Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Выделение и культура чистой популяции покоящихся сателлитных клеток, мышц стволовых клеток населения, имеет важное значение для понимания мышечной биологии стволовых клеток и регенерации, а также трансплантации стволовых клеток для лечения в мышечной дистрофии и других дегенеративных заболеваний.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мышцы спутниковые клетки стволовых клеток населения необходимы для постнатального развития скелетных мышц и регенерации, что составляет 2-5% от sublaminal ядер в мышечных волокнах. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя. После травмы, однако, сателлитные клетки инициировать пролиферацию клеток, чтобы произвести миобластов, их потомство, посреднические регенерацию мышц. Трансплантация клеток, полученных миобластов спутниковых был широко изучен в качестве возможного лечения в течение нескольких регенеративных заболеваний, включая мышечную дистрофию, сердечной недостаточности, и урологической дисфункции. Трансплантация миобластов в дистрофических скелетных мышцах, инфаркта сердца, и неблагополучных мочевыводящих протоков показал, что привитые миобласты могут дифференцироваться в мышечные волокна в ткани хозяина и отображения частичное функциональное улучшение в этих заболеваний. Таким образом, разработка эффективных способов очистки покоящихся сателлитных клеток из скелетной MUSCLэ, а также созданию клеточных полученных культур миобластов спутниковых и методов трансплантации для миобластов, имеют важное значение для понимания молекулярных механизмов позади спутниковым клеток к самообновлению, активации и дифференциации. Кроме того, развитие клеточной терапии для мышечной дистрофии и других заболеваний регенеративных также зависит от этих факторов.

Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS машин). Здесь мы представляем новый метод для быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мыши скелетных мышцах по ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Эти Свежевыделенныепокоящиеся клетки-сателлиты или Экс Vivo расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток в регенерации мышечных волокон, а также спутниковое клеток отделениями для рассмотрения самообновления деятельность.

Introduction

Мышцы спутниковые клетки небольшая популяция миогенных стволовых клеток, расположенных под базальной пластинки скелетных мышечных волокон. Они характеризуются выражением Pax7, Pax3, с-Met, М-кадгерина, CD34, синдекана-3, и кальцитонин 1 - 3. Спутниковые клетки оказались ответственны за регенерации мышц как мышечных стволовых клеток. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя 4-8. После травмы, спутниковые клетки активируются, инициировать выражение MyoD и введите клеточный цикл, чтобы расширить свое потомство, называется миогенные клетки-предшественники или миобластов 3. После нескольких раундов деления клеток, миобластов выхода из цикла и предохранитель клеток друг с другом для того, чтобы пройти дифференцировку в мульти-дерных мышечных трубок, после чего зрелый мышечных волокон. Миобласты выделенные из взрослой мышцы легко может быть расширена экс естественных. Способность к миобластов стать мышечные волокна в регенерации мышц иформа внематочной мышечные волокна в немышечно тканей эксплуатируется трансплантации миобластов, потенциальный терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) 4, урологической дисфункции 9, и сердечной недостаточности 10. Действительно, миобласты успешно пересадили в мышцах обеих MDX (ДМД модель) мышей и пациентов с МДД 11-14. Инъецированные нормальные миобласты сливаться с хост мышечных волокон для улучшения гистологии и функции пораженного мышцы. Предыдущая работа показала, что субпопуляции миобластов более стволовых клеток, как и остаются в недифференцированном состоянии больше в мышцах во время регенерации мышечной 5. Последние исследования показали, что свежевыделенных спутниковые клетки из взрослых мышцы содержат клетки, как население штока, которая демонстрирует более эффективное приживление и самообновлению деятельность в регенерации мышц 5-8. Таким образом, очистка чистой популяции покоящихся сателлитных клеток из взрослых скелетных муSCLE имеет важное значение для понимания биологии сателлитных клеток, миобластов и регенерации мышц, и для развития клеточной терапии.

Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS) машины 1,2,6-8. Кроме того, FACS лазерное облучение имеет тенденцию вызывать гибель клеток в процессе разделения, которое вызывает низкий выход покоящихся клеток спутников 15. Здесь мы представляем новый метод быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мышей скелетных мышцах. Этот метод использует ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Показано также, что внутримышечные инъекции этих свежевыделенных покоящихся сателлитных клеток или экс VIВ.О. расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток к регенерации мышечных волокон, а также в отделениях спутниковых клеток для рассмотрения самообновления деятельности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животных содержали в условиях SPF и контролировались исследовательских животных ресурсов (RAR) из Университета Миннесоты. . Животных умерщвляли с помощью соответствующих средств (СО 2 ингаляции или KCl инъекции после того, как под наркозом с IP инъекции Avertin (250 мг / кг) Все протоколы были одобрены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC, кодовый номер по: 1304-30492 ) из Университета Миннесоты.

1. Выделение мононуклеарных клеток из мыши скелетных мышц

  1. Правильно пожертвовать 1 или 2 молодых взрослых мышей (3-8 недели).
    1. Pinch и разрезать кожу живота с острыми ножницами. Снимите кожу, чтобы полностью показать трицепсы и мышцы задней конечности (потяните кожу в противоположных направлениях).
    2. Удалите все ноги скелетных мышц (передней большеберцовой, икроножной и четырехглавой) и трицепсы вдоль костей с ножницами. Затем трансфер мышцы ледяной стерильной PBS в 10 см пластины.
  2. Вымойте кровь с мышцы в PBS и мышцы передачи на новый стерильный 6 см Столешница: 1 тарелку на 1-2 мышей.
  3. Удалить соединительную ткань, кровеносные сосуды, нервные пучки и Adipogenic ткани под микроскопом рассечение.
  4. С помощью ножниц для офтальмологии, вырезать и фарш ткани в гладкую целлюлозы (фиг. 1A и 1B). Старайтесь не оставлять большие куски, так как они не будут разбиты готовностью ферментного раствора.
  5. Трансфер фарш мышцы в мл трубки Falcon 50, и добавляют 5 мл раствора коллагеназы (0,2% коллагеназы типа 2 в 10% FBS в DMEM). Инкубировать при 37 ° С в течение 60 мин.
  6. Triturate (вверх и вниз с 18 G иглы) гомогенизации смеси (рис. 1в). Затем дополнительно инкубировать смеси при 37 ° С в течение 15 мин.
  7. Растирают снова гомогенизировать смесь диссоциировать в суспензии отдельных клеток. Добавить 2% FBS в DMEM до 50 мл в суспензии отдельных клеток и смешатьхорошо.
  8. Наведите сотовый сетчатый фильтр (70 мкм) на Falcon 50 мл трубки (рис. 1D). Передача супернатант, содержащий диссоциированных клеток на клеточный фильтр и пипетки клеточной суспензии вверх и вниз на фильтре, пока он не проходит.
  9. Подсчитать количество клеток, гемоцитометре. Центрифуга трубки на 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин; аспирации и отбросить супернатант.
  10. Ресуспендируют с 10 мл 2% FBS в DMEM. Центрифуга трубки на 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 мин; аспирации и отбросить супернатант.
  11. Ресуспендируют с 200 мкл 2% FBS в DMEM и передачи клеточной суспензии в 1,5 мл микропробирок. Как правило, около 2 × 10 6 клетки должны быть собраны из мышц 1 мыши. Клетки будут разбавлены до концентрации 1 × 10 6 клеток в 100 мкл 2% FBS в DMEM.

2. Антитела Окрашивание и разлуки с MACS

В течение следующего прocedures, поддержания стерильных условий с помощью стерильных буферов. Каждый том антител добавил и суспензию клеток среднего рассчитывается для клеток из целых мышц 1 мыши. Если клетки собирают из 2 или более мышей, количество реагентов должны быть оптимизированы.

  1. Добавить 1 мкл каждого из CD31-PE, CD45-PE, SCA-1-PE, и интегрином α7 антитела в 200 мкл клеточной суспензии. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
  2. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл 2% FBS в DMEM в клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку, и центрифуге при 2000 оборотах в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Повторите этот шаг дважды.
  3. Аспирируйте и отбросить супернатант.
  4. Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% FBS в DMEM и добавить 10 мкл анти-PE магнитных шариков. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
  5. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл буфера MACS к клеточной суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 2000 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Повторите этот шаг служлед. Следует отметить, что клетки должны быть промывают MACS буфера перед разделены магнитного колонки.
  6. Аспирируйте и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток с 1,0 мл буфера MACS.
  7. Настройка колонку LD на магнитной доске, и промойте колонку 2,0 мл MACS буфера (рис. 1E).
  8. Передача клеточной суспензии на колонку LD, и собирать проточный долю в 1,5 мл трубки. Эта фракция содержит PE-отрицательных клеток.
  9. Центрифуга при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 мин, аспирата и отбросить супернатант.
  10. Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% FBS в DMEM и добавить 10 мкл анти-мышь IgG магнитных шариков. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
  11. Промыть клеток: После инкубации добавляют 1 мл буфера MACS в клеточной суспензии в 1,5 мл пробирку, а затем центрифугируют при 2000 оборотов в минуту при 4 ° С в течение 3 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют клеток с 500 мкл MACS буфера.
  12. Настройте колонки MS на магнитной доске, и промойте колонку с 500 мкл MACS буфера (рис. 1F).
  13. Передача приостановлено решение клеток на колонку MS, и выбросьте проточный фракцию (интегрина α7-отрицательных клеток).
  14. Промыть 1 мл MACS буфера, и повторить этот шаг дважды.
  15. После промывки удалить столбец из магнитного поля сепаратора. Применение 1,0 мл буфера MACS на колонку и элюируют магнитно меченых клеток (интегрина α7-позитивных клеток) в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, нажав на поршень шприца из верхней части колонны. Сбор проточные в 1,5 мл трубки. Повторите вымывание с 1,5 мл MACS буфера и собирать проточные.
  16. Центрифуга при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 мин, аспирата и отбросить супернатант.
  17. Ресуспендируют очищенные клетки с 1 мл среды миобластов (20% FBS, содержащиеся Hams F-10 с оФРФ) и пластинчатые элементы на Матригель покрытием 10 смпластина с 8 мл миобластов Medium (5 мл в 6 см пластины) (рис. 1 г). Следует отметить, что 1-2 × 10 5 клеток потенциально могут быть выделены из 1 цельной мышцы мыши.

3. Техническое обслуживание

  1. Поток ячеек через день с миобластов среды. Появление растущих миобластов является небольшой и круглой формы, выражающей MyoD (рисунок 2) и Pax7 (данные не показаны) в их ядра.
  2. Миобласты следует пассировать до 50% слияния или при запуске слияния клеток. После промывки один раз ЗФР, инкубировать клетки с 0,25% раствором трипсина при 37 ° С в течение 3 мин в СО 2-инкубаторе и собирать диссоциированных клеток миобластов среды. После центрифуг клеток (1000 оборотов в минуту в течение 5 мин), приостановить миобластов среды и replate клетки на новые пластины Матригель покрытием. Коллагеновые покрытием пластины могут быть использованы после прохождения 3. Одна пластина обычно можно разделить на 4:57 пластин.

4. Differentiation

  1. Подпитку с дифференциацией среды через день.
  2. Днем 1 в дифференциации среды, миобласты выходят из клеточного цикла и подвергаются дифференцировке в тяжелой цепи миозина (МНС)-положительных миоцитов. Эти myoctyes начать слияние клеток друг с другом для создания многоядерные мышечные трубки. Как правило, большинство миобласты стать MHC-положительные отличающих одноядерные миоциты или мышечных трубках (рис. 2) в день 3-5 в дифференциации среды.

5. Миобластов Трансплантация в мышь для скелетных мышц регенерации

  1. Анестезировать мышь авертином (250 мг / кг) по внутрибрюшинно (IP) инъекции.
  2. Бритье волос кожи вокруг на большеберцовой передней (ТА) мышцы. Двадцать четыре часа до трансплантации миобластов, 10 мкМ CTX (50 мкл) внутримышечно вводят в NOD / мышцы Scid мыши TA, чтобы вызвать регенерацию мышц через 31 G инсулина шприцем через бритой кожи (рис.60, 3).
  3. Пролиферирующие миобластов диссоциируют с 0,25% раствором трипсина и центрифугировали при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант. Ресуспендируют 1 × 10 6 клеток с 50 мкл 2% FBS в DMEM. Трансфер приостановленные клетки в инсулиновый шприц 31 G.
  4. Мыши-реципиенты будут анестезии авертином (250 мг / кг) путем инъекции IP, и 1 х 10 6 миобласты (рис. 2) внутримышечно вводят в регенерации мышц TA.
  5. Мышцы Урожай Т.А. на 1-4 недели после инъекции клеток для гистологического анализа (рис. 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Свежевыделенные покоящиеся клетки-сателлиты отображать небольшую, круглую форму (рис. 1 г) и ускоренная Pax7 качестве окончательного маркера для покоящихся сателлитных клеток. Более 90% свежевыделенных клеток выразить Pax7 (Рисунок 1H и 1i). Самые загрязненные клетки от клеток крови, которые не эффективно расти в пробирке следующие миобластов условиях культивирования. Таким образом, клеток, полученных миобластов спутниковые доминировать в культуре. По желанию, мы можем повторить шаги для очистки на колонке MS (шаги 2.11-2.14), чтобы увеличить чистоту изолированных сателлитных клеток. Эти покоящиеся клетки-сателлиты войдет в клеточный цикл в 24 часов после выделения пройти миогенные клетки-предшественники или миобластов. Эти клетки могут быть пассируют обработкой трипсином каждые 4 дня, пока скорость пролиферации клеток не снижается. Как правило, эти клетки не могут быть сохранены, пока канал 10. Эти пролиферирующие миобласты выразить MyoD ( (рис. 2). Эти Экс Vivo расширенные миобласты могут быть использованы для внутримышечных экспериментов инъекции клеток для изучения вклада миобластов к регенерации мышечных волокон и самообновлению клетки-сателлиты. Через двадцать четыре часа до инъекции клеток, CTX вводят в мышцах Та 2 месячных NOD / SCID иммунодефицитных мышей. Диссоциированные миобласты вводят CTX-индуцированной регенерации мышц (рис. 3). Введенный мышцы могут быть собраны несколько дней до нескольких месяцев после инъекции. Донорские клетки, как правило, генетически помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP) гена 6, гена β-галактозидазы 16 щелочной фосфатазы ген 18 плазмидой трансфекции, вирусного вектора инфекции, или препарата из трансгенных мышей, несущих трансген. Спутниковые клетки от гетерозиготной Myf5 + / nLacZ мышей 19, в котором миогенные клетки могут быть обнаружены после окрашивания X-гал, были изолированы. Мышей Myf5 + / nLacZ нести ядерный β -. Галактозидазы вставлен в локус гена Myf5, где экспрессия гена β-галактозидазы повторяет экспрессию эндогенного Myf5 в обоих спутников клеток и клеток-предшественников миогенных или миобластов 20 Рисунок 3 показывает всю TA мышц окрашивание для обнаружения ядерного β-галактозидазы-положительных донора клеток, которые включают в пролиферирующих миобластов, самообновлению спутниковые клетки и вновь образованных мышечных волокон. При необходимости, эти окрашенные мышцы TA могут быть использованы для гистологического себестрельчатые для дальнейших методов иммунодетекции.

Рисунок 1
Рисунок 1. Получение мышечных сателлитных клеток из мыши скелетных мышц. :. Mincing расчлененные трицепсы и задних конечностей мышцы ножницами B:. Увеличенный вид панели А С: растирания коллагеназы обращению измельченной мышце штук на 18 G иглы D:. Фильтрующая диссоциирован подготовку мышц на клеточный фильтр E:. Разделение MACS из диссоциирован мышечные клетки по колонке LD F:. разделение MACS диссоциированных мышечных клеток на колонке MS G:.. Свежевыделенные сателлитные клетки Н:. Pax7-положительных свежевыделенных сателлитные клетки Я: DAPI окрашивание на панели G.


Рисунок 2. Культура изолированных клеток-сателлитов. А, В, С: Анти-MyoD миобласты антитела положительный, полученные из свежевыделенных сателлитных клеток D, E, F:. Анти-миозина тяжелой цепи (МНС)-положительных дифференциации нескольких ядросодержащие мышечных трубках.

Рисунок 3
Рисунок 3. Внутримышечные инъекции расширенных миобластов в мыши скелетных мышцах. А: X-гал окрашивание миобластов, выделенных из мышей Myf5 + / nLacZ B, C:. Внутримышечные инъекции Myf5 + / nLacZ миобластов в мышечные TA. Myf5 + / nLacZ в регенерации мышечных волокон. Окрашивание X-гал проводили на мышцы TA вводили миобластов на 1 месяц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе покоя спутниковые клетки могут быть легко очищен от взрослых скелетных мышцах мышей по коллагеназой и поверхностных антитело-опосредованной разделения MACS. Этот метод принимает около 6 часов и не требует дорогостоящего оборудования, таких как машины FACS. Кроме того, этот метод является относительно недорогим по сравнению с поверхностной антитело-опосредованной FACS разделения. Высокий выход покоящихся сателлитных клеток, как ожидается, по сравнению с FACS для этого метода с FACS лазерное облучение имеет тенденцию вызывать гибель клеток в процессе разделения 15. Другие методы изоляции, такие как предварительным покрытием или одной культивирования мышечных волокон требуют несколько дней к культуре, и, таким образом, эти методы хороши для активированных клеток-сателлитов или изоляции миобластов. Тем не менее, покоящиеся спутниковые клетки не могут быть очищены с помощью этих методов. Методы предварительным покрытием исключить загрязнение фибробластов на основе их разности сцепление между активированных сателлитных клеток и миобластовс 21. Активированный сателлитных клеток или миобластов вырост происходит во время одной культуры мышечных волокон 22. Отметим также, что молодые мыши (1-2 месяцев) показывают более высокий выход покоящихся сателлитных клеток (1-5 × 10 5 / мышь), очищенных с помощью этого метода разделения MACS по сравнению с более старых мышей. Тем не менее, чистота покоящихся сателлитных клеток из поврежденных мышц снижается после этой очистки антител опосредованной MACS поверхности, так как поврежден мышцы содержит более проникли клетки крови. Для разделения MACS покоящихся сателлитных клеток, мы использовали CD45, CD31 и SCA-1 в качестве маркеров клеточной поверхности для негативной селекции. CD45 является производителем для пан-гемопоэтических клеток; CD31 является маркером эндотелиальных клеток; Sca-1 представляет собой маркер для обоих эндотелиальных клеток и интерстициальных клеток 23. Для положительного отбора, мы использовали в α7 моноклональное антитело против интегрина, который окрашивает покоящиеся клетки-сателлиты, а также некоторые немышечно клеток в скелетных мышцах. Несколько групптакже используется в α7 антитела против интегрина на основе FACS очистки покоя спутник клетки, в сочетании с другими позитивной и негативной селекции маркеров 7,24. Кроме того, другие группы использовали антитела против CXCR4 25, CD34 7, синдекана-3 26, или синдекана-4 27 как положительные маркеры отбора FACS основе очистки покоя спутник клеток. SM/C-2.6 моноклональное антитело было также используется для позитивной селекции в то время как эпитоп для этого моноклонального антитела не были определены еще 1. Ни один из этих положительных маркеров селекции не находятся в состоянии покоя спутниковое соты. Таким образом, полная ликвидация таких nonsatellite клеток, экспрессирующих эти позитивные маркеры выбора имеет важное значение для получения высокой чистоты покоящихся сателлитных клеток после сортировки. Это может быть более полезно использовать спутниковые клеточно-специфических маркеров клеточной поверхности, такие как M-кадгерина в качестве позитивного селективного маркера.

Freshly изолированные покоящиеся клетки-сателлиты могут быть использованы для генных и экспрессии белка профилей, культуры экспериментов для получения миобластов и трансплантации стволовых клеток для сателлитных клеток самообновления экспериментов и клеточной терапии. Предыдущая работа показала, что профили экспрессии генов значительно отличаются от активированных сателлитных клеток, которые могут объяснить некоторые биологические различия между этими двумя типами клеток (например, клеток в неактивном этапе Vs. Деления активной ячейки) 1, 28. Последние работы показал, что свежевыделенных покоящиеся клетки-сателлиты обладают значительно более высокой приживление и самообновлению активностью по сравнению с активированными сателлитных клеток или миобластов, когда пересаживают в регенерации мышц 6-7. Например, менее чем в 100 покоящиеся спутниковые клетки показывают надежную вклад в регенерации мышечных волокон, а также самообновляющихся сателлитных клеток 5,7. Таким образом, в состоянии покоя спутниковые клетки могут быть выделеныд испытания на предмет их способности эффективно прижился в поврежденных мышц, их вклад в регенерацию мышечных волокон, и их улучшение функции мышц у больных МДД.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Shahragim Таджбахш для обеспечения мышей Myf5 + / nLacZ. Мы также благодарим Александра Грон и Майкл Baumrucker за критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами от Ассоциации мышечной дистрофии (MDA) и Грегори Marzolf младший MD Center Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics