स्नायु उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और ट्रांसप्लांटेशन

Biology

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Summary

मौन उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के अलगाव और संस्कृति, एक मांसपेशी स्टेम सेल आबादी, मांसपेशियों में स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और उत्थान, साथ ही मांसपेशियों और अन्य अपक्षयी रोगों में उपचार के लिए स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण की समझ के लिए आवश्यक है.

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Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

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Abstract

स्नायु उपग्रह कोशिकाओं मांसपेशी फाइबर में sublaminal नाभिक का 2-5% के लिए लेखांकन, प्रसव के बाद कंकाल की मांसपेशी विकास और उत्थान के लिए आवश्यक एक स्टेम सेल की आबादी हैं. वयस्क मांसपेशियों में उपग्रह कोशिकाओं सामान्य रूप से mitotically मौन हैं. चोट के बाद, हालांकि, उपग्रह कोशिकाओं की मांसपेशी के उत्थान के लिए मध्यस्थता करने के लिए myoblasts, उनके progenies, निर्माण करने के लिए सेलुलर प्रसार आरंभ. उपग्रह सेल व्युत्पन्न myoblasts का ट्रांसप्लांटेशन व्यापक रूप से पेशी dystrophy, दिल की विफलता, और मूत्र संबंधी रोग सहित कई पुनर्योजी रोगों के लिए एक संभव उपचार के रूप में अध्ययन किया गया है. Dystrophic कंकाल की मांसपेशी, infarcted दिल, और dysfunctioning मूत्र नलिकाओं में Myoblast प्रत्यारोपण engrafted myoblasts मेजबान ऊतकों में मांसपेशी फाइबर में अंतर है और इन बीमारियों में आंशिक कार्यात्मक सुधार प्रदर्शित कर सकते हैं कि दिखाया गया है. इसलिए, कंकाल muscl से मौन उपग्रह कोशिकाओं के कुशल शुद्धि के तरीकों का विकासई, के रूप में अच्छी तरह से उपग्रह सेल व्युत्पन्न myoblast संस्कृतियों और myoblasts के लिए प्रत्यारोपण के तरीकों की स्थापना के रूप में, उपग्रह सेल आत्म नवीकरण, सक्रियण, और भेदभाव के पीछे आणविक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक हैं. इसके अतिरिक्त, मांसपेशियों और अन्य पुनर्योजी रोगों के लिए सेल आधारित चिकित्सा का विकास भी इन कारकों पर निर्भर हैं.

हालांकि, मौन उपग्रह कोशिकाओं की मौजूदा भावी शुद्धि तरीकों महंगा प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) मशीनों के उपयोग की आवश्यकता. यहाँ, हम (एमएसीएस) छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल द्वारा पीछा एंजाइमी हदबंदी से वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी से मौन उपग्रह कोशिकाओं का तेजी से किफायती और विश्वसनीय शुद्धि के लिए एक नया तरीका मौजूद है. शुद्ध मौन उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के बाद इन कोशिकाओं को कई मार्ग के बाद myoblasts की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है. ये हौसले से अलगमौन उपग्रह कोशिकाओं या पूर्व vivo विस्तार myoblasts cardiotoxin में प्रत्यारोपित किया जा सकता है (CTX) मांसपेशी फाइबर regenerating के लिए दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी regenerating प्रेरित है, साथ ही आत्म नवीकरण की परीक्षा के लिए उपग्रह सेल के डिब्बों को गतिविधियों.

Introduction

स्नायु उपग्रह कोशिकाओं कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बेसल लामिना नीचे स्थित myogenic स्टेम कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी है. वे Pax7, Pax3, C-मिले, एम cadherin, CD34, Syndecan -3 की अभिव्यक्ति की विशेषता है, और कैल्सीटोनिन हैं 1 - 3. सैटेलाइट कोशिकाओं मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के रूप में पेशी के उत्थान के लिए जिम्मेदार साबित किया है. वयस्क मांसपेशियों में उपग्रह कोशिकाओं 4-8 सामान्य रूप से mitotically मौन हैं. चोट के बाद, उपग्रह कोशिकाओं MyoD की अभिव्यक्ति आरंभ, और उनकी संतान को बड़ा करने के लिए सेल चक्र में प्रवेश, सक्रिय कर रहे हैं, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं या myoblasts 3 करार दिया. कोशिका विभाजन के कई दौर के बाद, myoblasts परिपक्व मांसपेशी फाइबर द्वारा पीछा बहु nucleated myotubes, में भेदभाव से गुजरना करने के क्रम में एक दूसरे के लिए सेल चक्र और फ्यूज बाहर निकलें. वयस्क मांसपेशियों से अलग myoblasts आसानी पूर्व vivo विस्तार किया जा सकता है. मांसपेशी regenerating में और मांसपेशी फाइबर बनने के लिए myoblasts के लिए क्षमताnonmuscle ऊतकों में फार्म अस्थानिक मांसपेशी फाइबर myoblast प्रत्यारोपण, Duchenne पेशी dystrophy (डीएमडी) 4 लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण, मूत्र संबंधी शिथिलता 9, और दिल की विफलता के 10 से शोषण किया जाता है. दरअसल, myoblasts सफलतापूर्वक दोनों MDX (डीएमडी मॉडल) चूहों और DMD रोगियों 11-14 की मांसपेशी में प्रत्यारोपित किया गया है. इंजेक्शन सामान्य myoblasts रोगग्रस्त मांसपेशियों के ऊतक विज्ञान और समारोह में सुधार करने के लिए मेजबान मांसपेशी फाइबर के साथ फ्यूज. पिछला काम myoblasts की subpopulations अधिक सेल की तरह स्टेम और मांसपेशी पुनर्जनन 5 के दौरान मांसपेशियों में अब एक undifferentiated राज्य में रहते हैं जो प्रदर्शन किया. हाल ही में काम वयस्क मांसपेशियों से हौसले से अलग उपग्रह कोशिकाओं की मांसपेशी 5-8 regenerating में अधिक कुशल engraftment और आत्म नवीकरण गतिविधि दर्शाती है कि एक स्टेम सेल की तरह आबादी होते दिखाया गया है. इसलिए, वयस्क कंकाल म्यू से मौन उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी की शुद्धिscle उपग्रह कोशिकाओं, myoblasts और मांसपेशियों उत्थान के जीव विज्ञान को समझने के लिए, और सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है.

हालांकि, मौन उपग्रह कोशिकाओं की मौजूदा भावी शुद्धि तरीकों एक महंगी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) मशीन 1,2,6-8 के उपयोग की आवश्यकता. इसके अलावा, FACS लेजर जोखिम मौन उपग्रह कोशिकाओं 15 की कम उपज के कारण होता है जो जुदाई के दौरान कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए जाता है. यहाँ, हम वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी से मौन उपग्रह कोशिकाओं का तेजी से किफायती और विश्वसनीय शुद्धि के लिए एक नया तरीका मौजूद है. इस विधि (एमएसीएस) छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल द्वारा पीछा एंजाइमी हदबंदी का इस्तेमाल करता. शुद्ध मौन उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के बाद इन कोशिकाओं को कई मार्ग के बाद myoblasts की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम यह भी पता चलता है कि इन हौसले से अलग मौन उपग्रह कोशिकाओं या पूर्व छठी की इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शनVo विस्तार myoblasts cardiotoxin में प्रत्यारोपित किया जा सकता है (CTX) मांसपेशी फाइबर, साथ ही आत्म नवीकरण गतिविधियों की जांच के लिए उपग्रह सेल के डिब्बों को regenerating के लिए दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी regenerating प्रेरित.

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Protocol

जानवरों के एक एसपीएफ़ वातावरण में रखे थे और रिसर्च पशु संसाधन मिनेसोटा विश्वविद्यालय के (rar) द्वारा निगरानी की गई. . जानवर (Avertin (250 मिलीग्राम / किग्रा) के आईपी इंजेक्शन के साथ anesthetized होने के बाद सीओ 2 साँस लेना या KCl इंजेक्शन उचित साधन के द्वारा euthanized थे सभी प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC, कोड नंबर द्वारा अनुमोदित किया गया: 1304-30492 ) मिनेसोटा विश्वविद्यालय के.

माउस कंकाल की मांसपेशी से mononuclear कोशिकाओं की 1. अलगाव

  1. ठीक से 1 या 2 युवा वयस्क चूहों (3-8 सप्ताह) बलिदान.
    1. चुटकी और तेज कैंची के साथ पेट की त्वचा भट्ठा. पूरी तरह से (दिशाओं विरोध में त्वचा खींच) triceps और पिछले अंग मांसपेशियों को दिखाने के लिए त्वचा से छील.
    2. कैंची से हड्डियों के साथ सभी पैर कंकाल की मांसपेशियों (tibialis पूर्वकाल, gastrocnemius, और quadriceps) और triceps निकालें. फिर एक 10 सेमी की थाली में बर्फ ठंड, बाँझ पीबीएस के लिए मांसपेशियों का स्थानांतरण.
  2. एक नए बाँझ 6 सेमी थाली पीबीएस में मांसपेशियों और स्थानांतरण की मांसपेशियों को रक्त से धो लें: 1 प्लेट 1-2 चूहों के लिए.
  3. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे संयोजी ऊतक, रक्त वाहिकाओं, तंत्रिका बंडलों, और वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला ऊतक निकालें.
  4. (आंकड़े 1 ए और 1 बी) में कटौती और एक चिकनी लुगदी में ऊतक कीमा, नेत्र विज्ञान के लिए कैंची का उपयोग करना. वे एंजाइम समाधान द्वारा आसानी से नीचे नहीं तोड़ा जाएगा, के रूप में बड़े टुकड़ों को छोड़ने के लिए नहीं की कोशिश करें.
  5. एक फाल्कन 50 मिलीलीटर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ मांसपेशियों स्थानांतरण, और collagenase समाधान (0.2% collagenase प्रकार DMEM में 2 से 10 में% FBS) के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  6. Triturate (ऊपर और नीचे एक 18 जी सुई के साथ) मिश्रण (चित्रा 1C) homogenize के लिए. तो फिर आगे के 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं.
  7. एकल कक्ष निलंबन में अलग कर देना करने के लिए मिश्रण homogenize करने के लिए फिर से Triturate. ऊपर एकल कक्ष निलंबन में 50 मिलीलीटर DMEM में 2% FBS और मिश्रण जोड़ेंअच्छी तरह से.
  8. एक फाल्कन 50 मिलीलीटर ट्यूब (चित्रा -1) पर एक सेल झरनी (70 माइक्रोन) रखें. एक सेल झरनी पर अलग कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, और यह माध्यम से गुजरता है जब तक ऊपर और नीचे फिल्टर पर सेल निलंबन पिपेट.
  9. Hemocytometer द्वारा सेल संख्या की गणना. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों; महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  10. DMEM में 10 मिलीलीटर की 2% FBS के साथ Resuspend. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों; महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  11. 200 DMEM में 2% FBS μl और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण सेल निलंबन के साथ Resuspend. आमतौर पर, के बारे में 2 x 10 6 कोशिकाओं 1 माउस की मांसपेशियों से काटा जाना चाहिए. कोशिकाओं DMEM में 2% FBS की 100 μl में 1 x 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए पतला हो जाएगा.

2. एंटीबॉडी धुंधला और एमएसीएस के साथ पृथक्करण

निम्नलिखित जनसंपर्क के दौरानocedures, बाँझ बफ़र्स का उपयोग करके बाँझ स्थिति बनाए रखने. एंटीबॉडी के प्रत्येक मात्रा गयी और सेल निलंबन मध्यम 1 माउस की सारी मांसपेशियों से कोशिकाओं के लिए गणना की है. कोशिकाओं 2 या अधिक चूहों से काटा जाता है, तो अभिकर्मकों की राशि अनुकूलित किया जाना चाहिए.

  1. 1 μl CD31-पीई, CD45-पीई, एससीए-1-पीई, और सेल निलंबन के 200 μl में Integrin α7 एंटीबॉडी में से प्रत्येक में जोड़ें. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  2. कोशिकाओं को धो लें: ऊष्मायन के बाद, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन में DMEM में 1 मिलीलीटर में 2 से% FBS जोड़ने के लिए, और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. दो बार इस चरण को दोहराएँ.
  3. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  4. 200 DMEM में 2% FBS μl, और विरोधी पीई चुंबकीय मोतियों की 10 μl जोड़ने के साथ कोशिकाओं Resuspend. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  5. कोशिकाओं को धो लें: ऊष्मायन के बाद, 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन को एमएसीएस बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने, और फिर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. इस कदम TW दोहराएँबर्फ. कोशिकाओं चुंबकीय स्तंभ से अलग होने से पहले एमएसीएस बफर से धोया जाना चाहिए ध्यान दें.
  6. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. एमएसीएस बफर के 1.0 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं Resuspend.
  7. एक चुंबकीय बोर्ड पर एलडी स्तंभ सेट करें, और एमएसीएस बफर (चित्रा 1E) के 2.0 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला.
  8. एलडी स्तंभ पर सेल निलंबन स्थानांतरण, और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से अंश एकत्र. इस अंश पीई नकारात्मक सेल शामिल हैं.
  9. 3 मिनट, महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  10. 200 DMEM में 2% FBS μl, और विरोधी माउस आईजीजी चुंबकीय मोतियों की 10 μl जोड़ने के साथ कोशिकाओं Resuspend. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  11. कोशिकाओं को धो लें: ऊष्मायन के बाद, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन में एमएसीएस बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने, और फिर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दो बार इस चरण को दोहराएँ. एमएसीएस बफर के 500 μl के साथ कोशिकाओं Resuspend.
  12. एक चुंबकीय बोर्ड पर एमएस स्तंभ सेट करें, और एमएसीएस बफर (चित्रा 1F) के 500 μl के साथ स्तंभ कुल्ला.
  13. स्थानांतरण एमएस स्तंभ पर सेल समाधान निलंबित, और प्रवाह के माध्यम से अंश (Integrin α7 नकारात्मक कोशिकाओं) त्यागें.
  14. एमएसीएस बफर के 1 एमएल के साथ कुल्ला, और दो बार इस चरण को दोहराएँ.
  15. Rinsing के बाद, विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटा दें. स्तंभ पर एमएसीएस बफर के 1.0 मिलीलीटर लागू करें, और स्तंभ के ऊपर से सिरिंज सवार धक्का द्वारा एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में चुंबकीय लेबल कोशिकाओं (Integrin α7 पॉजिटिव कोशिकाओं) elute. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए. एमएसीएस बफर के 1.5 मिलीलीटर के साथ क्षालन दोहराएँ और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
  16. 3 मिनट, महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  17. Myoblast माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ शुद्ध कोशिकाओं Resuspend (20% FBS bFGF साथ Hams एफ -10 निहित), और Matrigel लेपित 10 सेमी पर थाली कोशिकाओंMyoblast मध्यम के 8 एमएल (6 सेमी थाली में 5 एमएल) (चित्रा 1G) के साथ प्लेट. 1-2 x 10 5 कोशिकाओं संभावित 1 बरकरार माउस पेशी से अलग किया जा सकता है ध्यान दें.

3. रखरखाव

  1. Myoblast माध्यम के साथ हर दूसरे दिन कोशिकाओं फ़ीड. बढ़ रही myoblasts की उपस्थिति उनके नाभिक में MyoD (चित्रा 2) और Pax7 (डेटा) नहीं दिखाया व्यक्त एक छोटे और गोल आकार की है.
  2. सेल संलयन शुरू करने पर myoblasts 50% संगम से पहले passaged या किया जाना चाहिए. पीबीएस के साथ एक बार rinsing के बाद, सीओ 2 इनक्यूबेटर में 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% trypsin समाधान के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और Myoblast माध्यम के साथ अलग कोशिकाओं को इकट्ठा. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (5 मिनट के लिए 1000 rpm) के बाद, Myoblast माध्यम के साथ निरस्त करने और नए Matrigel में लिपटे प्लेटों पर कोशिकाओं replate. कोलेजन में लिपटे प्लेटों पारित होने के बाद 3 इस्तेमाल किया जा सकता है. एक थाली आमतौर पर 3-5 प्लेटों में विभाजित किया जा सकता है.

4. Differentiation

  1. हर दूसरे दिन भेदभाव मध्यम साथ Refeed.
  2. भेदभाव मध्यम में दिन 1, myoblasts सेल चक्र से बाहर निकलें और मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) पॉजिटिव myocytes में भेदभाव से गुजरना. ये myoctyes multinucleated myotubes उत्पन्न करने के लिए एक दूसरे के साथ सेल संलयन शुरू करते हैं. आमतौर पर, सबसे myoblasts MHC-सकारात्मक फर्क मोनोन्यूक्लियर myocytes या myotubes भेदभाव मध्यम में दिन में 3-5 से चित्रा (2) हो जाते हैं.

कंकाल की मांसपेशी के उत्थान के लिए माउस में 5. Myoblast ट्रांसप्लांटेशन

  1. Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा Avertin (250 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस बेहोश करना.
  2. Tibialis पूर्वकाल (टीए) पेशी पर त्वचा बालों के चारों ओर दाढ़ी. चौबीस घंटे myoblast प्रत्यारोपण से पहले, 10 माइक्रोन CTX (50 μl) intramuscularly मुंडा त्वचा (चित्रा के माध्यम से एक 31 जी इंसुलिन सिरिंज के माध्यम से पेशी उत्थान के लिए प्रेरित करने के लिए इशारा / SCID माउस प्रादेशिक सेना की मांसपेशी में इंजेक्शन है60, 3).
  3. Proliferating myoblasts 0.25% trypsin समाधान के साथ अलग, और 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर centrifuged हैं. महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. DMEM में 2% FBS की 50 μl के साथ Resuspend 1 x 10 6 कोशिकाओं. एक 31 जी इंसुलिन सिरिंज में निलंबित कोशिकाओं स्थानांतरण.
  4. प्राप्तकर्ता चूहों आईपी इंजेक्शन द्वारा Avertin (250 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ anaesthetized किया जाएगा, और 1 x 10 6 myoblasts (चित्रा 2) intramuscularly टीए मांसपेशी regenerating में इंजेक्ट किया जाता है.
  5. ऊतकीय विश्लेषण के लिए सेल इंजेक्शन (चित्रा 3) के बाद 1-4 सप्ताह से हार्वेस्ट टीए पेशी.

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Representative Results

हौसले से अलग मौन उपग्रह कोशिकाओं मौन उपग्रह कोशिकाओं के लिए एक निश्चित मार्कर के रूप में एक छोटे, गोल आकार (चित्रा 1G), और एक्सप्रेस Pax7 प्रदर्शित करते हैं. हौसले से अलग कोशिकाओं के 90% से अधिक Pax7 (चित्रा 1H और 1 मैं) व्यक्त करते हैं. सबसे दूषित कोशिकाओं कुशलतापूर्वक myoblast संस्कृति शर्तों का पालन विट्रो में जाना नहीं है जो रक्त कोशिकाओं से कर रहे हैं. इस प्रकार, उपग्रह सेल व्युत्पन्न myoblasts संस्कृति में हावी. वैकल्पिक रूप से, हम अलग उपग्रह कोशिकाओं की शुद्धता बढ़ाने के लिए (2.11-2.14 कदम) एमएस स्तंभ शुद्धि के लिए कदम को दोहरा सकते हैं. ये मौन उपग्रह कोशिकाओं myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं या myoblasts गुजरना करने के अलगाव के बाद 24 घंटे के भीतर सेल चक्र में प्रवेश करेंगे. सेल प्रसार दर कम हो जाता है जब तक इन कोशिकाओं को हर 4 दिनों trypsinization द्वारा passaged किया जा सकता है. आमतौर पर, इन कोशिकाओं बीतने 10 तक बनाए रखा जा सकता है. इन proliferating myoblasts (MyoD व्यक्त चित्रा (2) MHC व्यक्त जो multinucleated myotubes, हो जाते हैं. ये पूर्व vivo विस्तार myoblasts मांसपेशी फाइबर और स्वयं renewing उपग्रह कोशिकाओं regenerating को myoblast योगदान की परीक्षा के लिए इंट्रामस्क्युलर सेल इंजेक्शन प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है. चौबीस घंटे सेल इंजेक्शन से पहले, CTX 2 महीने की उम्र में इशारा / SCID immunodeficient चूहों की प्रादेशिक सेना की मांसपेशियों में इंजेक्शन है. अलग myoblasts CTX प्रेरित Regenerating मांसपेशी (चित्रा 3) में इंजेक्ट किया जाता है. इंजेक्शन पेशी इंजेक्शन के बाद कई महीनों के लिए कुछ दिनों काटा जा सकता है. दाता कोशिकाओं आम तौर पर आनुवंशिक रूप से हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जीन 6, β-galactosidase जीन 16 से चिह्नित कर रहे हैं alkaline फॉस्फेट जीन 18. Myogenic कोशिकाओं एक्स लड़की धुंधला करने के बाद पता लगाया जा सकता है जिसमें विषमयुग्मजी Myf5 + / nLacZ चूहों 19 से सैटेलाइट कोशिकाओं, अलग थे. Myf5 + / nLacZ चूहों परमाणु β ले -. Β-galactosidase जीन अभिव्यक्ति उपग्रह कोशिकाओं और myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं या myoblasts 20 दोनों में अंतर्जात Myf5 की अभिव्यक्ति का स्मरण दिलाता है जहां Myf5 जीन ठिकाना, में डाला galactosidase जीन 3 पूरे टीए पता चलता है proliferating myoblasts, स्वयं renewing उपग्रह कोशिकाओं, और नवगठित मांसपेशी फाइबर शामिल हैं, जो परमाणु β-galactosidase पॉजिटिव दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पेशी धुंधला हो जाना. यदि आवश्यक हो, इन दाग प्रादेशिक सेना की मांसपेशियों ऊतकीय एसई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैआगे immunodetection तरीकों के लिए ctions.

चित्रा 1
माउस कंकाल की मांसपेशी से मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के चित्रा 1. तैयारी. एक:. कैंची से विच्छेदित triceps और पिछले अंग मांसपेशियों क़ीमा बी:. पैनल की आवर्धक अवलोकन सी:. 18 जी सुई डी द्वारा collagenase इलाज कीमा बनाया हुआ मांसपेशियों टुकड़े Triturating: Filtrating सेल झरनी द्वारा पेशी तैयारी अलग ई:. की एमएसीएस जुदाई अलग एलडी स्तंभ से मांसपेशियों की कोशिकाओं एफ:. एमएस स्तंभ से अलग मांसपेशियों की कोशिकाओं की एमएसीएस जुदाई जी:.. हौसले से अलग उपग्रह कोशिकाओं एच:. Pax7 पॉजिटिव हौसले से अलग उपग्रह कोशिकाओं मैं: पैनल जी के लिए DAPI धुंधला.


पृथक उपग्रह कोशिकाओं के चित्रा 2. संस्कृति. ए, बी, सी:. विरोधी मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) पॉजिटिव बहु nucleated myotubes फर्क: हौसले से अलग उपग्रह कोशिकाओं डी, ई, एफ से व्युत्पन्न विरोधी MyoD एंटीबॉडी पॉजिटिव myoblasts.

चित्रा 3
चित्रा 3. माउस कंकाल की मांसपेशी में विस्तार myoblasts के intramuscular इंजेक्शन. एक: Myf5 + / nLacZ चूहों से अलग myoblasts की एक्स लड़की धुंधला बी, सी:. प्रादेशिक सेना की मांसपेशी में Myf5 + / nLacZ myoblasts के intramuscular इंजेक्शन. Myf5 + / nLacZ चूहों से अलग इंजेक्शन myoblasts की एकता. एक्स लड़की धुंधला 1 महीने myoblasts इंजेक्शन के साथ टीए पेशी पर प्रदर्शन किया गया था.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, मौन उपग्रह कोशिकाओं को आसानी collagenase पाचन और सतह एंटीबॉडी की मध्यस्थता एमएसीएस जुदाई से चूहों की वयस्क कंकाल की मांसपेशी से शुद्ध किया जा सकता है. इस विधि में लगभग 6 घंटे का समय लगता है और इस तरह एक FACS मशीन के रूप में किसी भी महंगे उपकरण की जरूरत नहीं है. इसके अलावा, इस विधि सतह एंटीबॉडी की मध्यस्थता FACS जुदाई की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ती है. FACS लेजर जोखिम जुदाई 15 के दौरान कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए जाता, क्योंकि मौन उपग्रह कोशिकाओं के एक उच्च उपज भी इस विधि के लिए FACS की तुलना में होने की संभावना है. ऐसे preplating या एक मांसपेशी फाइबर संवर्धन के रूप में अन्य अलगाव तरीकों संस्कृति के लिए कुछ दिनों की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार, इन तरीकों में सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं या myoblast अलगाव के लिए अच्छे हैं. हालांकि, मौन उपग्रह कोशिकाओं इन विधियों द्वारा शुद्ध नहीं किया जा सकता. Preplating तरीकों सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं और myoblast के बीच उनके पालन अंतर के आधार पर fibroblast संदूषण को बाहर21. सक्रिय उपग्रह सेल या myoblast परिणाम एक मांसपेशी फाइबर संस्कृति 22 के दौरान होता है. हम भी (1-2 महीने पुराने) युवा चूहों बड़े चूहों की तुलना में इस एमएसीएस जुदाई विधि द्वारा शुद्ध मौन उपग्रह कोशिकाओं (1-5 एक्स 10 5 / माउस) के एक उच्च उपज बताते हैं कि सूचना के. क्षतिग्रस्त मांसपेशियों में अधिक घुसपैठ की रक्त कोशिकाएं होती हैं लेकिन, जब से क्षतिग्रस्त मांसपेशियों से मौन उपग्रह कोशिकाओं की पवित्रता को इस सतह एंटीबॉडी की मध्यस्थता एमएसीएस शुद्धि के बाद कम हो जाता है. मौन उपग्रह कोशिकाओं की एमएसीएस जुदाई के लिए, हम नकारात्मक चयन के लिए कोशिका की सतह मार्कर के रूप में CD45, CD31, और एससीए-1 का उपयोग किया. CD45 अखिल hematopoietic कोशिकाओं के लिए एक निर्माता है; CD31 endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है; एससीए -1 endothelial कोशिकाओं और बीचवाला कोशिकाओं 23 दोनों के लिए एक मार्कर है. सकारात्मक चयन के लिए, हम मौन उपग्रह कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कंकाल की मांसपेशी में कुछ nonmuscle कोशिकाओं दाग जो एक विरोधी Integrin α7 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, उपयोग किया. कई समूहोंभी अन्य सकारात्मक और नकारात्मक चयन के साथ संयोजन में, FACS आधारित मौन उपग्रह सेल शुद्धि के लिए एक विरोधी Integrin α7 एंटीबॉडी का उपयोग किया 7,24 मार्करों. इसके अलावा, अन्य समूहों CXCR4 25, CD34 7, Syndecan -3 26, या Syndecan-4 FACS आधारित मौन उपग्रह सेल शुद्धि के लिए 27 के रूप में सकारात्मक चयन मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया. इस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए मिलान अभी तक 1 की पहचान नहीं की गई है, जबकि एक SM/C-2.6 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भी सकारात्मक चयन के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन सकारात्मक चयन मार्कर से कोई भी मौन उपग्रह सेल विशिष्ट हैं. इसलिए, इन सकारात्मक चयन मार्कर व्यक्त ऐसी nonsatellite कोशिकाओं के पूर्ण उन्मूलन छंटाई के बाद मौन उपग्रह कोशिकाओं की उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यह एक सकारात्मक चयन मार्कर के रूप में इस तरह के एम cadherin के रूप में उपग्रह सेल विशिष्ट कोशिका की सतह मार्कर का उपयोग करने के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है.

एफreshly पृथक मौन उपग्रह कोशिकाओं जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, myoblasts और उपग्रह सेल आत्म नवीकरण प्रयोगों के लिए कोशिका प्रत्यारोपण प्राप्त करने के लिए संस्कृति प्रयोगों, और सेल उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिछले काम जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल 1, 28 (जैसे. सक्रिय कोशिका विभाजन बनाम निष्क्रिय चरण में कोशिकाओं के रूप में) इन दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच जैविक मतभेद के कुछ समझा जा सकता है, जो सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं से काफी अलग हैं कि प्रदर्शन किया. हाल ही में काम मांसपेशी 6-7 regenerating में प्रत्यारोपित जब हौसले से अलग मौन उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं या myoblasts की तुलना में काफी अधिक engraftment और आत्म नवीकरण गतिविधि के अधिकारी है कि प्रदर्शन किया है. उदाहरण के लिए, कम से कम 100 मौन उपग्रह कोशिकाओं स्वयं renewing उपग्रह कोशिकाओं 5,7 के लिए मांसपेशी फाइबर regenerating के साथ ही करने के लिए मजबूत योगदान दिखा. इसलिए, मौन उपग्रह कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है एककुशलता से क्षतिग्रस्त मांसपेशियों, मांसपेशी फाइबर के उत्थान के लिए उनके योगदान, और DMD रोगियों में पेशी समारोह के उनके सुधार में टीका लगाना करने के लिए अपनी क्षमता के लिए परीक्षण होगी.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम Myf5 + / nLacZ चूहों को उपलब्ध कराने के लिए डा. Shahragim Tajbakhsh धन्यवाद. हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए अलेक्जेंडर Hron और माइकल Baumrucker धन्यवाद. इस काम पेशी Dystrophy एसोसिएशन (एमडीए) और ग्रेगरी Marzolf जूनियर एमडी केंद्र पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

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