קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה ​​תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.

Introduction

חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב "קשר ציסטאין", שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג"ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות 12-14.

בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה ​​מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide אסתר (MU-NHS)

  1. הוספת dropwise פתרון של 500 מ"ג N-hydroxysuccinimide ו30 מ"ג 4 - פירידין (dimethylamino) ב10 מיליליטר אצטון (PA) עד 1 גרם חומצת 11-mercaptoundecanoic ב40 מיליליטר dichloromethane (PA) בטמפרטורת חדר (RT).
  2. מגניב התגובה ל0 מעלות צלזיוס ולהוסיף N 1.1 גרם dropwise, N '-dicyclohexylcarbodiimide ב10 מיליליטר dichloromethane (תחת אווירת חנקן). שמור את התגובה בטמפרטורה נמוכה במשך שעה 1 ולאחר מכן מערבבים ב RT הלילה.
  3. סנן את המשקע ולייבש אותו תחת לחץ מופחת. לטהר את המוצר על ידי הבזק כרומטוגרפיה עם בנזין נפט ואתיל אצטט (PA) ביחס של 1:1.

2. הכנת שכבות זהב אחידה

  1. coverslips זכוכית נקי עם מגבוני דיוק וsonicate למשך 5 דקות בתמיסה המכילה תערובת 1:1 של אתיל אצטט (הרשות) ומתנול (PA). Rinsמצעי דואר עם מתנול ולהתנגב תחת זרם חנקן.
  2. מניחים את מצעים נקיים במכשיר ציפוי גמגום. לפנות את החדר. הסר את שכבת תחמוצת כרום העליונה מהיעד כרום ידי מקרטעת ל60 שניות. מניחים את הדגימות מתחת לקורת המתכת ומעיילם עם שכבת כרום 10 ננומטר, ואחריו על ידי ציפוי בשכבת זהב 40 ננומטר.

3. קיבוע פני השטח של BMP-2

  1. ממיסים MU-NHS בN, N-dimethlyformamide (DMF) לריכוז סופי של כ 1 מ"מ ודגירת מצעי זהב בפתרון MU-NHS ב RT במשך 4 שעות תחת אווירת חנקן.
  2. משטחי Sonicate בDMF למשך 2 דקות, לשטוף עם DMF וMeOH ולהתנגב תחת זרם חנקן.
  3. הכן פתרון מניות של rhBMP-2 בסטרילית 4 מ"מ HCl בריכוז של 100 מיקרוגרם / מיליליטר (aliquots חנות ב -80 מעלות צלזיוס). לדילולים עובדים (3.5 מיקרוגרם / מיליליטר), לדלל את פתרון המניות ב-PBS / NaCl (PBS המכיל 1 M NaCl) וdjust ל-pH 8.5 מייד לפני השימוש.
  4. דגירה משטחים פונקציונליות MU-NHS בפתרון עובד rhBMP-2 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר supernatant דגירה. משטחי Sonicate ב-PBS / NaCl למשך 2 דקות ולשטוף 3x עם PBS סטרילי / NaCl.

4. אפיון פני השטח

  1. כדי לחסום ספיחה לא ספציפית של נוגדן, דגירה משטחים עם BSA 5% (w / v) בפתרון PBS עבור שעה 1 ב RT, ואחריו דגירה עם נוגדן אנטי BMP-2 (1:100 ב1% (w / v ) פתרון BSA / PBS) במשך שעה 1 ב RT. שטוף משטחים פעמיים עם PBS sonicate במשך 30 שניות.
  2. דגירה מצעים עם נוגדן HRP-מצומדות המשני (1:1,000 ב1% (w / v) פתרון BSA / PBS) במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
  3. השתמש assay האדום Ampliflu כדי למדוד את הפעילות האנזימטית HRP ב 570 ננומטר עם קורא צלחת.

5. ניתוח של פעילות ביולוגית

  1. הזרעים 1 x 10 myoblasts C2C12 5 עכבר לכל טוב ב6 גם plאטס במדיום גידול, בהיקף של DMEM גלוקוז גבוהה המכיל פירובט בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ומדגיר אותן 24 שעות על 37 ° C / 5% CO 2.
  2. להרעיב את התאים בסרום ללא DMEM ל3-5 שעות לפני זריעה על גבי המשטחים מעוצבים עם BMP-2 המשותק.
  3. לחקירה של אינדוקציה איתות לטווח קצר, להחליף את המדיום בסרום ללא DMEM הטרי 200 μl ולמקם את BMP-2 משטחים משותקים מעל התאים. המשטח צריך להיות מטופלים עם פינצטה קצה קנס כדי להימנע מגירוד.
  4. הסר בעדינות משטחים ולשאוב את המדיום עם טפטפת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. המשך לניתוח של תגובות תא.
  5. לניתוח של פעילות ביולוגית ארוך טווח, תאי צלחת על גבי משטחים ותרבותם על 37 ° C / 5% CO 2 בתנאים נמוכים בסרום (2% FBS) במשך שישה ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהתקנה שלנו, זהב נבחר כחומר לא פעיל מאז שהיא מספקת מערכת ביולוגית נוקבת אבל כימי מתכונן. יתר על כן, היישום של monolayers הרכבה העצמית כרוך יתרונות רבים: סאמס לספוג באופן ספונטני באמצעות "ראש הקבוצות" שלהם על מתכות וmonolayers טופס עם כמה פגמים, ואילו ניתן לשנות קצה הקבוצות הפונקציונלית שלהם עוד יותר. כך שהם מספקים פלטפורמה ללהתאים את המאפיינים של הממשק בצורה עדיין ישימה מאוד מבוקרת 20.

לחוסר התנועה של BMP-2 על משטחים מצופים זהב, השתמשנו בגישת שני שלבים: 1) מחייב מקשר MU-NHS לשכבת הזהב, ולאחר מכן 2) מגיב מקשר עם החלבון (ראו איור 1). כדי להוכיח המחייבים של rhBMP-2, השתמשנו immunoassay אנזים. ב assay זה, משטחי הצגה משותק rhBMP-2 הודגרו עם נוגדן BMP-2 ספציפי ושני נוגדנים מצומדות עם HRP. הכריכה של זה האחרון יכולה להיות Determined באמצעות פתרון Ampliflu אדום. בנוכחות מי חמצן, HRP מזרז את ההמרה של Ampliflu האדום חסר צבע (10-אצטיל-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) לresorufin מתחם הניאון. זיהינו משטח המשותק rhBMP-2 (iBMP-2) לפני ואחרי מתקרב תאים חסיד מלמעלה עם משטחים פונקציונליות. אנא שים לב כי לצורך זיהוי של rhBMP עם assay Ampliflu האדום, הדגימות כפופות למספר צעדי דגירה וטיפולים. לכן, זה לא ריאלי כדי לחקור את אותו המשטח לפני ואחרי גירוי תא. איור 2A תערוכות מוצלחת מחייב של rhBMP-2 אל פני השטח בקונפורמציה מוכרת על ידי אנטי BMP-2 IgG. איור 2B מראה iBMP- 2 פני השטח ששימש לעורר תאים ל30 דקות לפני immunoassay HRP. גם לאחר גירוי תא החלבון מזוהה על פני השטח.

תגובות תא למשטחי הצגת RH המשותקBMP-2 הוערכו ובהשוואה להשפעה של מצעי זהב שאינם מטופלים (בקרה שלילית). על מנת למזער את ההשפעה של תהליך ההדבקה על הניתוח של האיתות לטווח הקצר, הגדרה מיוחדת שפותחה לגירוי תא. הנה, תאי C2C12 היו מגורה ל30 דקות על ידי rhBMP-2 משטחים פונקציונליות המתקרבים מלמעלה. שורת התאים והיצמדות למנגנון עכבר C2C12 היא קו pluripotent mesenchymal תא מבשר, אשר נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד את השלב המוקדם של בידול osteogenic במהלך היווצרות עצם ברקמות שרירים. במודל זה, BMP-2 מעכב את ההתמיינות של תאים לmyotubes multinucleated וגורם לאוסטאובלסטים פנוטיפים 21. ההפעלה של סמאד 1/5/8, שהם עיתונאים במורד הזרם של מסלול איתות BMP-2, הוא נותח על ידי מערבי סופג. כפי שניתן לראות באיור 3 א, זירחון הסמאד הוא ציין לאחר גירוי 30 דקות על ידי iBMP-2, בעוד שאף זירחון של סמאד 1/5/8 מתרחשבתאים שנחשפו לדגימות זהב שלא טופלו. תוצאה זו מצביעה על כך שתהליך הקיבוע אינו משנה BMP-2 פעילות לטווח קצר ומפעיל צעדים בשלב מוקדם באיתות הסמאד.

כדי לקבוע אם iBMP-2 משפיע על התמיינות osteogenic לטווח ארוך, רמת הביטוי של phosphatase אלקליין (ALP), סמן osteogenic, נחקר על ידי assay colorimetric. פעילות ALP של תאי C2C12 נמדדה לאחר דוגרים התאים במשך 6 ימים בזהב רגיל (שליטה) וiBMP-2 משטחים. פעילות ALP בlysates של תאים בתרבית על iBMP-2 משטחים תערוכות קליטה גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לביקורת (איור 3 ב). תוצאה זו עולה כי iBMP-2 גורם לביטוי של ALP הסמן osteogenic בתאי C2C12. שורת תא זו ידועה להבדיל על confluency לכת בתנאי בסרום נמוך, ובכך יוצר myotubes ולבטא חלבוני myogenic אופייניים. עם זאת, טיפול עם BMP-2 גורם לשינוי במסלול הבידול מmyoblastic לosteoblastic, ולכן דיכוי היווצרות myotubes. כדי לחקור את ההשפעה של iBMP-2 בmyogenesis, תאי C2C12 היו מצופים באופן ישיר על זהב (שליטה) או משטחים ותרבותיים תחת בידול תנאים (סרום נמוך) פונקציונליות. לאחר 6 ימים, הכתמה של שרשרת שרירן כבדה (MHC) בוצעה. כפי שמוצג באיור 3 ג, תאי C2C12 להיכשל כדי ליצור myotubes החיובי MHC בנוכחות של iBMP-2, אבל לא על מצעי זהב.

איור 1
איור 1. ערכה של תהליך הקיבוע של rhBMP-2 על גבי משטחי זהב. Coverslips הזכוכית מצופות בשכבת זהב ולאחר מכן הודגרו עם מקשר heterobifunctional (MU-NHS) וכתוצאה מכך בשכבה עצמית התאספו פונקציונליות-NHS (SAM). אמינים ראשוניים של BMP-2 מגיבים עם מקשר שמוביל לשיתוףחלבון משותק valently על פני המצע. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. בכריכת פני השטח ניתן לאתרם rhBMP-2 על ידי immunoassay האנזימטית לפני (), כמו גם לאחר (ב) ניסויי גירוי תא. ללא יכולת לזוז rhBMP-2 היה לכמת באמצעות assay colorimetric Ampliflu האדום. הקליטה נמדדה ב 570 ננומטר והנתונים היו מנורמלים לשלוט (לא לטפל במשטחי זהב) ערכים. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן מן הממוצע n> 3.

איור 3
איור 3. משותק rhBMP-2 נשאר פעילים מבחינה ביולוגית וגורם לטווח קצר כמוגם אירועי איתות לטווח ארוך. (א) בתאי C2C12 היו מגורה ל30 דקות על ידי חשיפה למשטחי זהב (שליטה) ומשטחים עם משותק קוולנטית rhBMP-2 (iBMP-2) מתקרב מלמעלה. לאחר תמוגה תא, דגימות immunoblotted לp-Smad1/5/8 וβ-אקטין. (ב ') את הפעילות האנזימטית של phosphatase אלקליין (ALP) מצביעה על בידול osteogenic של תאי C2C12 ונמדדה מlysates התא לאחר דגירה 6 ימים תקופה בשליטה או iBMP-2 משטחים, בהתאמה. פעילות ALP נמדדה כספיגה ב 405 ננומטר. נתונים שנרכשו לאחר תגובת 60 דקות מראה גרף עמודות. הברים השגיאה מצביעים על סטיית תקן, n = 3, * p <0.01. תאי C2C12 (ג) היו זורעים על משטחים ותרבית הצביעו עבור 6 ימים בתנאי סרום נמוכים כדי לאפשר myogenesis. תמונות מראות שרשרת שרירן כבדה מכתים (MHC) של myotubes multinucleated (ירוקה) ומכתים DAPI גרעינים (כחול). 20x הגדלת תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי משותק משטח rhBMP-2 שומר על הפעילות הביולוגית שלו 19. הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה המוצגים בצורה משותקת גם הוכח במחקרים אחרים, מצביעה על כך ששחרורו של החלבונים וההפנמה הבאה שלהם אינם חיוניים לתא גירוי 24,25. למעשה, חוסר התנועה קוולנטיים של גורמי גדילה מאפשרת גירוי המתמשך של תאי היעד, תוך שמירה על מינון יעיל בגלל שיעור התפוסה משופרת סוגים שונים של קולטנים בקרום התא 22,23,26-28.

להכנת משטחי הצגה משותקת rhBMP-2, יש להיזהר בטיפול במשטחים לאורך ההליך כולו, ובהכנת פתרון rhBMP-2. Coverslips הזכוכית צריך להיות נקי ויבש ואין סימנים של פגם או זיהומים צריכים להיות גלויים. מגרד את פני השטח עם פינצטה וטפטפות יש להימנע. עבור שלב functionalization שטח באמצעות rhBMP-2, זה הכרחי להשתמש בחלבון רקומביננטי ללא ספק, כלומר ללא אלבומין בסרום השור הוסיף בהכנה, כדי למנוע חוסר תנועה לא רצויה של המוביל על פני השטח. RhBMP-2 המניות (100 מיקרוגרם / מיליליטר) היא מומס ב4 מ"מ HCl. כאשר משטחים מודגרת עם פתרון rhBMP-2, ה-pH צריכה להיות מותאם לניטראלי לpH בסיסי הקל כדי לשפר את התגובה של קבוצת אמינו של החלבון עם קבוצת שירותי הבריאות של המקשר מחויב פני השטח. אם ה-pH נמוך מדי, קבוצת שירותי הבריאות יכולה להיות הידרוליזה לפני שהוא יכול להגיב בשנינותשעות קבוצות אמינו של החלבון. אנו משתמשים PBS המכילים 1 M NaCl 29 ולהוסיף rhBMP-2 ממניות ולאחר מכן להתאים את ה-pH עם KOH (10 מ"מ).

עם פרוטוקול זה שהשגנו קיבוע המוצלח של rhBMP-2 ביו על משטחים כי: 1) הקמנו גישת שני שלבים; 2) השתמשנו במקשר מתאים כדי להשיג מרחק מהמשטח ולקשור את החלבון ללא הפרעות גדולות עליה אינטראקציה עם קולטן. Alkanethiol האמין-reactive, אסתר 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide (MU-NHS), היה קשור למצע הזהב בצעד הראשון. כalkanethiols עצמי להרכיב על מתכות כמו זהב, ויצר monolayer הורה מאוד, הם להקל על הקישוט של משטחים עם מגוון רחב של מולקולות מקשר 30-32. SAM מגן ביומולקולות ממגע ישיר עם משטח מוצק, ובכך לצמצם את הסיכון של denaturation 32. יתר על כן, אורכו של מקשר גם קובע את ריאהctivity של SAM. קבוצות NHS של linkers בהיקף של לפחות עשר אטומים פחמן, כמו MU-NHS, נגישות יותר, וכתוצאה מכך חוסר תנועת חלבון מוגבר בהשוואה לקשירה לlinkers הקצרה 34. חוסר התנועה של rhBMP-2 מתרחשת באמצעות התזוזה של קבוצת שירותי הבריאות על ידי השאריות ליזין של החלבון 34. שוקל רק את הסביבה סטרית, התגובה של קבוצות NHS-משותק פני השטח הסביר ביותר מתרחשת בשאריות N-המסוף גמיש 35. עם זאת, כפי שמוצגים לligands אחר, לאורכה ואת הגמישות של מקשר עשוי לאפשר אינטראקציה עם אחרת sterically הפריע אתרי קישור, ובכך מפצים על נטייה שלילית 36,37. בעבודה שלא פורסמה לנו בהשוואה צעד אחד עם אסטרטגיה של קיבוע שני שלבים. ההשוואה בין שימוש בתמיסה המכילה חלבון וגם linkers, ועל פני השטח הרציף המחייבים של מקשר והחלבון, הראתה כי רק שניאסטרטגית צעד הביאה לחוסר תנועה ליגנד ביו. זה יכול להיות בגלל השפעת מיגון של SAM, אשר מעכבת חלבון denaturation כי אחר יכול להתרחש בזהב. יתר על כן, מאז מקשר כבר מעוגן אל פני השטח, הצמדה צולבת בין חלבונים באמצעות קבוצות סופו של מקשר והאיון וכתוצאה מכך שלהם לעקוף 38.

לניסויים עם תאי מגורה עם משותק משטח rhBMP-2, זה הוא חיוני כדי לקבוע מראש שC2C12 לא בצורת myotubes בבקבוק התרבות לקראת זריעתם על המצע. לכן, תאים צריכים להישמר subconfluent בתרבות. הקבוצה של סרום שור עוברי המשמש לculturing ולניסויים יש להיבדק כדי לוודא ששום גירויי osteogenic נוכחים. זו מבוצעת על ידי באמצעות assay Quantikine לגילוי של חלבוני morphogenetic עצם ועל ידי בדיקת התאים לסמני בידול osteogenic, למשל alkal ביטוי phosphatase ine. בעת טיפול במצעים לגירוי מהחלק העליון של תרבויות, זה שוב חשוב להימנע מסריטות עם פינצטה. ייבוש של התרבות והסחיטה של ​​התאים יש להימנע בכל מקרה, אחרת עיוות תא והמוות תהיה להשפיע לרעה על התגובה לBMP-2 גירוי. אנו ממליצים pipetting כ 100 μl של DMEM לבאר כל צלחת 6 היטב שבו התאים בתרבית לפני יישום המצע על גבי התאים. תאים צריכים להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שלא חלה שינויים מורפולוגיים מופעלים על ידי הנוכחות של המשטחים על גבי התרבויות. לבסוף, בעת הסרת מצעים, צד אחד הוא הרים בזהירות עם פינצטה והמצע הוא קילף בעדינות. בדיקה מיידית לכל נזק לתאים במיקרוסקופ שדה בהיר יש לבצע, כמו גם סימון של מצעים כדי לקבוע אם כל רצועות תא או זיהומים עיקריים הם הווה.

_content "> לסיכום, ההליך בן שני שלבים שהוצג מספק כלי שימושי כדי לשתק rhBMP-2 על גבי מצעים באמצעות השאריות האמינים שלה כדי ללמוד את השפעתה על תגובות תאיות. האסטרטגיה שתוארה משלבת יתרונות רבים. מצד אחד, זה לא מוגבל ל BMP-2, אבל זה יכול להיות מיושם גם לגורמי גדילה אחרים של משפחת BMP, שכן הם מציגים את מבנה חומצת אמינו שמור ביותר. מצד השני, על ידי מניעת ספיחה לא ספציפית, גישה זו מאפשרת ממוקדת חקירה של BMP-2 , תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לפרופ 'JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27, (16S), S9 (2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13, (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287, (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18, (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7, (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277, (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20, (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28, (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2, (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127, (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53, (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30, (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71, (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56, (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11, (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23, (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237, (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21, (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88, (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22, (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13, (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21, (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24, (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98, (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23, (9), 2079-2087 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics