Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We beschrijven een werkwijze voor het bewerkstelligen van een efficiënte immobilisatie van BMP-2 op oppervlakken. Onze benadering is gebaseerd op de vorming van een zelf samengestelde monolaag op de covalente binding van BMP-2 via zijn vrije amine residuen bereiken. Deze methode is een nuttig hulpmiddel om signalering te studeren aan het celmembraan.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een groeifactor ingebed in de extracellulaire matrix van botweefsel. BMP-2 fungeert als trekker van mesenchymale celdifferentiatie in osteoblasten, waardoor het stimuleren van genezing en de novo botvorming. Het klinisch gebruik van recombinant humaan BMP-2 (rhBMP-2) samen met steigers is opgeheven recente controverses, gebaseerd op de wijze van presentatie en de hoeveelheid te leveren. De hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren in vitro studies op cellen. We beschrijven hoe je een zelf-geassembleerde monolaag bestaande uit een heterobifunctionele linker vormen, en tonen de daaropvolgende binding stap om covalente immobilisatie van rhBMP-2 te verkrijgen. Met deze benadering is het mogelijk om een ​​aanhoudende presentatie van BMP-2 met behoud van de biologische activiteit van het eiwit. In feite, het oppervlak immobilisatie van BMP-2 kan gerichte onderzoek door voorkoming onspecifieke advertentiesorption, terwijl het verminderen van de hoeveelheid groeifactor en, met name, belemmeren ongecontroleerd vrijkomen van het oppervlak. Zowel korte en lange termijn signalering gebeurtenissen veroorzaakt door BMP-2 plaatsvinden wanneer cellen worden blootgesteld aan oppervlakken presenteren covalent geïmmobiliseerd rhBMP-2, waardoor deze benadering geschikt in vitro naar celreacties op BMP-2 stimulatie.

Introduction

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is een lid van de transformerende groeifactor (TGF-β) familie en fungeert als inductor van de novo botvorming en regulator van verschillende weefsels tijdens de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase 1-3. Elke monomeer van de homodimeer biologisch actieve BMP-2-eiwit bevat een "cysteïne knoop" motief, die sterk geconserveerd in alle BMP 4. Zes van de zeven cysteïneresten vormen intramoleculaire disulfide bindingen die elk monomeer stabiliseren, terwijl de zevende cysteine ​​betrokken bij dimerisatie, die een intermoleculaire binding tussen de twee monomeren 5,6. Deze zeer geconserveerde cysteïne knoop wordt de driedimensionale structuur van het eiwit BMP-2 en bepaalt de unieke eigenschappen, zoals resistentie tegen hitte, samenstelling en zure pH 7-9. BMP-2 bindt aan serine / threonine kinase transmembrane receptoren, waardoor signaaltransductie induceren 12-14.

In bone, BMP-2 induceert de differentiatie van mesenchymale stamcellen in osteoblasten stimuleren zo de genezing en de novo botvorming. Momenteel, recombinant tot expressie BMP-2 is klinisch toegepast om de genezing van gebroken websites te verbeteren. Een gemeenschappelijke strategie botweefsel is het gebruik van injecteerbare groeifactoren, die minder invasief dan de lokale systemen. In vivo studies en klinische toepassingen hebben aangetoond dat de korte biologische halfwaardetijd, niet-specifieke localization en snelle lokale klaring van BMP-2 kan leiden tot verschillende lokale, buitenbaarmoederlijke en systemische problemen 15. Tot een effectieve presentatie, het insluiten of immobilisatie van BMP-2 in of op grondstoffen te verkrijgen noodzakelijk voor de lokale en langdurige afgifte op de doelplaats. Langdurige afgifte kan worden bereikt met niet-covalente retentie benaderingen, zoals fysieke insluiting, adsorptie of ion complexering 16. Het is echter bekend dat niet-specifieke adsorptie van eiwitten aan oppervlakken leidt tot denaturatie van de moleculen 17. Voor de covalente binding van groeifactoren, hebben verschillende soorten dragers zijn ontwikkeld in het afgelopen decennium. Het gebruik van bifunctionele koppeling moleculen die amino-of carboxylgroepen van het eiwit gericht is bijvoorbeeld een type aanpak die niet noodzakelijkerwijs vereist eiwitmodificatie zijn immobilisatie bereiken. In feite, terwijl eiwitmodificatie biedt het voordeel van het controleren eiwit oriëntatie,de introductie van kunstmatige domeinen peptide tags en ​​plaatsspecifieke ketens kunnen veranderen de biologische activiteit van groeifactoren 17. Aldus denaturatie omzeilen door de wisselwerking met het dragermateriaal, oppervlakken worden vooraf gefunctionaliseerd, bijvoorbeeld met een zelf-geassembleerde monolaag (SAM) van een verbindende molecule, gevolgd door koppeling van de gewenste factor 18. We hebben een SAM-gebaseerde benadering covalent immobiliseren BMP-2 op een oppervlak doelwit zijn vrije amine residuen en hebben aangetoond dat het geïmmobiliseerde eiwit behoudt zowel de korte en lange termijn biologische activiteit 19. Dit protocol is een eenvoudige en efficiënte manier om BMP-2 te leveren aan cellen in vitro naar de mechanismen die optreden met de celmembraan en reguleren intracellulaire signalering verantwoordelijk voor osteogene signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MU-NHS)

  1. Voeg druppelsgewijs een oplossing van 500 mg N-hydroxysuccinimide en 30 mg 4 - (dimethylamino) pyridine in 10 ml aceton (pa) tot 1 g 11-mercaptoundecanoic zuur in 40 ml dichloormethaan (pa) bij kamertemperatuur (RT).
  2. Koel het reactiemengsel tot 0 ° C en voeg druppelsgewijs 1,1 g N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml dichloormethaan (onder stikstofatmosfeer). Houd de reactie bij lage temperatuur gedurende 1 uur en vervolgens roer bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Filtreer het precipitaat en drogen onder verminderde druk. Zuiver het product door flitschromatografie met petroleum benzeen en ethylacetaat (pa) in een verhouding van 01:01.

2. Bereiding van goud Homogene lagen

  1. Schoon dekglaasjes nauwkeurig doekjes en ultrasone trillingen ze 5 min in een oplossing die een 1:1 mengsel van ethylacetaat (pa) en methanol (pa). Rinse substraten met methanol en drogen onder een stikstofstroom.
  2. Plaats de schone substraten in het sputter coating apparaat. Evacueren de kamer. Verwijder de bovenste chroomoxide laag van chroom doel door sputteren voor 60 sec. Plaats de monsters onder de metalen balk en smeer ze met een 10 nm chroomlaag, gevolgd door het coaten met een 40 nm goudlaag.

3. Oppervlak Immobilisatie van BMP-2

  1. Los MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1 mM en incubeer goud substraten in de MU-NHS oplossing bij kamertemperatuur gedurende 4 uur onder stikstofatmosfeer.
  2. Sonicaat oppervlakken in DMF gedurende 2 minuten, spoel met DMF en MeOH en drogen onder een stikstofstroom.
  3. Bereid een voorraadoplossing van rhBMP-2 in steriele 4 mM HCl met een concentratie van 100 ug / ml (opslag fracties bij -80 ° C). Voor werkende verdunningen (3,5 ug / ml) Verdun de voorraadoplossing in PBS / NaCl (PBS bevattende 1 M NaCl) en eendjust tot pH 8,5 onmiddellijk voor gebruik.
  4. Incubeer gefunctionaliseerde oppervlakken MU-NHS in de rhBMP-2 werkoplossing bij 4 ° C overnacht. Verwijder supernatant incubatie. Sonicaat oppervlakken in PBS / NaCl gedurende 2 minuten en was 3x met steriele PBS / NaCl.

4. Oppervlaktekarakterisering

  1. Om niet-specifieke adsorptie van antilichaam blokkeren, incubeer oppervlakken met een 5% BSA (w / v) in PBS oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie met een anti-BMP-2-antilichaam (1:100 in 1% (w / v ) BSA / PBS oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was oppervlakken tweemaal met PBS en ultrasone trillingen gedurende 30 sec.
  2. Incubeer substraten met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:1000 in 1% (w / v) BSA / PBS oplossing) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens tweemaal wassen met PBS.
  3. Gebruik Ampliflu Red test om HRP enzymatische activiteit te meten bij 570 nm met een plaat lezer.

5. Analyse van biologische activiteit

  1. Seed 1 x 10 5 muis C2C12 myoblasts per putje in 6-well plates in kweekmedium, bestaande uit een hoog glucose DMEM dat pyruvaat gesupplementeerd met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 ° C / 5% CO2.
  2. Verhongeren cellen in serumvrij DMEM gedurende 3-5 uur vóór het zaaien op de oppervlakken voorzien van geïmmobiliseerde BMP-2.
  3. Voor het onderzoek naar de korte termijn signalering inductie, vervang het medium door 200 ul vers serum-vrij DMEM en plaats de geïmmobiliseerde BMP-2 vlakken boven de cellen. De ondergrond moet met fijne punt pincet worden behandeld om te voorkomen krassen.
  4. Verwijder voorzichtig oppervlakken en zuig het medium met een pipet, was de cellen tweemaal met PBS. Overgaan tot analyse van cel responsen.
  5. Voor de analyse van langdurige biologische activiteit, cellaag op oppervlakken en kweken ervan bij 37 ° C / 5% CO 2 bij lage serum (2% FBS) gedurende zes dagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In onze opstelling, werd goud gekozen als hulpstof omdat het zorgt voor een biologisch niet-specifieke, maar chemisch afstembare systeem. Bovendien kan de toepassing van zelf-assemblerende monolagen kleven veel voordelen: SAMs spontaan absorberen via hun "head-groepen" metalen en vorm monolagen met weinig defecten, terwijl hun functionele eindgroepen verder kan worden gemodificeerd. Aldus verschaffen zij een platform om de eigenschappen van de interface kunnen afstemmen op een gecontroleerde maar zeer flexibele manier 20.

Voor de immobilisatie van BMP-2 op goud gecoate oppervlakken, gebruikten we twee stappen: 1) binden van de MU-NHS linker aan de goudlaag, en 2) het laten reageren van de linker met het eiwit (zie figuur 1). Om te bewijzen de binding van het rhBMP-2, gebruikten we een enzym immunoassay. In deze assay oppervlakken presenteren geïmmobiliseerd rhBMP-2 werden geïncubeerd met BMP-2 specifiek antilichaam en een secundair antilichaam geconjugeerd met HRP. De binding van de laatste kan worden dvastgesteld naar het gebruik van een Ampliflu Rode oplossing. In aanwezigheid van waterstofperoxide, HRP katalyseert de omzetting van de kleurloze Ampliflu rood (10-acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) in de fluorescerende verbinding resorufine. We hebben ontdekt oppervlak geïmmobiliseerd rhBMP-2 (IBMP-2) voor en na benaderen hechtende cellen van boven met gefunctionaliseerde oppervlakken. Merk op dat voor de detectie van rhBMP de Ampliflu Red assay, de monsters onderworpen aan verschillende incubatiestappen en behandelingen. Daarom is het niet mogelijk om hetzelfde oppervlak onderzoeken vóór en na cel stimulatie. Figuur 2A toont de succesvolle binding van het rhBMP-2 op het oppervlak in een conformatie die door de anti-BMP-2 IgG. Figuur 2B toont een IBMP- 2 oppervlak dat werd gebruikt om cellen te stimuleren gedurende 30 min voor het HRP immunoassay. Zelfs na cel stimulatie de eiwitten worden aangetroffen op het oppervlak.

Celreacties op oppervlakken presenteren geïmmobiliseerd rhBMP-2 werden geëvalueerd en vergeleken met het effect van niet-behandelde substraten goud (negatieve controle). Om de invloed van de hechting taak op de analyse van de korte-termijn signalering te minimaliseren, werd een speciale opzet ontwikkeld voor celstimulatie. Hier werden C2C12 cellen gestimuleerd gedurende 30 min met rhBMP-2 gefunctionaliseerde oppervlakken naderen van de top. De muis myoblast cellijn C2C12 is een pluripotente mesenchymale voorloper cellijn, die op grote schaal wordt gebruikt als modelsysteem om het vroege stadium van osteogene differentiatie tijdens botvorming in spierweefsel te bestuderen. In dit model, BMP-2 remt de differentiatie van cellen tot veelkernige myotubes en induceert osteoblasten fenotypen 21. De activering van Smad 1/5/8, die stroomafwaarts verslaggevers van de BMP-2 signalerende weg zijn, wordt geanalyseerd door western blotting. Zoals getoond in figuur 3A, wordt Smad fosforylatie waargenomen na 30 min stimulatie door IBMP-2, terwijl er geen fosforylering van Smad 1/5/8 optreedtin cellen blootgesteld aan goud onbehandelde monsters. Dit resultaat geeft aan dat de immobilisatie proces BMP-2 op korte termijn activiteit niet verandert en triggers eerste stappen in Smad signalering.

Om te bepalen of IBMP-2 beïnvloedt langdurige osteogene differentiatie, het expressieniveau van alkalische fosfatase (ALP), een osteogeen marker, werd onderzocht door een colorimetrische assay. ALP activiteit van C2C12 cellen werd gemeten na incubatie van de cellen gedurende 6 dagen op gewoon goud (controle) en IBMP-2 oppervlakken. ALP activiteit in lysaten van cellen gekweekt op IBMP-2 oppervlakken geeft een significant hogere absorptie in vergelijking met de controle (Figuur 3B). Dit resultaat laat zien dat IBMP-2 induceert de expressie van de osteogene marker ALP in C2C12 cellen. Deze cellijn is bekend om onderscheid te maken bij het bereiken van confluentie onder lage serum voorwaarde, waardoor de vorming van myotubes en het uiten van karakteristieke myogene eiwitten. Echter, behandeling met BMP-2 veroorzaakt een verschuiving inde differentiatieomzettingsweg van myoblastic tot osteoblastische dus het onderdrukken van de vorming van myotubes. Om het effect van IBMP-2 op myogenesis te onderzoeken, werden C2C12 cellen direct op goud (controle) of gefunctionaliseerde oppervlakken en gekweekt onder differentiatie (laag serum) voorwaarden plated. Na 6 dagen werd kleuring van myosine zware keten (MHC) uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 3C, C2C12 cellen niet MHC positieve myotubes gevormd in aanwezigheid van IBMP-2, maar niet op goud substraten.

Figuur 1
Figuur 1. Schema van de immobilisatie van rhBMP-2 op goudoppervlakken. Dekglaasjes worden gecoat met een goudlaag en vervolgens geïncubeerd met een heterobifunctionele linker (MU-NHS) resulteert in een NHS-gefunctionaliseerde zelf-geassembleerde monolaag (SAM). Primaire aminen van BMP-2 reageren met de linker leidt tot covalently geïmmobiliseerd eiwit op het substraat. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Oppervlakte-gebonden rhBMP-2 kan worden gedetecteerd door enzymatische immunoassay voor (A) en na (B) cel stimulatie-experimenten. Geïmmobiliseerd rhBMP-2 werd gekwantificeerd door Ampliflu Red colorimetrische bepaling. De absorptie werd gemeten bij 570 nm en de gegevens werden genormaliseerd om de controle (niet-behandelde goud oppervlakken) waarden. Foutenbalken stellen de standaardafwijking van het gemiddelde n> 3.

Figuur 3
Figuur 3. Geïmmobiliseerd rhBMP-2 blijft biologisch actief en veroorzaakt op korte termijn alsals lange-termijn signalering gebeurtenissen. (A) C2C12-cellen werden gestimuleerd gedurende 30 minuten door blootstelling aan gouden oppervlakken (controle) en oppervlakken met covalent geïmmobiliseerd rhBMP-2 (IBMP-2) nadert vanuit de top. Na cellyse werden monsters immunoblotting voor p-Smad1/5/8 en β-actine. (B) De enzymatische activiteit van alkalische fosfatase (ALP) geeft osteogene differentiatie van C2C12-cellen en is gemeten van cellysaten na 6 dagen incubatie periode op controle of IBMP-2 oppervlakken, respectievelijk. ALP-activiteit werd gemeten als absorptie bij 405 nm. Staafdiagram toont gegevens verkregen na een 60-min reactie. De foutbalken geven standaarddeviatie, n = 3, p <0.01. (C) C2C12-cellen werden gezaaid op oppervlakken aangegeven en gedurende 6 dagen onder lage serum omstandigheden myogenesis staan. Beelden tonen myosine zware keten (MHC) kleuring van meerkernige myotubes (groen) en DAPI kernen kleuring (blauw). Vergroting 20x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol beschrijven we de bereiding van oppervlak gefunctionaliseerd met bioactieve rhBMP-2. Deze benadering omvat twee stappen: 1) de initiële vorming van een zelf-assemblerende monolaag (SAM) van een bifunctionele linker aan het gouden oppervlak, 2) covalente immobilisatie van het rhBMP-2-eiwit. In eerdere werk, we gevalideerde de effectieve binding van de bifunctionele linker en de groeifactor, en toonde aan dat het oppervlak geïmmobiliseerd rhBMP-2 behoudt zijn biologische activiteit 19. De bioactiviteit van groeifactoren gepresenteerd in een geïmmobiliseerde vorm is ook aangetoond in andere studies, dat de introductie van de eiwitten en hun verdere internalisatie niet essentieel voor celstimulatie 24,25. In feite is de covalente immobilisatie van groeifactoren kan de voortdurende stimulatie van de doelcellen met behoud van een effectieve dosering vanwege verbeterde bezettingsgraad van verschillende receptoren op het celmembraan 22,23,26-28.

Voor de bereiding van oppervlakken presenteren geïmmobiliseerd rhBMP-2, zorg moet worden genomen bij de behandeling van de oppervlakken gedurende de gehele procedure en de voorbereiding van het rhBMP-2-oplossing. De dekglaasjes moet schoon en droog zijn en geen tekenen van defecten of verontreinigingen moet zichtbaar zijn. Krassen op het oppervlak met een pincet en pipetten moeten worden vermeden. Voor het oppervlak functionaliseringsstap met rhBMP-2, is het essentieel om een dragervrij recombinant proteïne, dus zonder extra runderserumalbumine in het preparaat, om ongewenste immobilisatie van de drager op het oppervlak voorkomen. Het rhBMP-2 voorraad (100 ug / ml) wordt opgelost in 4 mM HCl. Wanneer oppervlakken geïncubeerd met rhBMP-2-oplossing, moet de pH worden ingesteld op neutraal tot licht alkalische pH op de reactie van de aminogroep van het eiwit met de NHS groep van het oppervlak gebonden linker verbeteren. Als de pH te laag is, kan de NHS groep gehydrolyseerd alvorens het wit kan reagerenh de aminogroepen van het eiwit. We maken gebruik van PBS met 1 M NaCl 29 en voeg rhBMP-2 uit voorraad en pas dan de pH met KOH (10 mm).

Met dit protocol behaalden we de succesvolle immobilisatie van bioactieve rhBMP-2 op oppervlakken omdat: 1) we een aanpak in twee stappen, 2) we een geschikte linker gebruikt om de afstand te verkrijgen van het oppervlak en om het eiwit te binden zonder grote storingen op zijn interactie met de receptor. De amine-reactieve alkaanthiolen, 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MU-NHS), werd gebonden aan de gouden ondergrond in de eerste stap. Als alkanethiols zelf-assembleren op metalen zoals goud, die een zeer geordende monolaag, vergemakkelijken ze het versieren van vlakken met verschillende linkermoleculen 30-32. De SAM beschermt biomoleculen van direct contact met vast oppervlak, waardoor het risico van denaturatie 32 minimaliseren. Bovendien is de lengte van de linker bepaalt ook de reactivity van de SAM. De NHS groepen linkers uit ten minste elf koolstofatomen, zoals de MU-NHS, beter toegankelijk, waardoor verhoogde eiwitimmobilisatie vergelijking binding aan kortere linkers 34. De immobilisatie van rhBMP-2 gebeurt door de verplaatsing van de NHS groeperen op de lysineresten van het eiwit 34. Aangezien slechts de sterische omgeving, de reactie van het oppervlak geïmmobiliseerde NHS groepen vindt waarschijnlijk plaats in de flexibele N-eindstandige resten 35. Zoals getoond voor andere liganden, de lengte en de flexibiliteit van de koppelaar kan interactie mogelijk met andere sterisch gehinderde bindingsplaatsen, waardoor gecompenseerd ongunstige oriëntatie 36,37. In onuitgegeven werk vergeleken we de een-stap met een twee-staps immobilisatie strategie. De vergelijking tussen het gebruik van een oplossing die zowel eiwit en linkers, en de sequentiële oppervlak binding van de linker en het eiwit bleek dat slechts de twee-stap strategie resulteerde in bioactieve ligand immobilisatie. Dit kan worden veroorzaakt door een afscherming van de SAM, welk eiwit denaturatie die anders zou kunnen plaatsvinden op goud belemmert. Aangezien de linker reeds verankerd aan het oppervlak, verknoping tussen eiwitten door de eindgroepen van het verbindingsstuk en daaruit voortvloeiende inactivatie omzeild 38.

Voor de experimenten met cellen gestimuleerd met oppervlak geïmmobiliseerd rhBMP-2, is het cruciaal om vooraf te bepalen dat C2C12 niet myotubes in de kolf voordat ze zaaien op het substraat vormden. Daarom subconfluente cellen worden in kweek gehouden. De partij foetaal runderserum voor kweken en voor de experimenten worden getest dat er geen osteogene stimuli aanwezig zijn. Dit wordt uitgevoerd door de Quantikine assay voor detectie van bot morfogenetische eiwitten en het testen van de cellen voor osteogene differentiatie merkers, bijvoorbeeld alkal ine fosfatase expressie. Bij hun substraten voor de stimulatie van de top van culturen, is opnieuw belangrijk om krassen met de pincet vermijden. Drogen van de cultuur en knijpen van de cellen moet worden vermeden in elk geval, anders cel vervorming en dood zal een negatieve invloed hebben op de respons op BMP-2 stimulatie. We raden pipetteren ongeveer 100 ul DMEM in elk putje van een 6-well plaat waarbij de cellen worden gekweekt alvorens de ondergrond op de cellen. De cellen moeten onder de microscoop worden waargenomen verzekeren dat er geen morfologische veranderingen veroorzaakt door de aanwezigheid van de oppervlakken boven de kweken. Tenslotte, bij het verwijderen van de substraten een zijde voorzichtig opgetild met de pincet en het substraat wordt voorzichtig afgepeld. Een onmiddellijke controle voor celbeschadiging met een helderveld microscoop moet worden uitgevoerd, alsmede een controle van de substraten te bepalen of een cel kettingen of grote verontreinigingen aanwezig zijn.

_content "> Tot slot, de gepresenteerde twee-staps procedure biedt een nuttig instrument om rhBMP-2 immobiliseren op substraten via zijn amine residuen om de impact op cellulaire reacties te bestuderen. De beschreven strategie combineert veel voordelen. Aan de ene kant is het niet beperkt tot BMP-2, maar kan ook worden toegepast op andere groeifactoren van de familie BMP, aangezien deze een zeer geconserveerde aminozuur structuur. Anderzijds, door het voorkomen van niet-specifieke adsorptie uitgangspunt kan gericht onderzoek BMP-2 , terwijl het verminderen van de hoeveelheid groeifactor en, met name, belemmeren ongecontroleerd vrijkomen van het oppervlak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken prof. dr. JP Spatz (Department of Biofysische Chemie, Universiteit van Heidelberg en het ministerie van nieuwe materialen en Biosystems, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Stuttgart) voor zijn vriendelijke ondersteuning. De financiële steun van het Max-Planck-Gesellschaft en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 naar EAC-A.) Zijn ook sterk erkend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27, (16S), S9 (2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13, (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287, (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18, (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7, (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277, (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20, (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28, (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2, (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127, (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53, (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30, (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71, (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56, (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11, (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23, (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237, (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21, (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88, (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22, (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13, (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21, (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24, (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98, (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23, (9), 2079-2087 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics