Høy gjennomstrømning Microinjections av Sea Urchin zygoter

1Department of Biological Sciences, University of Delaware
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Mikroinjeksjon er en vanlig teknikk som brukes til å levere DNA-konstruksjoner, mRNAs, morfolino antisens-oligonukleotider eller andre behandlinger inn i egg, embryoer og celler av forskjellige arter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroinjeksjon inn i celler og embryoer er en vanlig teknikk som benyttes for å studere et bredt spekter av biologiske prosesser. I denne fremgangsmåten en liten mengde av behandlingsoppløsningen er lagt inn i en mikroinjeksjon nål som brukes for fysisk å injisere individuelle immobiliserte celler eller embryoer. Til tross for behovet for innledende opplæring for å utføre denne fremgangsmåten for high-throughput levering, mikroinjeksjon gir maksimal effektivitet og reproduserbar avgivelse av en lang rekke behandlingsløsninger (inkludert komplekse blandinger av prøvene) inn i celler, egg eller embryoer. Søknader til microinjections inkluderer levering av DNA-konstruksjoner, mRNA, rekombinante proteiner, gevinst på funksjon, og tap av funksjon reagenser. Fluorescent-eller kolorimetriske fargestoff tilsettes til den injiserte løsningen til å muliggjøre direkte visualisering av effektiv levering, samt et verktøy for pålitelig å normalisere mengden av avgitt løsning. Den beskrevne metoden gjør mikroinjeksjon av 100-400 kråkebolle zygotes innenfor 10-15 min.

Introduction

Effektiv og reproduserbar behandling levering er en av de viktigste metodiske utfordringer for forskerne. Flere metoder har blitt etablert for å forbigående leverer renseløsninger inn i egg, embryo, og cellene. Disse metodene inkluderer elektroporering (basert på et genererer transiente porene i membranen ved hjelp av korte elektriske pulser) 1,2, lipofection (levering via fusjon av behandlings-holdige liposomer med membranen) 1, mikropartikkel bombardement 1 (DNA utfelles på micron -store metallpartikler som deretter brukes til å trenge inn i cellene ved høy hastighet), og transduksjon (virus benyttes som et leveringsmiddelet av transgener). For øyeblikket er mikroinjeksjon den eneste metode som har fordelen av å levere en hvilken som helst løsning med 100% effektivitet med minimale reagenser. Videre kan en enkelt injeksjon løsning være sammensatt av en kompleks blanding av behandlinger. Denne teknikken er blitt brukt til å vellykketly microinject egg og embryoer fra en rekke arter som kråkeboller 3,4, sebrafisk 5, mus 6, frosk 7, og storfe 8 samt enkeltceller i vevet kultur ni. Enkelt blastomeres injeksjoner med senere utviklingsstadier er også gjennomført 10-12.

De nåværende fremgangsmåter for microinjections er basert på trykk-injeksjonsfremgangsmåten som først ble beskrevet av Hiramoto 10, men har store fremskritt blitt gjort til optimalisering av prosessen. Utmerket mikroinjeksjon teknikker har blitt beskrevet andre steder 11, og her beskriver vi en av de spesifikke metoder som i dag benyttes til microinject kråkebolle (Strongylocentrotus purpuratus) nylig befruktede egg. I over et århundre, har kråkeboller vært en verdifull eksperimentell modell 15,16. Kråkeboller er evolusjonært nært knyttet til chordatar (inkludert oss) og analyse avderes genom avslørte at de inneholder alle de store gen familier som human 17. De produserer et stort antall synkront utvikle gjennomsiktig embryo som lett kan manipuleres. Ved hjelp av kråkebolle som modellorganisme, har kråkebollen samfunnet bidratt til vår forståelse av befruktning prosessen 18-21, cellebiologiske prosesser 22-24, og genet regulatoriske nettverk (GRNs) 25-28.

Mikroinjeksjon i kråkebolle zygotes krever flere trinn. Først eggene må være immobilisert før injeksjoner (beskrevet nedenfor). Mikroinjeksjon retter er belagt med protaminsulfat (PS), noe som skaper et positivt ladet overflate som de negativt ladede egg kan feste seg tre. Eggene dejellied ved inkubasjon i sur sjøvann (pH 5,15) i 10 min, etterfulgt av to vaskinger i naturlig sjøvann eller kunstig vann sjøen (pH 8,0). De dejellied eggene er nøye rodde i en rett linjei midten av PS belagt skål i nærvær av 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), som er nødvendig for å inhibere aktiviteten av ovoperoxidase som utskilles fra kortikale granulater av egget som følge av befruktning 29. Dette trinnet er viktig for å hindre herding av befruktning konvolutt og legge til rette for mikroinjeksjon nål oppføring. Som et alternativ til 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syre (PABA) benyttes. Injeksjonsoppløsningen blir lagt inn i en mikroinjeksjon nål ved hjelp av spesialiserte microloading pipettespissen og montert på en holder festet til mikromanipulator og trykkenheten (fig. 1). Hver nål kan brukes til å microinject individuelle zygoter i flere eksperimenter på forskjellige dager. Mikroinjeksjon kan utføres i 10-15 min til de zygotes stivne. De zygoter ble deretter vasket med saltvann og kultivert ved 15 ° C. Når embryoene nå klekking blastula scenen, slipper de klekking enzym som fordøyer deler av fertilization konvolutt 30 og tillate dem å naturlig løsne fra PS-belagt parabolen. Om nødvendig, kan embryoene bli forsiktig løsnet fra formen ved hjelp av et munn pipette eller Pasteur pipette ved forsiktig å blåse sjøvann mot embryoene. Den beskrevne metoden muliggjør effektiv og pålitelig mikroinjeksjon av 100-400 nylig befruktede egg på en enkelt rett, og gir en høy gjennomstrømming metode for nedstrøms analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av protaminsulfat (PS) Belagt Retter

  1. Forbered 1% oppløsning av protamin-sulfat (PS) ved tilsetning av 0,5 g PS til 50 ml deionisert, destillert vann (DDH 2 O) i et 50 ml konisk rør. Ryst godt ved høy hastighet på en benk-risteapparat ved romtemperatur i 1-2 timer for å sikre fullstendig oppløsning av PS. Denne løsningen kan lagres ved 4 ° C i minst 3 måneder (sørge for å oppløses fullstendig gel-lignende bunnfall før hver bruk) 3.
  2. Ta en hylse på 60 mm x 15 mm polystyren petriskåler og legge ut både lokk og bunner på benken.
  3. Hell 1% PS løsning i hver tallerken (både bunn og lokk kan benyttes) akkurat nok til å dekke overflaten, la minst 2 min. Den tiloversblevne PS-løsning kan brukes om igjen mange ganger i løpet av 3 måneder når de lagres ved 4 ° C.
  4. Place PS-behandlede retter i et beger fylt med destillert vann (dH 2 O). La begerglasset under rennende dH 2 O i minst10 min.
  5. PS-belagt retter kan brukes umiddelbart eller lufttørke for lagring. Dekk dem til å forebygge oppsamling av støv. De kan lagres ved romtemperatur i 1 måned 3.

2. Skaff Sea Urchin kjønnsceller og Immobilize eggene på en PS-belagt Dish for Mikroinjeksjon

  1. Gyte kråkeboller ved risting eller intracoelomic injeksjon av opptil 1 ml 0,5% KCl å indusere sammentrekning av glatt muskulatur til å løsne kjønnsceller 3 (figur 2).
  2. Hvis dyret er en hann, som indikert av den hvite farge spermie, samle spermier tørr fra overflaten av et dyr inn i et 1,5 ml rør. Tørr sædceller kan lagres ved 4 ° C i en uke uten betydelig tap av biologisk funksjon.
  3. Hvis dyret er en kvinne, som angitt av den gule farge på grunn av eggeplommen innhold, samle sine kjønnsceller ved å dyppe de gonopores i et beger er full av sjøvann. Eggene vil bli løslatt fra gonopores og slå seg ned av tyngdekraften. </ Li>
  4. Filter eggene fra avfall som dyre pigger som bruker 80 mikrometer Nylon filterduk. De beste resultatene oppnås hvis eggene brukes innen 5-7 timer etter gyting.
  5. Dejelly eggene:
    1. Forbered 100 ml surt sjøvann for ca 1 ml av egg. Bruk 0,5 M sitronsyre for å justere pH i sjøvann fra pH 8,0 til 5,1 til 5,2. For lav for en pH vil redusere gjødsling og for høy for en pH vil ikke tillate egg å feste til PS belagte plater.
    2. Legg egg (ikke mer enn 1 ml) til sur sjøvann og la eggene til å slå seg ned på is i 10 min. Alternativt kan fjerning av gel coat lettes ved forsiktig virvling av eggene under behandlingen. Man kan effektivt dejelly S. purpuratus egg i 3-4 min på denne måten.
    3. Hell forsiktig av surt hav vann, tilsett friskt sjøvann og la eggene slå seg ned på isen igjen. Dejellied egg kan lagres på is i inntil 6 timer uten befruktning problemer

    Tre. Ro Eggs

    1. Tilbered en M stamløsning av 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84,08) ved å løse opp 0,84 g av 3-AT i 10 ml DDH 2 O. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° C i opp til seks måneder.
    2. Forbered 1 mM arbeidsløsning av 3-AT ved å tilsette 50 ul av 1M stamløsning i 50 ml prechilled sjøvann. Hold oppløsningen på is.
    3. Forbered munnen pipette (figur 3) for skånsom håndtering av egg:
      1. Pipettespissen manuelt trukket fra glass mikropipettene (100 x OD 1,09 mm). Hold mikropipette med begge hender over åpen flamme. Som glasset begynner å smelte, trekk forsiktig i endene av pipetten i motsatte retninger.
      2. Koble den ene trakk pipette til et plastrør (ID 1,14 mm), forsegle tett med Parafilm. Lengden av røret bør være omtrent 50 til 70 cm.
      3. Sett i en sterilfiltrert P20 eller P200 spiss på enden av røret motsatt til glassrør ibrukes som munnstykket.
      4. Utklipp enden av glass mikropipette med saks for å justere diameteren på dysen. Den optimale diameter overskrider svakt diameteren av egget (80 mikrometer).
    4. Hell 4 ml av en mM 3-AT sjøvann inn i hvert PS-belagt fatet (bunn eller lokk).
    5. Ta munnen pipette, satte P20/P200 tips i munnen og fest den med tennene. For å suge egg, først suge en liten mengde sjøvann. Ved å ha en søyle av væsken før lasting av eggene, vil man ha maksimal kontroll over munningen pipetteringsteknikk.
    6. Plasser mikropipette spissen nær egg og forsiktig aspirer i flere hundre egg i pipetten. Begrense eggene i glasset micropipette.
    7. Row dejellied egg i en rett linje på en tallerken ved å forsiktig blåse dem ut av munnen pipetten mens du beveger spissen i en rett linje. Rad eggene rett før injeksjoner, fordi befruktning problemer kan oppstå på grunn av prolonged eksponering for 3-AT sjøvann tre. Videre kan kationiske lim som PS være giftig for egg, og det er ikke tilrådelig å utsette embryoer til disse reagenser for lange perioder, spesielt hvis de befruktning konvolutter har blitt fjernet.
    8. Lag en ripe på tallerken nær linjen av rodd egg ved hjelp av et glass pipette. Denne bunnen vil være viktig for å bryte av injeksjonsnålen til å justere strømmen av løsningen som er nødvendig. Alternativt kan ripe gjøres før strømme 3-AT sjøvann til parabolen.

    4. Mikroinjeksjon av kråkebollen zygoter

    1. Slå på mikroinjeksjon stasjonen. Her beskriver vi bruk av FemtoJet innsprøytning.
    2. Trekk injeksjonskapillærer ved hjelp av en nål avtrekker. Et eksempel på en god nål er vist i figur 4.. Merk: For RNA injeksjoner, bør injeksjonskapillærer forbehandles for å unngå RNAase forurensning 31:
      1. Plasser injeksjon kapillærer i 50 ml koniskrør og tilsett 50 ml av filtrert metanol / HCl (9:1). Rist godt og la over natten for ikke lenger enn 10 timer.
      2. Hell av metanol / HCl og skyll kapillarene 2x med filtrert metanol i samme rør.
      3. Avløps metanol så mye som mulig, og Lyofiliser kapillarene over natten for å sikre fullstendig fjernelse av metanol.
    3. Montere nøye nålen kapillær på en nål lasteholder og laste den med <0,5 mL av en prøveløsningen ved hjelp microloader tips. Sample-løsninger vanligvis inneholde 20% glycerol, avhengig av det injiserte materiale som tre.
    4. Sett fatet med rodd egg på mikroskopet scenen (egg bør være på linje vertikalt sett gjennom okularene) og fokus på eggene.
    5. Montere forsiktig lagt i nålen på nål microinjecting holderen og justerer posisjonen av nålen for å ha en perfekt fokusert spiss i midten av feltet.
    6. Trykk inn knappen for å bruke maksimalt trykk for nål rengjøring. Løsningen bør komme ut av nålen. Juster trykket om nødvendig: injeksjonstrykk bør være i området fra 90 til 360 hPa, med kompensasjonstrykket på omtrent 1/3 av injeksjonstrykket.
    7. Juster væskemengden ved å injisere i ubefruktet egg. Ved hjelp av en joystick micromanipulator, dirigere spissen av kanylen til ubefruktet egg. For å lette nål oppføring, oppretter en svak skjelving ved forsiktig tapping av scenen med en hard gjenstand, for eksempel en skrutrekker. En injeksjons bolus danner inne i egget skulle bli sett (figur 5).
    8. Hvis injeksjonen bolus ikke er synlig, litt heve spissen av nålen over eggene, finner ripe på fatet og justere den til å være plassert i midten av feltet. Slå forsiktig på nålespissen til scratch mark å bryte spissen av kanylen. Juster injeksjons-og kompensasjonstrykk for å sikre at injeksjons bolus ikke overskrider 1/5 av tHan diameter av egget (1-2 pm).
    9. Når injeksjons bolus er kalibrert, befrukte eggene ved å legge utvannet sperm (1:1.000) eller 1-2 mL av sperm. Bland godt nøye for å hindre dislodging raden av egg.
    10. Begynn injeksjoner umiddelbart etter befruktning konvolutten blir synlig (figur 5). Beveg langs linjen rodde egg ved hjelp av fasen kontrolleren og injisere så mange zygoter som mulig ved å stikke dem med nålen styres av styrespaken mikromanipulator.
    11. Etter 10-15 min, blir de nylig befruktede egg blitt herdet, og kan ikke bli injisert lenger. Fjern fatet fra scenen og nøye aspirer ut sperm i 3-AT sjøvann med en plast Pasteur pipette.
    12. Ikke la zygotes tørr. Raskt legge friske prechilled sjøvann for å dekke fatet. Inkuber embryoene ved 15 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GFP og mCherry reporter konstruerer var in vitro transkribert og microinjected inn de nylig befruktede egg. Embryoer ble inkubert ved 15 ° C i 24 timer (inntil blastula stadium) og avbildes ved bruk av Zeiss Observer Z1 mikroskop. Injeksjon av reporter konstruerer førte ikke til noen utviklingsmessige defekter (figur 6). For kvantifisering av fluorescerende signaler, ble bildet oppkjøpet utført ved lav forstørrelse (100X) til maksimalt fange fluorescerende piksler (Tall 6D-F). Fluorescerende signalene ble kvantifisert ved hjelp AxioVision 4.8.2.0. Standardfeilene for intensiteten av fluorescerende signaler innen populasjonen av 100-200 blastulae ikke overstige 1,5% (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1. Den mikroinjeksjon oppsett. (A) En PS-belagt dish med immobiliserte egg befinner seg på stadiet av (B) et invertert mikroskop. Mikroinjeksjon nålen er festet til (C) en nål holder som er forbundet med en (D) trykkenhet. Bevegelse i x-, y-og z-dimensjoner er rettet med anvendelse av (E) den mikromanipulator eller (F) det grove manipulator. (G) En skrutrekker pakket med tørkepapir brukes til å banke forsiktig på mikroskop scenen for å indusere svak skjelving å lette nål inntreden i den nylig befruktet egg.

Fig. 2
Figur 2. Gyting av kråkeboller. (A) Sea Urchin blir overtalt til å kaste av intracoelomic injeksjon av 0,5% KCl. Nålen peker mot den peristomial membran som omgir munningen av dyret, det eneste myk del av dyret.(B) Kvinne kråkeboller er plassert med sine gonapores nedsenket i sjøvann i en plastbegerglass for å samle gule egg. (C) Hvit sperm er løslatt fra gonapores av den mannlige kråkebolle.

Figur 3
Figur 3. . Munn pipette En munn pipette består av tre deler: (A) Glass micropipette nål, (B) plastrør, og (c) en steril filtrert P20 eller P200 tips. Glasset mikropipette er satt inn i plastrøret som er forbundet med P20 eller P200 munnstykket.

Figur 4
Figur 4. Mikroinjeksjon nål. (A) Den mikroinjeksjon nålen er pulledet ved hjelp av en nål avtrekker med en bestemt innstilling. Innstillingen av nålen avtrekker må bestemmes empirisk. Ved hjelp av en Narishege PC-10 nål avtrekker, bruker vi 72,8 ° C for varme innstilling 1 og 83,7 ° C i varmeinnstilling to. Bruke ripe på plate vi bryte tuppen av nålen for å lette løsningen flyt. (B) Den gode nål bør ha en lengde på 500 til 600 mikrometer fra en bredde på 50 mikron på skulderen til 5 mikrometer på spissen.

Figur 5
Figur 5. Injeksjon av de nylig befruktede kråkebolle egg. Dejellied egg ble rodd på en PS-belagt fatet og gjødslet. Nylig befruktede egg ble injisert en etter en mens du beveger mikroskopet scenen langs linjen av zygotes (fra topp til bunn). (A) Injeksjon bolus er klart sett som skal danne innsiden av nylig fertilisedegg på spissen av nålen. (B) Transparent befruktning konvolutt dannes etter befruktning. (C) Sperm vises som små svarte prikker i bakgrunnen. Scale bar er 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Figur 6
Figur 6. Microinjected zygotes utviklet seg til blastulae uten utviklings-eller morfologiske defekter. Nylig befruktede egg ble injisert med fluorescerende markører som tillater dem å være tydelig skilles fra uninjected embryoer (vist med piler). (AC) Embryoet fotografert på 400X forstørrelse. (DF) Embryoet er avbildes på 100X forstørrelse til å fange opp de fleste av de som slippes ut fluorescens signaler for pålitelig kvantifisering. Etter 24 timers post befruktning, blastulae ble samlet inn og behandlet med 2x sjøvann for 2 min å immobilisere svømme embryoer tre, etterfulgt av 1x sjøvann vask. Bildene ble kjøpt med Zeiss Observer Z1 mikroskop og AxioCam monochromic kamera. (A, D) DIC bilder av blastulae. (B, E) Overlay bilder av embryoer injisert med in vitro transkribert mCherry i fluorescens og DIC kanaler. (C, F) Overlay bilder av embryoer injisert med in vitro transkribert GFP i fluorescens og DIC kanaler. Scale bar er 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjeksjon er en kraftfull teknikk for å levere ulike behandlinger som DNA, mRNA, rekombinante proteiner, tap av funksjon og forsterkning av funksjons reagenser, fargestoffer og deres kombinasjoner i egg, embryoer og celler av forskjellige organismer 1-7. Imidlertid bør flere hensyn tas i betraktning når man designer en mikroinjeksjon eksperiment.

Det er kritisk viktig å ta hensyn til løseligheten av den leverte behandling og injeksjonsvolumet. Dersom microinjected oppløsningen har en tendens til å danne bunnfall med en liten, ville microinjecting nålen bli tilstoppet. Generelt anbefales det å sentrifuger løsningen for mer enn 15 min før du legger inn nålen for å sørge for at eventuelle Fallet fjernes fra løsningen tre. Den andre metode er å sende oppløsningen gjennom Millipore spinnkolonner. Hvis det ikke er mulig å unngå tilstopping, kan det være mulig å rense nålen ved forsiktig å bryte spissen igjenmen det blir vanskelig å kontrollere strømningen av oppløsningen dersom spissen er for bredt. Den store mengden av den injiserte løsning kan være giftig for embryoet, dessuten innfører den brede tuppen større variasjoner mellom volumene av løsning som injiseres i de enkelte embryoer. Det er også viktig at mengden av injisert volum i de nylig befruktede egg er justert. Det injiserte volum kan kalibreres ved å trekke nålene til forskjellige innstillinger, etterfulgt av injisering av oppløsningen inn i oljen. Dette gjør det mulig for måling av diameteren (og dermed volumet) av dråpe 32.. Vi finner at en akseptabel mengde av injeksjonsløsningen i den nylig befruktede egget ikke bør overstige 1/5 diameter av zygoten, som vist i figur 5..

Det viktigste rådet er å laste nålen rett før injeksjon, for å arbeide raskt, og å ofte bruke renseknappen funksjon av injektoren som utløser bruk av maksimalt tilgjengelig press til utløpet iFor å skylle ut blokkert kanyle.

Noen ganger kan nålen tetter fra utsiden, når sæden og rusk fra de tidligere injiserte egg holde seg til spissen av nålen. I så fall er det nyttig å heve nålen hele veien opp fra 3-AT vann i sprøyte fatet. Vanligvis spenning forårsaket av væske-luft-grenseflaten er tilstrekkelig til å fjerne rester. Alternativt kan forsiktig børsting kanylen mot ripe på injeksjon plate hjelpe også. I det ekstreme tilfellet, er det mulig å tørke tuppen av nålen med den dryppende våt Kimwipe. Men slik tørke krever ekstrem forsiktighet og praksis.

Fluorescerende fargestoffer som for eksempel 10 000 MW Texas Red lysin ladet Dekstran (2 mg / ml) produsere et sterkt signal som kan påvises og benyttes for pålitelig normalisering av den injiserte oppløsningen. Når mRNA skal injiseres, er det anbefalt å coinject med mCherry eller GFP mRNAs sammen med mRNA av ininteresse å sikre at ingen mRNA degradering fant sted. I dette tilfelle visualisering av det fluorescerende signalet er avhengig av oversettelsen av mCherry eller GFP. Hvis bruken av fargestoffer eller fluorescerende konstruerer ikke er mulig, anbefales det å ro en liten mengde egg på hver enkelt tallerken for å sørge for at alle de nylig befruktede egg på at parabolen er injisert.

I konklusjonen, er mikroinjeksjon et verdifullt verktøy for forskning i genetikk, molekylær, mobilnettet, og utviklingsbiologi. Ved hjelp av denne teknikken, har kråkebollen samfunnet gjort betydelige bidrag til vår forståelse av celle-og utviklingsbiologi eksempel celle skjebne spesifikasjon, gen-funksjon, genregulering og biokjemiske mekanismer underliggende embryoutvikling 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgements

Vi takker Santiago Suarez for kritisk lesing av manuskriptet og Betty Cowgill for hjelp i fotografering. Vi takker også de anonyme anmeldere for sin kritiske tilbakemeldinger. Dette arbeidet støttes av Universitetet i Delaware forskningsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  2. Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
  3. Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
  4. Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
  5. Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
  6. Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
  7. Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
  8. O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
  9. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. (2011).
  10. Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
  11. Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
  12. Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
  13. Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
  14. Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
  15. Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
  16. McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
  17. Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
  19. Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
  20. Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
  21. Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
  22. Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
  23. Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
  24. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
  25. Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
  26. Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
  27. Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
  28. Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
  29. Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
  30. Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
  31. Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics