בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה של תאי גזע הנדרשת לפיתוח שרירי שלד לאחר לידה והתחדשות, והיוו 2-5% מגרעיני sublaminal בסיבי שריר. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים. בעקבות פציעה, לעומת זאת, תאי לווין ליזום התרבות תאים לייצר myoblasts, progenies, לתווך ההתחדשות של שריר. השתלה של myoblasts תאים שמקורם בלווין נחקרה באופן נרחב כטיפול אפשרי למחל משובי כוללים ניוון שרירים, אי ספיקת לב, ובעיות בתפקוד אורולוגים. השתלת myoblast לתוך שריר dystrophic שלד, לב infarcted, וצינוריות שתן dysfunctioning הוכיחה כי myoblasts engrafted יכולה להתמיין לסיבי שריר ברקמות המארח ולהציג שיפור תפקודי חלקי במחלות אלה. לכן, הפיתוח של שיטות טיהור יעילה של תאי לווין רדומים מmuscl השלדדואר, כמו גם את הקמתה של תרבויות בלווין שמקורן בתאים והיצמדות למנגנון ושיטות השתלה לmyoblasts, הם חיוניים להבנת המנגנונים המולקולריים מאחורי התחדשות העצמית של תאי לווין, הפעלה, והבחנה. בנוסף, פיתוח הטיפולים מבוססי תאים לניוון שרירים ומחלות אחרות משובי תלויים גם בגורמים אלה.

עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל יקר תא מכונות (FACS). כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגרים ידי ניתוק האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. טרי מבודד אלהתאי לווין רדומים או myoblasts לשעבר הרחיבה vivo ניתן להשתיל לתוך cardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת עצמית והתחדשות פעילויות.

Introduction

תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה קטנה של תאי גזע myogenic ממוקמים מתחת lamina הבסיס של סיבי שריר שלד. הם מאופיינים על ידי הביטוי של Pax7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, וקלציטונין 3 - 1. תאי לווין הוכיחו להיות אחראי להתחדשות שרירים כמו שריר בתאי גזע. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים 4-8. בעקבות פציעה, תאי לווין מופעלים, ליזום ביטוי של MyoD, והזן את מחזור התא להרחבת צאצאיהם, המכונה תאים מבשר myogenic או myoblasts 3. לאחר כמה סיבובים של חלוקת תא, myoblasts לצאת ממחזור התא ונתיך אחד לשני כדי לעבור התמיינות לmyotubes רב גרעיני, ואחריו סיבי שריר בוגר. בקלות ניתן להרחיב Myoblasts מבודד משרירי מבוגרים vivo לשעבר. יכולת myoblasts להפוך לסיבי שריר בהתחדשות שריר ולצורת סיבי שריר מחוץ לרחם ברקמות nonmuscle מנוצלים על ידי השתלת היצמדות למנגנון, גישה טיפולית פוטנציאלית בניוון שרירים דושן (DMD) 4, חוסר תפקוד אורולוגית 9, ואי ספיקת לב 10. ואכן, myoblasts הושתלה בהצלחה בשרירים של שני עכברי MDX (מודל DMD) וחולי DMD 11-14. Myoblasts הנורמלית הזריקו הפתיל עם סיבי שריר מארח כדי לשפר את ההיסטולוגיה ותפקוד של השריר הפגוע. עבודות קודמות הראו כי אוכלוסיות של myoblasts הם יותר גזע דמוי תא ולהישאר במצב מובחן יותר בשריר במהלך התחדשות שרירים 5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי לווין מבודדים טרי משרירים בוגרים להכיל אוכלוסייה כמו תא גזע שמפגינה engraftment יעיל יותר ופעילות התחדשות עצמית בהתחדשות השריר 5-8. לכן, טיהור של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין רדומים מmu שלד המבוגרscle הוא חיוני להבנת הביולוגיה של תאי לווין, myoblasts והתחדשות שרירים, ולפיתוח טיפולים מבוססי תאים.

עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל תא מכונה יקר (FACS) 1,2,6-8. בנוסף, חשיפת לייזר FACS נוטה לגרום למוות של תאים בהפרדה, מה שגורם לתשואה נמוכה של תאי לווין שקטים 15. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגר. בשיטה זו משתמשת דיסוציאציה האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. כמו כן, אנו מראים כי זריקה תוך שרירית של תאים אלה מבודדים טריים שקטים לווין או לשעבר viניתן להשתיל myoblasts vo התרחבה לcardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת פעילות התחדשות עצמית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

החיות שוכנו בסביבת SPF והיו במעקב על ידי המשאבים בבעלי חיים למחקר (RAR) של אוניברסיטת מינסוטה. . החיות מורדמים באמצעים מתאימים (משאיפת CO 2 או הזרקת KCl לאחר שהרדים עם זריקת ה-IP של Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) כל הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC, מספר קוד: 1,304-30,492 ) מאוניברסיטת מינסוטה.

1. בידוד של תאי mononuclear משרירי שלד עכבר

  1. כראוי להקריב 1 או 2 עכברים בוגרים צעירים (3-8 שבועות).
    1. לצבוט ושסף את העור של הבטן במספריים חדים. לקלף את העור כדי להראות לחלוטין זרוע אחורית ושרירים גפיים אחוריות (למשוך את העור בכיוונים מנוגדים).
    2. הסר את כל שרירי הרגליים בשלד (שוקה קדמית, הגסטרוקנמיוס, והארבעה ראשיות) וזרוע האחורית לאורך העצמות במספריים. לאחר מכן להעביר לשרירים קרים כקרח, סטרילי PBS בצלחת 10 סנטימטר.
  2. שטוף דם משרירים בPBS ושרירים העברה לצלחת 6 סנטימטר סטרילי חדש: צלחת 1 ל1-2 עכברים.
  3. הסרת רקמת חיבור, כלי דם, צרורות עצבים ורקמות adipogenic תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  4. בעזרת מספריים לרפואת עיניים, לחתוך ולקצץ את הרקמה לתוך עיסה חלקה (איורים 1 א ו 1 ב '). נסה לא להשאיר חתיכות גדולות, כפי שהם לא מתפרקים בקלות על ידי פתרון האנזים.
  5. העבר את השרירים טחונים לתוך צינור מיליליטר פלקון 50, ולהוסיף 5 מיליליטר של תמיסת collagenase (0.2% סוג collagenase FBS 2 ב10% בDMEM). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  6. Triturate (למעלה ולמטה עם G מחט 18) לhomogenize תערובת (תרשים 1C). ואז עוד יותר דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  7. Triturate שוב לhomogenize תערובת להתפרקה להשעית תא בודדת. להוסיף 2% FBS בDMEM עד 50 מיליליטר לתוך ההשעיה התא בודדת ומערבביםכן.
  8. הנח מסננת תא (70 מיקרומטר) על גבי צינור מיליליטר פלקון 50 (1D איור). מעביר את supernatant המכיל את התאים ניתקו על גבי מסננת תא, ופיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה על המסנן עד שזה עובר.
  9. ספירת מספר תאים על ידי hemocytometer. צנטריפוגה הצינורות ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 למשך 5 דקות; לשאוב וזורקים supernatant.
  10. Resuspend עם FBS 10 מיליליטר של 2% בDMEM. צנטריפוגה הצינורות ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 למשך 5 דקות; לשאוב וזורקים supernatant.
  11. Resuspend עם 200 μl של 2% FBS DMEM ובהשעית תא העברה ל1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות. בדרך כלל, צריכים להיות שנקטפו על 2 x 10 6 תאים משרירים של עכבר 1. תאים יהיו מדוללים לריכוז של 1 x 10 6 תאים בשיעור של 2% FBS 100 μl DMEM.

2. נוגדן מכתים והפרדה עם MACS

במהלך יחסי הציבור הבאיםocedures, לשמור על תנאים סטריליים באמצעות מאגרי סטרילי. כל כרך של נוגדנים הוסיף ובינוני השעיה התא מחושב עבור תאים משרירים של עכבר 1 כולה. אם תאים נקצרים מן 2 או יותר עכברים, כמות של חומרים כימיים צריכה להיות מותאמת.

  1. הוסף 1 μl כל אחד מCD31-PE, CD45-PE, SCA-1-PE, והנוגדן α7 Integrin ל200 μl של ההשעיה התא. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
  2. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף FBS 1 מיליליטר של 2% בDMEM לתוך ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.
  3. לשאוב וזורקים supernatant.
  4. תאי resuspend עם 200 μl של 2% FBS בDMEM, ולהוסיף 10 μl של חרוזים מגנטיים Anti-PE. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
  5. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ MACS להשעית תא צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, ואז צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד זה TWקרח. שים לב שהתאים צריכים להיות נשטפו על ידי חיץ MACS לפני שמופרדים על ידי עמודה מגנטית.
  6. לשאוב וזורקים supernatant. Resuspend התאים עם 1.0 מיליליטר של חיץ MACS.
  7. הגדר את עמודת LD על לוח מגנטי, ולשטוף את העמודה עם 2.0 מיליליטר של חיץ MACS (איור 1E).
  8. מעביר את ההשעיה התא על טור LD, ולאסוף את החלק יחסי זרימה דרך לתוך צינור 1.5 מיליליטר. חלק זה מכיל תאי PE-שלילי.
  9. צנטריפוגה ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 במשך 3 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
  10. תאי resuspend עם 200 μl של 2% FBS בDMEM, ולהוסיף 10 μl של חרוזים מגנטיים אנטי העכבר IgG. לדגור על קרח במשך 30 דקות.
  11. שטוף תאים: לאחר דגירה, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ MACS לתוך ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר, ואז צנטריפוגות ב 2,000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לשאוב וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים. Resuspend תאים עם 500 μl של חיץ MACS.
  12. הגדר את עמודת MS על לוח מגנטי, ולשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ MACS (איור 1F).
  13. העברה מושעה פתרון תא על הטור בטרשת הנפוץ, וזורקים את החלק יחסי זרימת דרך (תאי α7 שליליים Integrin).
  14. לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ MACS, ולחזור על פעולה זו פעמיים.
  15. לאחר השטיפה, להסיר עמודה מהשדה המגנטי של מפריד. החל 1.0 מיליליטר של חיץ MACS על הטור, וelute תאי שכותרתו המגנטי (תאי α7 חיוביים Integrin) לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ידי דוחף את בוכנת המזרק מהחלק העליון של העמודה. לאסוף את הזרימה דרך לתוך צינור 1.5 מיליליטר. חזור על elution עם 1.5 מיליליטר של חיץ MACS ולאסוף את זרימת הדרך.
  16. צנטריפוגה ב 2,000 סל"ד ב-C ° 4 במשך 3 דקות, לשאוב וזורקים supernatant.
  17. Resuspend תאים מטוהרים עם 1 מיליליטר של היצמדות למנגנון בינוני (20% FBS הכיל כרעיים F-10 עם bFGF), ותאי צלחת על 10 סנטימטר Matrigel מצופהצלחת עם 8 מיליליטר של היצמדות למנגנון בינוני (5 מיליליטר ב6 צלחת סנטימטר) (איור 1G). שים לב שיכולים להיות מבודדים 1-2 x 10 5 תאים שעלולים להיות מיום 1 בשריר עכבר ללא פגע.

3. תחזוקה

  1. להאכיל את תאים בכל יום אחר עם מדיום והיצמדות למנגנון. המראה של myoblasts הגוברת הוא של צורה קטנה ועגולה המבטאת MyoD (איור 2) וPax7 (מידע לא מוצג) בגרעין שלהם.
  2. Myoblasts צריך להיות passaged לפני מפגש 50% או כאשר מתחילים איחוי תאים. לאחר שטיפת פעם עם PBS, דגירה תאים עם 0.25% פתרון טריפסין על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות בCO 2 באינקובטור ולאסוף תאים ניתק עם מדיום והיצמדות למנגנון. לאחר תאי צנטריפוגה (1,000 סל"ד במשך 5 דקות), להשעות עם מדיום והיצמדות למנגנון וreplate תאים על צלחות Matrigel מצופים חדשות. ניתן להשתמש בו צלחות מצופים קולגן לאחר חלוף 3. צלחת אחת בדרך כלל ניתן לפצל לשלוש עד חמש צלחות.

4. Differentiation

  1. Refeed עם בידול בינוני בכל יום אחר.
  2. ביום 1 בבידול בינוני, myoblasts לצאת ממחזור התא ולעבור התמיינות לשרשרת שרירן כבדה (MHC) חיובית myocytes. myoctyes אלה מתחילים איחוי תאים אחד עם השני כדי ליצור myotubes multinucleated. בדרך כלל, רוב myoblasts הפכה myocytes MHC-החיובי המבדיל מונונוקלארים או myotubes (איור 2) ביום 3-5 בבידול בינוני.

5. והיצמדות למנגנון השתלה לעכבר להתחדשות שריר שלד

  1. לטשטש את העכבר עם Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal (IP).
  2. לגלח את שיער העור סביב על שריר שוקה הקדמי (ת"א). עשרים וארבע שעות לפני ההשתלה והיצמדות למנגנון 10 מיקרומטר CTX (50 μl) מוזרק לתוך שריר לנוד / השרירים SCID עכבר ת"א כדי לגרום להתחדשות שריר באמצעות מזרק אינסולין ביום 31 בG דרך עור מגולח (איור60: 3).
  3. myoblasts מתרבות הם ניתקו עם 0.25% פתרון טריפסין, וcentrifuged ב 1,000 סל"ד למשך 5 דקות. לשאוב וזורקים supernatant. Resuspend 1 x 10 6 תאים עם 50 μl של 2% FBS DMEM. להעביר את התאים מושעים לתוך מזרק אינסולין ביום 31 G.
  4. עכברי נמען יהיו מורדמים עם Avertin (250 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקת ה-IP, ו1 x 10 6 myoblasts (איור 2) מוזרקות לתוך שריר תוך התחדשות השרירים ת"א.
  5. קציר ת"א שריר על ידי 1-4 שבועות לאחר הזרקת תאים לניתוח היסטולוגית (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי לווין שקטים מבודדים טרי להציג צורה קטנה ועגולה (איור 1G), וPax7 מפורש כסמן מובהק לתאי לווין שקטים. יותר מ 90% מתאים מבודדים טרי להביע Pax7 (איור 1H ו1I). תאים המזוהמים ביותר הם מתאי דם שאינו גדלים ביעילות במבחנה הבאה תנאי תרבות והיצמדות למנגנון. לפיכך, myoblasts תאים שמקורם בלווין שולטת בתרבות. לחלופין, אנו יכולים לחזור על השלבים לטיהור עמודת MS (שלבים 2.11-2.14) כדי להגדיל את טוהר של תאי לווין מבודדים. תאי לווין הרדומים אלה ייכנסו למחזור התא בתוך 24 שעות לאחר הבידוד לעבור תאים מבשר myogenic או myoblasts. ניתן passaged תאים אלה על ידי trypsinization כל 4 ימים עד לשיעור התפשטות תאים מצטמצם. בדרך כלל, יכולים להישמר תאים אלה עד מעבר 10. Myoblasts מתרבות אלה מבטאות MyoD ( (איור 2). לשעבר myoblasts הרחיבה vivo אלה יכול להיות מנוצל לניסויים בהזרקה תוך שרירית תא לבדיקה של תרומה והיצמדות למנגנון להתחדשות סיבי שריר ותאי לווין עצמי חידוש. עשרים וארבע שעות לפני הזרקת תאים, CTX מוזרק לתוך שרירים של עכברים עם מערכת חיסון חלש ת"א נוד / SCID 2 חודשים. myoblasts ניתקה מוזרקות לתוך שריר התחדשות-Induced CTX (איור 3). השריר המוזרק ניתן לקצור כמה ימים עד כמה חודשים לאחר הזרקה. תאי תורם בדרך כלל מסומנים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק גן (GFP) 6, גן β-galactosidase 16 phosphatase אלקליין 18 ידי transfection פלסמיד, זיהום וקטור ויראלי, או הכנה מעכברים הטרנסגניים שנשאו transgene. תאי לווין מMyf5 הטרוזיגוטיים + / nLacZ עכברים 19, שבו ניתן לאתר תאי myogenic לאחר צביעת X-gal, היו מבודדים. עכברי Myf5 + / nLacZ לשאת β הגרעיני -. גן galactosidase מוכנס לתוך לוקוס גן Myf5, שבו ביטוי גני β-galactosidase משחזר את הביטוי של Myf5 אנדוגני בשני תאי לווין ותאים מבשר myogenic או myoblasts 20 איור 3 מציג את כל ת"א צביעת שריר לצורך זיהוי של-β galactosidase חיובי תאים גרעיניים שמקורם בתורם, הכוללים myoblasts מתרבות, תאי לווין חידוש עצמי, וסיבי שריר חדש שנוצרו. במידת צורך, שרירי ת"א המוכתמים אלה יכולים לשמש להיסטולוגית se ctions לשיטות immunodetection נוספות.

איור 1
איור 1. הכנת תאי לווין בשרירים משריר שלד בעכבר. :. מיותר זרוע אחורית גזור ושרירים גפיים אחוריות על ידי מספריים B:. תצוגה מוגדלת של פנל C: triturating חתיכות שריר טחון שטופלה collagenase ידי 18 מחט G D:. Filtrating ניתק הכנת שריר על ידי מסננת תא E:. הפרדת MACS של ניתקה תאי שריר על ידי טור LD F:. הפרדת MACS של תאי שריר ניתק לפי עמודת MS G:.. תאי לווין מבודדים טרי H:. תאי לווין מבודדים טרי Pax7 החיובי אני: מכתים DAPI עבור G פנל.

ass = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 2
איור 2. תרבות של תאי לווין מבודדים. A, B, C: myoblasts נוגדנים חיוביים נגד MyoD שמקורם בתאי לווין מבודדים טרי D, E, F:. שרשרת Anti-שרירן כבד (MHC) חיובית הבחנה myotubes רב גרעיני.

איור 3
איור 3. זריקה תוך שרירית של myoblasts התרחבה לשרירי שלד עכבר. : צביעת X-gal של myoblasts מבודדת מעכברי Myf5 + / nLacZ B, C:. זריקה תוך שרירית של Myf5 + / nLacZ myoblasts לתוך שריר ת"א. Myf5 + / nLacZ תוך התחדשות סיבי שריר. צביעת X-gal בוצעה על שריר ת"א הוזרק myoblasts ידי 1 חודש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, יכול להיות מטוהר תאי לווין רדומים בקלות משרירי שלד מבוגרים של עכברים על ידי עיכול collagenase והפרדת MACS בתיווך נוגדני פני השטח. שיטה זו לוקחת בערך 6 שעות ולא צריכה שום ציוד יקר כגון מכונה FACS. בנוסף, שיטה זו היא זולה יחסית בהשוואה להפרדת FACS בתיווך נוגדני פני השטח. תשואה גבוהה יותר של תאי לווין שקטים צפויה גם בהשוואה לFACS לשיטה זו מאז חשיפת לייזר FACS נוטה לגרום למוות של תאים בהפרדה 15. שיטות בידוד אחרות כגון preplating או culturing סיב שריר בודד דורשות כמה ימים לתרבות, ובכך, שיטות אלה הן טובות לתאי לווין מופעלים או בידוד והיצמדות למנגנון. עם זאת, לא יכולים להיות מטוהרים תאי לווין רדומים בשיטות אלה. שיטות Preplating לשלול זיהום פיברובלסטים על בסיס הבדל דבקותם בין תאי לווין מופעלים והיצמדות למנגנוןזה 21. תולדת תא לווין Activated או היצמדות למנגנון מתרחשת במהלך התרבות סיבי שריר בודד 22. אנו מבחינים גם כי עכברים צעירים יותר (1-2 חודשים) להראות תשואה גבוהה יותר של תאים רדומים בלווין (1-5 x 10 5 / עכבר) מטוהרים על ידי שיטת הפרדת MACS זה בהשוואה לעכברים מבוגרים. עם זאת, טוהר של תאי לווין רדומים משריר פגוע מצטמצם לאחר טיהור MACS בתיווך נוגדני המשטח הזה מאז השריר הפגום מכיל תאי דם שחדר יותר. להפרדת MACS של תאי לווין שקטים, אנחנו מנוצלים CD45, CD31, וSCA-1 כסמנים פני תא לסלקציה שלילית. CD45 הוא יצרנית תאי הפאן hematopoietic; CD31 הוא סמן לתאי אנדותל; SCA-1 הוא סמן לשני תאי אנדותל ותאי ביניים 23. לבחירה החיובית, אנו מנוצלים נוגדן חד שבטי α7 אנטי Integrin, אשר כתמי תאי לווין שקטים, כמו גם כמה תאי nonmuscle בשרירי שלד. מספר קבוצותמנוצל גם נוגדן α7 אנטי Integrin לטיהור תאי לווין שקטים מבוססת FACS, בשילוב עם סלקציה חיובית ושלילית אחרת סמני 7,24. בנוסף, קבוצות אחרות מנוצלים נוגדנים נגד 25 CXCR4, 7 CD34, Syndecan-3 26, או Syndecan-4 27 סמני סלקציה חיוביים כלטיהור תאי לווין שקטים מבוססת FACS. נוגדן חד שבטי SM/C-2.6 שימש גם לסלקציה החיובית ואילו epitope לנוגדן חד שבטי זה לא זוהה עדיין 1. אף אחד מסמני הסלקציה החיוביים אלה הם תא ספציפי לווין שקט. לכן, חיסול תאי nonsatellite כזה מבטאים סמני סלקציה החיוביים אלה מלאים הוא חיוני להשגת טוהר גבוה של תאי לווין רדומים לאחר המיון. זה יכול להיות שימושי יותר להשתמש סמנים פני תא לווין תא ספציפי כגון M-cadherin כסמן סלקציה חיובי.

Fתאי לווין שקטים מבודדים reshly יכולים לשמש לפרופילים גנטיים וביטוי חלבונים, ניסויי התרבות להשיג myoblasts ותא השתלה לניסויי התחדשות העצמית של תאי לווין, וטיפולים בתאים. עבודות קודמות הראו כי פרופילי ביטוי גנים שונים באופן משמעותי מתאי לווין מופעלים, מה שעשוי להסביר חלק מההבדלים הביולוגיים בין שני סוגים אלה של התאים (כגון תאים בשלב הרדום לעומת. חטיבה פעילה תא) 1, 28. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי תאי לווין שקטים מבודדים טרי בעלי קליטתם ופעילות התחדשות עצמית גבוהות באופן משמעותי בהשוואה לתאי לווין מופעל או myoblasts כאשר הושתלו התחדשות השריר 6-7. לדוגמא, פחות מ 100 תאי לווין רדומים להראות תרומה חזקה להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי לווין עצמי חידוש 5,7. לכן, יכולים להיות מבודדים תאי לווין שקטיםד נבדק לפוטנציאל שלהם נקלטים ביעילות בשרירים פגועים, תרומתם להתחדשות סיבי שריר, ושיפורם של תפקוד שרירים בחולי DMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר Shahragim Tajbakhsh למתן עכברי Myf5 + / nLacZ. אנו מודים גם לאלכסנדר רון ומיכאל Baumrucker לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מניוון השרירים האגודה (מד"א) וגרגורי Marzolf ג'וניור MD מרכז פרס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics