangepast. Het geïnjecteerde volume kan worden gekalibreerd door aan de naalden bij verschillende instellingen gevolgd door injecteren van de oplossing in olie. Hierdoor kan de diameter (en dus volume) van de druppel 32. We vinden dat een aanvaardbare hoeveelheid injectievloeistof in de bevruchte eicel niet meer dan 1/5 van de diameter zygote zoals getoond in figuur 5.

Het belangrijkste advies is om de naald te laden vlak voor de injectie, snel werken, en vaak gebruik maken van de schoonmaak-knop functie van de injector die de toepassing van het maximaal beschikbare druk triggers om de uitlaat inOm te spoelen de geblokkeerde injectienaald.

Soms kan de naald verstoppen van buitenaf wanneer het sperma en puin van de geïnjecteerde eieren zich aan de punt van de naald. In dat geval is het nuttig om de naald omhoog helemaal uit de 3-AT water in de schaal te injecteren. Meestal de spanning veroorzaakt door de vloeistof-luchtinterface is voldoende om het vuil te verwijderen. Als alternatief voorzichtig borstelen de injectienaald tegen de kras op de injectie plaat kan ook helpen. In extreme gevallen is het mogelijk de punt van de naald met de druipende natte Kimwipe vegen. Echter, zoals het afvegen vergt uiterste voorzichtigheid en praktijk.

Fluorescerende kleurstoffen zoals 10.000 MW Texas Red lysine geladen dextran (2 mg / ml) een sterk signaal dat kan worden gedetecteerd en gebruikt voor een betrouwbare normalisatie van de geïnjecteerde oplossing. Wanneer mRNA geïnjecteerd moet worden, wordt aanbevolen om coinject met mCherry of GFP mRNA samen met het mRNA van inlangstelling om ervoor te zorgen dat er geen mRNA degradatie plaatsvond. Dan visualisatie van het fluorescentiesignaal afhankelijk is van de vertaling van mCherry of GFP. Als het gebruik van kleurstoffen of TL constructies niet mogelijk is, is het raadzaam om een ​​kleine hoeveelheid van de eieren op elk individu gerecht rij om ervoor te zorgen dat alle nieuw bevruchte eieren op die schaal worden geïnjecteerd.

Tot slot, micro-injectie is een waardevol instrument voor onderzoek in de genetica, moleculaire, cellulaire en ontwikkelingsbiologie. Met deze techniek, is de zee-egel gemeenschap belangrijke bijdrage aan ons begrip van de cel-en ontwikkelingsbiologie zoals mobiele lot specificatie, gen-functie, genregulatie en biochemische pathways onderliggende embryonale ontwikkeling 16 gemaakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgements

Wij danken Santiago Suarez voor kritische lezing van het manuscript en Betty Cowgill voor de steun in de fotografie. We danken ook de anonieme reviewers voor hun kritische feedback. Dit werk wordt ondersteund door het Fonds voor onderzoek Universiteit van Delaware.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  2. Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
  3. Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
  4. Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
  5. Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
  6. Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
  7. Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
  8. O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
  9. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. (2011).
  10. Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
  11. Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
  12. Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
  13. Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
  14. Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
  15. Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
  16. McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
  17. Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
  19. Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
  20. Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
  21. Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
  22. Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
  23. Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
  24. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
  25. Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
  26. Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
  27. Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
  28. Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
  29. Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
  30. Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
  31. Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics