العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

العزلة وثقافة السكان نقية من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة، والسكان الخلايا الجذعية العضلية، أمر ضروري لفهم العضلات الجذعية بيولوجيا الخلايا وتجديدها، فضلا عن زرع الخلايا الجذعية لعلاج ضمور العضلات في والأمراض التنكسية الأخرى.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

خلايا العضلات الأقمار الصناعية هي مجموعة من السكان الخلايا الجذعية اللازمة لتطوير الهيكل العظمي والعضلات بعد الولادة والتجدد، وهو ما يمثل 2-5٪ من نوى sublaminal في الألياف العضلية. في العضلات الكبار، والخلايا الأقمار الصناعية عادة ما تكون هادئة ميتوتيكلي. بعد الاصابة، ومع ذلك، بدء انتشار الخلايا الأقمار الصناعية الخلوية لإنتاج myoblasts، السلالات، وللتوسط في تجديد العضلات. زرع الخلايا المشتقة من myoblasts الأقمار الصناعية وقد درس على نطاق واسع كعلاج ممكن لعدة أمراض التجدد بما في ذلك ضمور العضلات، وفشل القلب، وضعف الجهاز البولي. وقد أظهرت زرع Myoblast في التصنع العضلات والهيكل العظمي والقلب احتشاء، وتفكك القنوات البولية التي myoblasts المغروسة يمكن أن تفرق في ألياف العضلات في الأنسجة المضيفة وتحسين عرض وظيفية جزئية في هذه الأمراض. وبالتالي، فإن تطوير أساليب تنقية كفاءة الخلايا الأقمار الصناعية هادئة من muscl الهيكل العظميه، وكذلك إنشاء الخلية المستمدة من الثقافات myoblast الأقمار الصناعية وأساليب زرع لmyoblasts، ضرورية لفهم الآليات الجزيئية وراء خلية الفضائية التجديد الذاتي، والتنشيط، والتمايز. بالإضافة إلى ذلك، وتطوير العلاجات المستندة إلى الخلايا لضمور العضلات وأمراض أخرى التجدد تعتمد على هذه العوامل أيضا.

ومع ذلك، وأساليب تنقية المحتملين الحالية الخلايا الأقمار الصناعية هادئة تتطلب استخدام مضان تنشيط الخلايا مكلفة الفرز (FACS) الآلات. هنا، نقدم طريقة جديدة لتنقية السريع، واقتصادا، وموثوق بها الخلايا الأقمار الصناعية هادئة من الماوس الكبار العضلات والهيكل العظمي من قبل تفارق الأنزيمية تليها خلية المغناطيسي تنشيط فرز (MACS). بعد عزل الخلايا الأقمار الصناعية هادئة نقية، يمكن تربيتها هذه الخلايا للحصول على عدد كبير من myoblasts بعد عدة مقاطع. هذه معزولة طازجةالخلايا الأقمار الصناعية هادئة أو خارج الحي myoblasts توسعت يمكن زرعها في cardiotoxin (CTX) الناجم عن تجديد الماوس العضلات والهيكل العظمي لدراسة مساهمة من الخلايا المشتقة من الجهات المانحة إلى تجديد الألياف العضلية، فضلا عن المقصورات الخلية الأقمار الصناعية لدراسة التجديد الذاتي الأنشطة.

Introduction

خلايا العضلات الأقمار الصناعية هي عدد صغير من السكان من الخلايا الجذعية عضلي يقع تحت الصفيحة القاعدية من ألياف العضلات والهيكل العظمي. فهي تتميز التعبير عن Pax7، Pax3، ج الأرصاد، M-كادهيرين، CD34، Syndecan-3، والكالسيتونين 1-3. وقد أثبتت الخلايا الأقمار الصناعية لتكون مسؤولة عن تجديد العضلات والخلايا الجذعية العضلية. في العضلات الكبار، والخلايا الأقمار الصناعية عادة ما تكون هادئة ميتوتيكلي 4-8. بعد الإصابة، يتم تنشيط الخلايا الأقمار الصناعية، والشروع في التعبير عن MyoD، وأدخل دورة الخلية لتوسيع ذريتها، ووصف الخلايا السلائف عضلي أو myoblasts 3. بعد عدة جولات من انقسام الخلايا، myoblasts خروج دورة الخلية والصمامات مع بعضها البعض من أجل الخضوع التمايز في myotubes متعددة الأنوية، تليها الألياف العضلية الناضجة. Myoblasts معزولة من العضلات الكبار يمكن بسهولة توسيع فيفو السابقين. القدرة على أن تصبح myoblasts ألياف العضلات في تجديد العضلات ويتم استغلالها شكل ألياف العضلات خارج الرحم في الأنسجة nonmuscle بواسطة زرع myoblast، نهج العلاجية المحتملة لضمور العضلات دوشين (DMD) وضعف الجهاز البولي وفشل القلب 10. في الواقع، تم زرعها بنجاح myoblasts في العضلات من كلا MDX (DMD نموذج) الفئران والمرضى DMD 11-14. وmyoblasts العادي حقن تلتحم مع الألياف العضلية المضيف لتحسين الأنسجة وظيفة العضلات المريضة. أظهرت الأعمال السابقة أن المجموعات السكانية الفرعية من myoblasts هي أكثر الجذعية مثل الخلية وتظل في حالة غير متمايزة يعد في العضلات خلال تجديد العضلات 5. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن الخلايا الأقمار الصناعية طازجة معزولة من العضلات الكبار تحتوي على السكان مثل الخلايا الجذعية التي يسلك engraftment أكثر كفاءة والنشاط التجديد الذاتي في تجديد العضلات 5-8. وبالتالي، تنقية من السكان نقية من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة من مو الهيكل العظمي الكباربعد المقطع ضروري لفهم بيولوجيا الخلايا الأقمار الصناعية، وتجديد العضلات myoblasts، وتطوير العلاجات المستندة إلى الخلايا.

ومع ذلك، وأساليب تنقية المحتملين الحالية الخلايا الأقمار الصناعية هادئة تتطلب استخدام ومضان تنشيط الخلايا مكلفة الفرز (FACS) آلة 1،2،6-8. بالإضافة إلى ذلك، التعرض ليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية تميل للحث على موت الخلايا خلال الفصل، والذي يسبب انخفاض العائد من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة 15. هنا، نقدم طريقة جديدة لتنقية السريع، واقتصادا، وموثوق بها الخلايا الأقمار الصناعية هادئة من الماوس الكبار العضلات والهيكل العظمي. يستخدم هذا الأسلوب تفارق الأنزيمية تليها خلية المغناطيسي تنشيط فرز (MACS). بعد عزل الخلايا الأقمار الصناعية هادئة نقية، يمكن تربيتها هذه الخلايا للحصول على عدد كبير من myoblasts بعد عدة مقاطع. وتبين لنا أيضا أن الحقن العضلي من هذه الخلايا الأقمار الصناعية هادئة معزولة طازجة أو السابقين السادسيمكن زرعها فو توسيع myoblasts في cardiotoxin (CTX) الناجم عن تجديد الماوس العضلات والهيكل العظمي لدراسة مساهمة من الخلايا المشتقة من الجهات المانحة إلى تجديد الألياف العضلية، فضلا عن المقصورات الخلية الأقمار الصناعية لفحص أنشطة التجديد الذاتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم إيواء الحيوانات في بيئة SPF وتم رصدها من قبل بحوث الثروة الحيوانية (RAR) من جامعة مينيسوتا. . الموت الرحيم كانت الحيوانات بالوسائل الملائمة (CO 2 الاستنشاق أو الحقن بوكل بعد تخدير مع حقن IP من آفيرتين (250 ملغ / كلغ) وقد وافق جميع البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC، عدد الرمز: 1304-30492 ) من جامعة مينيسوتا.

1. عزل النوى من الخلايا ماوس العضلات الهيكلية

  1. تضحية صحيح 1 أو 2 الفئران الشباب البالغين (3-8 أسابيع).
    1. قرصة وشق الجلد من البطن مع مقص حاد. تقشر الجلد لتظهر تماما ثلاثية الرؤوس والعضلة الخلفية أطرافهم (سحب الجلد في اتجاهات معارضة).
    2. إزالة جميع عضلات الساق والهيكل العظمي (الظنبوبي الأمامي، الساق، والفخذ) وثلاثية الرؤوس على طول العظام مع مقص. ثم نقل إلى عضلات الجليد الباردة، برنامج تلفزيوني العقيمة في 10 سم لوحة.
  2. غسل الدم من العضلات في برنامج تلفزيوني والعضلات نقل إلى جديدة معقمة 6 سم لوحة: 1 لوحة لمدة 1-2 الفئران.
  3. إزالة النسيج الضام والأوعية الدموية والأعصاب حزم، والأنسجة مكون الشحم تحت المجهر تشريح.
  4. باستخدام مقص لجراحة العيون، وقطع اللحم المفروم والأنسجة في اللب السلس (أرقام 1A و 1B). ليس محاولة لترك القطع الكبيرة، كما لن يتم تقسيمها بسهولة عن طريق الحل الانزيم.
  5. نقل العضلات المفروم إلى مل أنبوب فالكون 50، وإضافة 5 مل من محلول كولاجيناز (0.2٪ كولاجيناز من النوع 2 في 10٪ FBS في DMEM). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  6. يسحن (صعودا وهبوطا مع 18 G إبرة) إلى التجانس خليط (الشكل 1C). ثم مزيد من احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. يسحن مرة أخرى إلى التجانس الخليط إلى فصل في تعليق خلية واحدة. إضافة 2٪ FBS في DMEM تصل إلى 50 مل في تعليق خلية واحدة وتخلطأيضا.
  8. وضع مصفاة الخلية (70 ميكرومتر) في الصعود إلى مل أنبوب فالكون 50 (الشكل 1D). نقل طاف تحتوي الخلايا فصلها على مصفاة الخلية، وماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا على مرشح حتى أنها تمر عبر.
  9. حساب عدد الخلايا التي كتبها عدادة الكريات. الطرد المركزي أنابيب في 2،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق؛ نضح وتجاهل طاف.
  10. في resuspend مع 10 مل من 2٪ FBS في DMEM. الطرد المركزي أنابيب في 2،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق؛ نضح وتجاهل طاف.
  11. في resuspend مع 200 ميكرولتر من 2٪ FBS في DMEM وتعليق خلية نقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. عادة، يجب أن تحصد حوالي 2 × 10 6 خلايا من عضلات 1 الماوس. سوف تضعف الخلايا إلى تركيز من 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ FBS في DMEM.

2. تلوين الأجسام المضادة وفصل مع MACS

خلال العلاقات العامة التاليةocedures، والحفاظ على ظروف معقمة باستخدام مخازن العقيمة. وأضاف كل من حجم الأجسام المضادة ويتم احتساب تعليق خلية المتوسطة للخلايا العضلات من كل من 1 الماوس. إذا يتم حصاد الخلايا من 2 أو أكثر من الفئران، وينبغي أن يكون الأمثل كمية من الكواشف.

  1. إضافة 1 ميكرولتر من كل CD31-PE، CD45-PE، هيئة السلع التموينية-1-PE، وإنتغرين الضد α7 في 200 ميكرولتر من التعليق الخلية. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  2. غسل الخلايا: بعد مرور فترة الحضانة، إضافة 1 مل من 2٪ FBS في DMEM في تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين.
  3. نضح وتجاهل طاف.
  4. Resuspend الخلايا مع 200 ميكرولتر من 2٪ FBS في DMEM، وإضافة 10 ميكرولتر من مكافحة PE الخرز المغناطيسي. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. غسل الخلايا: بعد مرور فترة الحضانة، إضافة 1 مل من العازلة MACS لتعليق الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، ومن ثم الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. كرر هذه الخطوة TWالجليد. لاحظ أن الخلايا يجب غسلها العازلة MACS قبل أن يتم فصلها بواسطة عمود المغناطيسي.
  6. نضح وتجاهل طاف. resuspend الخلايا مع 1.0 مل من العازلة MACS.
  7. إنشاء عمود LD على لوحة مغناطيسية، وشطف العمود مع 2.0 مل من MACS العازلة (الشكل 1E).
  8. نقل تعليق الخلية على العمود دينار، وجمع الكسر التدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل. هذا جزء يحتوي على خلايا-PE سلبية.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق، نضح وتجاهل طاف.
  10. Resuspend الخلايا مع 200 ميكرولتر من 2٪ FBS في DMEM، وإضافة 10 ميكرولتر المضادة للماوس مفتش الخرز المغناطيسي. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  11. غسل الخلايا: بعد مرور فترة الحضانة، إضافة 1 مل من العازلة MACS في تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل، ومن ثم الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. نضح وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرتين. الخلايا resuspend مع 500 ميكرولتر من العازلة MACS.
  12. إنشاء عمود MS على لوحة مغناطيسية، وشطف العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة MACS (الشكل 1F).
  13. نقل علقت حل الخلية على العمود MS، وتجاهل الكسر التدفق من خلال (إنتغرين الخلايا α7 سلبية).
  14. شطف مع 1 مل من العازلة MACS، وكرر هذه الخطوة مرتين.
  15. بعد الشطف، إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للفاصل. تنطبق 1.0 مل من العازلة MACS على العمود، وأزل الخلايا المسمى مغناطيسيا (خلايا α7 إيجابية إنتغرين) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل عن طريق دفع المكبس حقنة من أعلى العمود. جمع من خلال تدفق في أنبوب 1.5 مل. تكرار شطف مع 1.5 مل من العازلة MACS وجمع التدفق من خلال.
  16. أجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق، نضح وتجاهل طاف.
  17. الخلايا resuspend المنقى مع 1 مل من Myoblast المتوسطة (20٪ FBS الواردة همس F-10 مع bFGF)، وخلايا لوحة على Matrigel المغلفة 10 سملوحة مع 8 مل من Myoblast متوسطة (5 مل في 6 سم لوحة) (الشكل 1G). نلاحظ أن 1-2 × 10 5 خلايا يمكن أن يحتمل أن تكون معزولة من 1 العضلات الماوس سليمة.

3. صيانة

  1. تغذية الخلايا كل يوم مع Myoblast المتوسط. ظهور myoblasts المتزايد هو من شكل صغيرة ومستديرة معربا عن MyoD (الشكل 2) وPax7 (لا تظهر البيانات) في النواة الخاصة بهم.
  2. وينبغي passaged Myoblasts قبل 50٪ التقاء أو عند بدء انصهار الخلية. بعد الشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع 0.25٪ التربسين الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في حاضنة CO 2 وجمع الخلايا مع فصلها Myoblast المتوسط. بعد الطرد المركزي الخلايا (1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق)، مع تعليق Myoblast المتوسطة وreplate الخلايا على لوحات جديدة Matrigel المغلفة. لوحات المغلفة الكولاجين يمكن استخدامه بعد مرور 3. عادة ما يمكن تقسيم واحد في لوحة 3-5 لوحات.

4. Differentiation

  1. Refeed متوسطة التمايز مع كل يوم.
  2. بعد يوم 1 في متوسطة التمايز، myoblasts خروج دورة الخلية والخضوع التمايز في ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC) إيجابية myocytes. هذه myoctyes تبدأ خلية الانصهار مع بعضهم البعض لتوليد myotubes متعددة النوى. عادة، فإن معظم myoblasts تصبح MHC-الإيجابية myocytes وحيدات النوى التفريق أو myotubes (الشكل 2) بعد يوم 3-5 في متوسطة التمايز.

5. Myoblast زرع في ماوس لتجديد العضلات الهيكلية

  1. تخدير الفأر مع آفيرتين (250 ملغ / كغ) من قبل داخل الصفاق (IP) حقن.
  2. حلق الشعر على الجلد حول الظنبوبي الأمامي (TA) في العضلات. قبل أربع وعشرين ساعة زرع myoblast، 10 ميكرومتر CTX (50 ميكرولتر) يتم حقن العضل في الإيماءة / SCID الماوس TA العضلات للحث على تجديد العضلات عن طريق حقنة الأنسولين خلال 31 G الجلد حلق (الشكل60، 3).
  3. يتم فصلها myoblasts المتكاثرة مع 0.25٪ التربسين الحل، وطرد في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل طاف. في resuspend 1 × 10 6 خلايا مع 50 ميكرولتر من 2٪ FBS في DMEM. نقل الخلايا علقت في حقنة الانسولين 31 G.
  4. سيتم مخدرة الفئران المتلقي مع آفيرتين (250 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن IP، ويتم حقن 1 × 10 6 myoblasts (الشكل 2) عضليا في تجديد TA العضلات.
  5. الحصاد TA العضلات من خلال 1-4 أسابيع بعد حقن الخلايا للتحليل النسيجي (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الخلايا الأقمار الصناعية هادئة معزولة طازجة عرض، شكل جولة صغيرة (الشكل 1G)، وPax7 صريحة كعلامة نهائية لخلايا الأقمار الصناعية هادئة. أكثر من 90٪ من خلايا معزولة طازجة تعبير عن Pax7 (الشكل 1H و1I). الخلايا الملوثة هي أكثر من خلايا الدم التي لا تنمو في المختبر بكفاءة الشروط التالية ثقافة myoblast. وبالتالي، myoblasts المشتقة من الخلايا الأقمار الصناعية تهيمن في الثقافة. اختياريا، يمكننا تكرار الخطوات لتنقية العمود MS (الخطوات 2،11-2،14) لزيادة نقاء الخلايا الأقمار الصناعية معزولة. وهذه الخلايا الأقمار الصناعية هادئة تدخل دورة الخلية في غضون 24 ساعة بعد العزلة على الخضوع لخلايا السلائف عضلي أو myoblasts. هذه الخلايا يمكن passaged بواسطة trypsinization كل 4 أيام حتى يتم خفض معدل تكاثر الخلايا. عادة، وهذه الخلايا لا يمكن الحفاظ عليه حتى مرور 10. هذه myoblasts المتكاثرة التعبير عن MyoD ( (الشكل 2). ويمكن استخدام هذه فيفو السابقين myoblasts موسعة للتجارب الحقن العضلي خلية لدراسة مساهمة myoblast إلى تجديد الألياف العضلية والخلايا الأقمار الصناعية تجديد الذات. قبل أربع وعشرين ساعة حقن الخلايا، يتم حقن CTX في عضلات TA من الإيماءة / SCID الفئران العوز المناعي القديمة أشهر 2. يتم حقن myoblasts نأت إلى CTX التي يسببها تجديد العضلات (الشكل 3). حقن العضلات يمكن حصادها بضعة أيام إلى عدة أشهر بعد الحقن. وعادة ما وصفت الخلايا المانحة وراثيا مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين β-غالاكتوزيداز الجين 16 الفوسفاتيز القلوية الجين 18 بواسطة ترنسفكأيشن البلازميد، والعدوى الفيروسية ناقلات، أو إعداد الفئران المعدلة وراثيا من يحمل التحوير. الخلايا الأقمار الصناعية من Myf5 متخالف + / nLacZ الفئران 19، في الخلايا التي عضلي يمكن أن يتم الكشف عن بعد X-غال تلطيخ، كانت معزولة. الفئران Myf5 + / nLacZ تحمل β النووية - غالاكتوزيداز الجين إدراجها في موضع الجين Myf5، حيث يلخص التعبير الجيني β-غالاكتوزيداز التعبير عن الذاتية Myf5 في كل من الخلايا الأقمار الصناعية والخلايا السلائف عضلي أو myoblasts 20 الشكل 3 يبين كله TA تلطيخ العضلات للكشف عن الخلايا β-النووية غالاكتوزيداز إيجابية المستمدة من الجهات المانحة، والتي تشمل المتكاثرة myoblasts، والخلايا الأقمار الصناعية تجديد الذات، والألياف العضلية التي شكلت حديثا. إذا لزم الأمر، وهذه العضلات TA الملون يمكن استخدامه لالنسيجي ذاته ctions لمزيد من الأساليب مناعي.

الشكل 1
الشكل 1. إعداد خلايا العضلات الأقمار الصناعية من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ج: تنميق الرؤوس تشريح العضلات وأطرافهم الخلفيتين بواسطة مقص B: عرض مكبر للوحة A C: الطحن المعالجة كولاجيناز قطع العضلات المفروم بنسبة 18 G إبرة D:. الترشيح فصلها إعداد العضلات من خلال مصفاة الخلية E:. MACS فصل فصل خلايا العضلات بواسطة عمود LD F:. MACS فصل خلايا العضلات فصلها بواسطة عمود MS G:. الخلايا الأقمار الصناعية معزولة طازجة H: عزل الخلايا الأقمار الصناعية طازجة Pax7 إيجابية الأول: دابي تلطيخ لوحة G.

الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 2
الشكل 2. الثقافة الخلايا الأقمار الصناعية معزولة. A، B، C: myoblasts الضد إيجابية مكافحة MyoD المستمدة من الخلايا الأقمار الصناعية طازجة معزولة D، E، F: سلسلة ميوسين الثقيلة المضادة لل(MHC) إيجابية التفريق myotubes متعددة الأنوية.

الرقم 3
الرقم 3. العضلي الحقن الموسعة myoblasts في الماوس العضلات والهيكل العظمي. ج: X-غال تلطيخ myoblasts معزولة عن الفئران Myf5 + / nLacZ B، C: حقن العضلي Myf5 + / nLacZ myoblasts إلى TA العضلات. Myf5 + / nLacZ إلى تجديد الألياف العضلية. تم إجراء X-غال تلطيخ على TA العضلات حقنوا myoblasts بنسبة 1 الشهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، والخلايا الأقمار الصناعية هادئة يمكن تنقية بسهولة من العضلات والهيكل العظمي الكبار من الفئران عن طريق الهضم كولاجيناز والسطح بوساطة الأضداد MACS الانفصال. هذا الأسلوب يستغرق حوالي 6 ساعات و لا تحتاج إلى أي معدات باهظة الثمن مثل جهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا مقارنة مع السطح بوساطة الأضداد FACS الانفصال. ومن المتوقع أيضا أن عائدات أعلى من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة بالمقارنة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية لهذا الأسلوب منذ التعرض ليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية تميل للحث على موت الخلايا خلال الفصل 15. طرق عزل أخرى مثل preplating أو واحد من الألياف العضلية زراعة تتطلب بضعة أيام في الثقافة، وبالتالي، وهذه الأساليب هي جيدة لتنشيط الخلايا الأقمار الصناعية أو myoblast العزلة. ومع ذلك، الخلايا الأقمار الصناعية هادئة لا يمكن تنقيته من خلال هذه الأساليب. طرق Preplating استبعاد تلوث الخلايا الليفية على أساس الفرق بين تمسكهم الخلايا الأقمار الصناعية وتنشيط myoblastق 21. يحدث خلية الفضائية المنشط أو myoblast ثمرة واحدة خلال الثقافة الألياف العضلية 22. نحن أيضا لاحظت أن الفئران الأصغر سنا (القديمة 1-2 أشهر) تظهر عائدات أعلى من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة (1-5 × 10 5 / الماوس) تنقيته من خلال هذه الطريقة فصل MACS مقارنة مع الفئران الأكبر سنا. ومع ذلك، يتم تقليل نقاء الخلايا الأقمار الصناعية هادئة من العضلات التالفة بعد هذا السطح تنقية MACS بوساطة الأضداد منذ العضلات التالفة يحتوي على خلايا الدم أكثر اخترقتها. لفصل MACS الخلايا الأقمار الصناعية هادئة، ونحن تستخدم CD45، CD31، وهيئة السلع التموينية-1 كعلامات سطح الخلية لاختيار سلبية. CD45 هو صانع للخلايا المكونة للدم عموم؛ CD31 هي علامة للحصول على الخلايا البطانية؛ هيئة السلع التموينية-1 هو علامة لكلا الخلايا البطانية وخلايا الخلالية 23. لاختيار إيجابية، وتستخدم لمكافحة إنتغرين α7 ريتوكسيماب، التي بقع الخلايا الأقمار الصناعية هادئة وكذلك بعض الخلايا nonmuscle في العضلات والهيكل العظمي. عدة مجموعاتتستخدم أيضا α7 الأجسام المضادة لمكافحة إنتغرين لتنقية الخلايا الأقمار الصناعية القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية هادئة، بالاشتراك مع غيرها من اختيار الإيجابية والسلبية علامات 7،24. بالإضافة إلى ذلك، مجموعات أخرى تستخدم الأجسام المضادة ضد CXCR4 25، CD34 Syndecan-3 26، أو Syndecan-4 27 علامات الاختيار إيجابية لتنقية الخلايا الأقمار الصناعية القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية هادئة. تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة SM/C-2.6 أيضا لاختيار إيجابية في حين لم يتم التعرف على حاتمة لهذا الأضداد وحيدة النسيلة بعد 1. لا شيء من هذه العلامات الإيجابية هي اختيار هادئة الفضائية خلية محددة. وبالتالي، القضاء التام على مثل هذه الخلايا nonsatellite معربا عن هذه العلامات الإيجابية اختيار أمر ضروري للحصول على نقاء عالية من الخلايا الأقمار الصناعية هادئة بعد الفرز. قد يكون أكثر فائدة لاستخدام خلية محددة علامات سطح الخلية الأقمار الصناعية مثل M-كادهيرين كعلامة الاختيار إيجابية.

Fالخلايا الأقمار الصناعية هادئة معزولة reshly يمكن استخدامها لجين وبروتين تعبير وملامح، وتجارب زراعة للحصول على myoblasts وزرع الخلايا للتجارب الخلايا الأقمار الصناعية التجديد الذاتي، والعلاج بالخلايا. أظهرت الأعمال السابقة أن ملامح التعبير الجيني تختلف اختلافا كبيرا من الخلايا الأقمار الصناعية تفعيلها، وهو ما قد يفسر بعض الاختلافات البيولوجية بين هذه الأنواع الخلية اثنين (مثل الخلايا في مرحلة سبات مقابل. انقسام الخلايا النشطة) 1، 28. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن الخلايا الأقمار الصناعية هادئة معزولة حديثا تمتلك أعلى بكثير engraftment والنشاط التجديد الذاتي مقارنة مع الخلايا الأقمار الصناعية المنشط أو myoblasts عند زرعها في تجديد العضلات 6-7. على سبيل المثال، تظهر أقل من 100 الخلايا الأقمار الصناعية هادئة مساهمة قوية لتجديد الألياف العضلية وكذلك الخلايا الأقمار الصناعية تجديد الذات 5،7. وبالتالي، والخلايا الأقمار الصناعية هادئة يمكن عزلهاد اختبار لقدرتها على تدبر بكفاءة في العضلات التالفة، مساهمتها في الألياف العضلية التجديد، وتحسينها من وظيفة العضلات في المرضى DMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور Shahragim تاجبخش لتوفير الفئران Myf5 + / nLacZ. نشكر أيضا الكسندر Hron ومايكل Baumrucker لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الضمور العضلي (MDA) وغريغوري Marzolf جونيور جائزة مركز MD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics