筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Biology

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Summary

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。

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Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

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Abstract

筋衛星細胞は、筋線維におけるsublaminal核の2〜5%を占め、出生後の骨格筋の発達と再生に必要な幹細胞集団である。大人の筋肉では、衛星細胞は通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、しかしながら、衛星細胞、筋肉の再生を媒介する筋芽細胞、それらの子孫を生成するために細胞増殖を開始する。衛星細胞由来の筋芽細胞の移植が広く筋ジストロフィー、心不全、および泌尿器機能障害を含むいくつかの疾患のための再生可能な治療法として研究されてきた。ジストロフィー骨格筋、梗塞、心臓、および機能不全、尿管への筋芽細胞移植は、移植された筋芽細胞は、宿主組織内の筋線維に分化し、これらの疾患における部分的な機能改善を表示することができますことを示している。したがって、骨格musclから静止衛星細胞の効率的な精製方法の開発Eだけでなく、衛星細胞由来の筋芽細胞培養および筋芽細胞のための移植法の確立など、衛星細胞の自己再生、活性化、及び分化の背後にある分子メカニズムを理解するために不可欠です。また、筋ジストロフィー、その他の再生の病気のための細胞ベースの治療法の開発は、これらの要因に依存している。

しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別(FACS)装置の使用を必要とする。ここでは、ソーティング(MACS)、磁気活性化細胞が続く酵素的解離による成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。これらの新たに単離した静止衛星細胞またはex vivoで増殖た筋芽細胞は、心臓毒に移植することができる(CTX)筋線維の再生にドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導されるだけでなく、自己複製の検査のための衛星細胞区画へ活動。

Introduction

筋衛星細胞は、骨格筋線維の基底膜の下に位置する筋原幹細胞の小集団である。それらはのPax7、のPax3、c-Metの、M-カドヘリン、CD34、シンデカン3の発現を特徴とし、カルシトニン、1 - 3。衛星細胞、筋肉幹細胞などの筋再生に関与することが証明されている。大人の筋肉では、衛星細胞は4-8通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、衛星細胞は活性化され、MyoDの発現を開始し、そしてその子孫を展開し、細胞周期を入力して、筋原性前駆細胞又は筋芽3と呼ばれる。細胞分裂のいくつかのラウンド後、筋芽細胞は、成熟筋繊維に続いて多核筋管へと分化するために、相互に細胞周期およびヒューズを終了する。大人の筋肉から分離された筋芽細胞は、容易にex vivoで拡張することができます。筋肉を再生させるにしてに筋線維になる筋芽細胞の能力非筋組織における異所性フォーム筋線維は、筋芽細胞移植、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)4のための潜在的な治療アプローチ、泌尿器機能障害9、および心不全10によって利用される。確かに、筋芽細胞は正常にMDX(DMDモデル)マウスおよびDMD患者11から14の両方の筋肉に移植されてきた。注入された筋芽細胞は、正常な、罹患筋の組織学および機能を改善するために、宿主筋線維と融合する。以前の研究は、筋芽細胞の亜集団は、より細胞様幹と筋再生5中に筋肉になった未分化状態のままにしていることを明らかにした。最近の研究は、成体筋から新たに単離されたサテライト細胞、筋肉5-8の再生に、より効率的な生着及び自己再生活性を示す幹細胞様集団を含有することが示されている。従って、成体骨格MUから静止衛星細胞の純粋な集団の精製SCLEは、衛星細胞、筋芽細胞と筋再生の生物学を理解するため、および細胞ベースの治療法の開発のために不可欠である。

しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別(FACS)1,2,6-8機械の使用を必要とする。また、FACSレーザ露光は、静止衛星細胞15の下部収率を引き起こす分離時に細胞死を誘導する傾向がある。ここでは、成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。この方法では、ソーティング(MACS)、磁気活性化細胞が続く酵素的解離を利用しています。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。我々はまた示すことが、これらの新たに単離された静止衛星細胞またはex VIの筋肉内注射VO展開さ筋芽細胞が心臓毒に移植することができる(CTX)筋線維だけでなく、自己再生活動の検査のための衛星細胞区画への再生へのドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導される。

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Protocol

動物は、SPF環境下で飼育したとミネソタ大学の研究動物資源(RAR)によりモニターした。 1304から30492:動物はすべてのプロトコルは施設内動物管理使用委員会(IACUC、コード番号によって承認されたアベルチン(250 mg / kg)のIP注射で麻酔した後の(CO 2吸入またはKCl注入適切な手段によって安楽死させた)ミネソタ大学の。

マウス骨格筋から単核細胞の1。分離

  1. 適切に1または2の若い成体マウス(3-8週)を生け贄に捧げる。
    1. 鋭いハサミで腹部の皮膚をつまんスリット。完全に(反対方向に皮膚を引っ張って)三頭筋および後肢の筋肉を表示するために皮膚をはがす。
    2. ハサミで骨に沿った全ての脚の骨格筋(前脛骨筋、腓腹筋、および大腿四頭筋)と上腕三頭筋を取り除く。その後、10cmプレートに、氷冷、滅菌PBSに筋肉を転送。
  2. 新しい滅菌6cmのプレートにPBS中で筋肉や転送筋肉を血を洗い流します。1プレートを1〜2マウスについて。
  3. 解剖顕微鏡下で、結合組織、血管、神経束、および脂質生成組織を除去する。
  4. 眼科用のハサミを使用して、滑らかなパルプ( 図1Aおよび図1B)内に組織を切断し刻む。彼らは酵素溶液により容易に分解されることはありませんように、大規模な作品を残していないしてみてください。
  5. (10%DMEM中でFBS中の0.2%コラゲナーゼタイプ2)ファルコン50 mlのチューブにみじん切り筋肉を転送し、コラゲナーゼ溶液5mlを加える。 60分間37℃でインキュベートする。
  6. 粉末化し(18 G針で上下)の混合物( 図1C)を均質化する。次いで、さらに15分間37℃で混合物をインキュベートする。
  7. 単一細胞懸濁液中に解離する混合物を均質化するために再度粉砕する。アップ単一細胞懸濁液に50mlまでDMEM中の2%FBSを加え、混合するよく。
  8. ファルコン50mlチューブ( 図1D)上にセルストレーナー(70ミクロン)を配置します。セルストレーナーに解離した細胞を含む上清を移し、それが通過するまで上下にフィルター上の細胞懸濁液をピペットで。
  9. 血球計数器で細胞数をカウントします。 5分間4℃で2,000 rpmで遠心分離し、チューブ;吸引し、上清を捨てる。
  10. DMEMで10mlの2%のFBSで再懸濁する。 5分間4℃で2,000 rpmで遠心分離し、チューブ;吸引し、上清を捨てる。
  11. DMEM中で2%FBS200μlで再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞懸濁液を転送します。通常、約2×10 6個の細胞は、1匹のマウスの筋肉から採取しなければならない。細胞を、DMEM、2%FBS100μl中1×10 6細胞の濃度まで希釈される。

2。抗体染色とMacとの分離

次のPRの間にocedures、無菌バッファを使用して無菌状態を維持している。抗体の各ボリュームを添加し、細胞懸濁媒体は、1匹のマウスの全体の筋肉からの細胞について計算される。細胞を、2又はそれ以上のマウスから採取された場合、試薬の量が最適化されるべきである。

  1. 細胞懸濁液200μlに1μL、CD31-PE、CD45-PE、SCA-1-PE、およびα7インテグリン抗体をそれぞれ追加します。氷上で30分間インキュベートする。
  2. 細胞を洗浄:インキュベーション後、1.5mlチューブ中の細胞懸濁液中にDMEM 1ml中の2%のFBSを追加し、3分間、4℃、2,000 rpmで遠心分離する。二回、この手順を繰り返します。
  3. 吸引し、上清を捨てる。
  4. DMEM中で2%FBS200μlで細胞を再懸濁し、そしてアンチPE磁性ビーズ10μlを加える。氷上で30分間インキュベートする。
  5. インキュベーション後、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞懸濁液にMACSバッファーの1ミリリットルを追加し、3分間、4℃で2,000 rpmで遠心分離:細胞を洗浄。この手順TWを繰り返し氷。細胞は磁気カラムで分離される前に、MACSバッファーで洗浄する必要があることに注意してください。
  6. 吸引し、上清を捨てる。 MACS緩衝液1.0mlで細胞を懸濁します。
  7. マグネットボード上のLD列を設定し、MACS緩衝液( 図1E)の2.0ミリリットルでカラムをすすぐ。
  8. LDカラムに細胞懸濁液を移し、1.5mlチューブにフロースルー画分を収集する。この画分は、PE陰性細胞が含まれています。
  9. 3分間4℃、2,000 rpmで、吸引で遠心し、上清を捨てる。
  10. DMEM中で2%FBS200μlで細胞を再懸濁し、そして抗マウスIgG磁気ビーズの10μlを加える。氷上で30分間インキュベートする。
  11. 細胞を洗浄:インキュベーション後、1.5mlチューブ中の細胞懸濁液にMACS緩衝液1mlを追加し、3分間、4℃で2,000 rpmで遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。二回、この手順を繰り返します。 MACS緩衝液500μlで細胞を懸濁します。
  12. マグネットボード上のMSカラムを設定し、MACS緩衝液( 図1F)を500μlでカラムをすすぐ。
  13. 転送は、MSカラムに細胞溶液を懸濁し、フロースルー画分(インテグリンα7陰性細胞)を廃棄します。
  14. MACSバッファー1mlですすぎ、二回、この手順を繰り返します。
  15. すすいだ後、分離器の磁場から列を削除します。カラムをMACS緩衝液1.0mlを適用し、塔頂からシリンジプランジャを押して、1.5mlのマイクロチューブに磁気標識細胞(インテグリンα7陽性細胞)を溶出。 1.5ミリリットルチューブにフロースルーを収集します。 MACSバッファー1.5mlで溶出を繰り返し、フロースルーを収集する。
  16. 3分間4℃、2,000 rpmで、吸引で遠心し、上清を捨てる。
  17. 筋芽細胞培地1mlで精製された細胞を再懸濁(20%FBSは、bFGFとハムのF-10を含まれている)、およびマトリゲル被覆されたを10cmのプレート細胞筋芽細胞中の8ミリリットル(6cmのプレートの5ミリリットル)( 図1G)でプレート。 1〜2×10 5個の細胞を、潜在的に1無傷マウス筋肉から単離することができることに留意されたい。

3。メンテナンス

  1. 筋芽細胞の培地で一日おきに細​​胞を養う。成長筋芽細胞の出現は、それらの核内でのMyoD( 図2)とのPax7(データは示さず)を発現する小さな丸い形状である。
  2. 筋芽細胞は、50%のコンフルエンス時または細胞融合を開始する前に継代されるべきである。 PBSで一回洗浄した後、CO 2インキュベーター中で3分間37℃で、0.25%トリプシン溶液で細胞をインキュベートし、筋芽細胞培地で解離した細胞を収集する。遠心分離機細胞(5分間1,000 rpmで)した後、筋芽細胞培地で一時停止し、新しいマトリゲル被覆プレート上に細胞をreplate。コラーゲンコートしたプレートは、流路3の後に使用することができる。一方のプレートは、通常、四時五十七プレートに分割することができる。

4。Differentiation

  1. 一日おきに分化培地で再給。
  2. 分化培地中の1日目では、筋芽細胞は、細胞周期を終了し、ミオシン重鎖(MHC)陽性筋への分化を受ける。これらmyoctyesは多核筋管を生成するために相互に細胞融合を始める。通常、ほとんどの筋芽細胞は、分化培地で一日3〜5により、MHC陽性差別単核筋細胞や筋管( 図2)になる。

骨格筋再生のためのマウスに5。筋芽細胞移植

  1. アベルチン(250 mg / kg)を腹腔内(IP)注射でマウスを麻酔し。
  2. 前脛骨筋(TA)は、筋肉の皮膚の毛を剃るの周り。二十四時間筋芽細胞移植の前に、10μMのCTX(50μl)を筋肉内に剃毛した皮膚( 31〜Gのインスリンを注射器で筋肉の再生を誘導するためにNOD / SCIDマウスの脛骨筋に注入される60、3)。
  3. 増殖する筋芽細胞を0.25%トリプシン溶液で解離し、5分間1,000 rpmで遠心分離する。吸引し、上清を捨てる。 DMEM中の2%のFBS50μlの再懸濁、1×10 6個の細胞。 31 Gのインスリン注射器の中に懸濁した細胞を移す。
  4. レシピエントマウスは、IP注射によってアベルチン(250mg/kg /日)で麻酔され、1×10 6筋芽細胞( 図2)は、TA筋肉の再生筋肉に注入される。
  5. 組織学的分析のために細胞注入後1〜4週までに収穫脛骨筋( 図3)。

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Representative Results

新たに単離した静止衛星細胞は小さく、丸みを帯びた形状( 図1G)を表示し、静止衛星細胞のための決定的なマーカーとしてのPax7を発現する。新たに単離した細胞の90%以上がのPax7( 図1Hおよび1I)を発現する。最も汚染された細胞は、効率的に筋芽細胞の培養条件に従って、インビトロで増殖しない血液細胞からのものである。このように、衛星細胞由来の筋芽細胞は、培養中に支配している。任意選択的に、我々は、単離されたサテライト細胞の純度を高めるために(2.11から2.14ステップ)MSカラム精製のための手順を繰り返すことができる。これらの静止衛星細胞は、筋原性前駆細胞又は筋芽細胞を受けるように、単離後24時間以内に細胞周期に入る。細胞増殖速度が減少するまで、これらの細胞は、4日ごとにトリプシン処理により継代することができる。典型的には、これらの細胞は継代10まで維持することができる。これらの増殖する筋芽細胞(MyoDの発現を図2)を発現する多核筋管、となる。これらのex vivoで拡大さ筋芽細胞、筋線維と自己複製衛星細胞を再生する筋芽細胞の寄与を検討するための筋肉細胞注入実験のために利用することができる。二十四時間細胞注射の前に、CTXは、2ヶ月齢のNOD / SCID免疫不全マウスのTA筋に注入される。解離した筋芽細胞は、CTX誘発の再生筋肉( 図3)に注入される。注入された筋肉は、注射後数ヶ月に数日を収穫することができる。ドナー細胞は、典型的には、遺伝的に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子6、β-ガラクトシダーゼ遺伝子16で標識されているアルカリホスファターゼ遺伝子 18。筋原細胞はX-gal染色後に検出することができるヘテロ接合Myf5の + / nLacZマウス 19からの衛星細胞は、単離された。 Myf5の+ / nLacZマウスは、核βを運ぶ- β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は、衛星細胞および筋原前駆細胞又は筋芽20の両方における内因性にMyf5の発現を再現Myf5の遺伝子座に挿入ガラクトシダーゼ遺伝子3は全体のTAを示し筋芽細胞増殖性、自己再生衛星細胞、および新たに形成された筋線維を含む核β-ガラクトシダーゼ陽性のドナー由来細胞の検出のための筋肉染色。必要に応じて、これらの染色されたTAの筋肉組織学的それ自体のために使用することができるさらに免疫検出法のためctions。

図1
図1。マウスの骨格筋からの筋衛星細胞の調製。 :ハサミで三頭筋および後肢の筋肉を解剖しミンチB:パネルA、Cの拡大図:18 G針でコラゲナーゼ処理ミンチ筋肉片をトリチュレートD:濾過のセルストレーナーで筋標本を解離しE:解離したのMACS分離LDカラムによる筋肉細胞のF:MSカラムによって解離筋細胞のMACS分離G:新たに単離した衛星細胞H:のPax7陽性新たに単離したサテライト細胞I:パネル、G用のDAPI染色。


図2:単離されたサテライト細胞の培養。 A、B、C:新たに単離された衛 ​​星細胞由来の抗MyoDの抗体陽性筋芽細胞D、E、F:アンチミオシン重鎖(MHC)陽性多核の筋管を区別する。

図3
図3。マウスの骨格筋に展開筋芽細胞を筋肉注射。 :Myf5の+ / nLacZマウスから単離した筋芽細胞のX-gal染色、B、C:脛骨筋にMyf5の+ / nLacZ筋芽細胞の筋肉内注射。 Myf5の+ / nLacZマウスから単離し注入された筋芽細胞の統合。 X-gal染色は、1月単位で筋芽細胞を注射したTA筋で行った。

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Discussion

このプロトコルでは、静止衛星細胞を容易にコラゲナーゼ消化および表面抗体媒介MACS分離による成体マウスの骨格筋から精製することができる。この方法では、約6時間かかり、このようなFACS装置など高価な設備を必要としません。さらに、この方法は、表面抗体媒介FACS分離に比べて比較的安価である。 FACSレーザ露光分離15の間に細胞死を誘導する傾向があるため、静止衛星細胞の高い収率は、この方法のためにFACSと比較して期待されている。このようなプレめっきまたは単一筋線維培養などの他の分離方法には、文化に数日を必要とし、このように、これらの方法は、活性化衛星細胞や筋芽細胞の分離に適しています。しかし、静止衛星細胞は、これらの方法によって精製することができない。プレプレーティング法は、活性化衛星細胞と筋芽細胞との間のそれらの付着差に基づいて線維芽細胞の混入を排除する21秒 。活性化された衛 ​​星細胞や筋芽細胞伸長は、単一の筋線維の文化22の間に生じる。我々はまた、(1〜2 ​​ヶ月)若いマウスは、高齢のマウスに比べて、このMACS分離法により精製静止衛星細胞(1〜5×10 5 /マウス)の高い収量を示していることに注意してください。損傷した筋肉は、より浸潤血液細胞を含有するので、損傷した筋肉からの静止衛星細胞の純度は、この表面抗体媒介性MACS精製後に低減される。静止衛星細胞のMACS分離のために、我々は、負の選択のための細胞表面マーカーとしてCD45、CD31、およびSca-1を利用した。 CD45は汎造血細胞のためのメーカーです。 CD31は、内皮細胞のマーカーである。 SCA-1は、内皮細胞や間質細胞23の両方のマーカーである。正の選択のために、我々は、静止衛星細胞だけでなく、骨格筋の一部の非筋肉細胞を染色する抗インテグリンα7モノクローナル抗体を利用した。いくつかのグループまた、他の正と負の選択と組み合わせて、FACSに基づく静止衛星細胞精製の ​​ための抗インテグリンα7抗体を利用7,24マーカ 。また、他のグループは、CXCR4 25、CD34 7、シンデカン3 26、またはシンデカン4 FACSに基づく静止衛星細胞精製の ​​ための27のような正の選択マーカーに対する抗体を利用した。このモノクローナル抗体に対するエピトープは1まだ同定されていないいる。SM/C-2.6モノクローナル抗体はまた、陽性選択のために使用したこれらの正の選択マーカーのいずれも、静止衛星細胞特異ありません。したがって、これらの正の選択マーカーを発現するような非サテライト細胞の完全な除去は、ソート後の静止衛星細胞の高純度を得るために必須である。これは、正の選択マーカーとして、例えばM-カドヘリン、衛星細胞特異的細胞表面マーカーを使用する方が便利な場合があります。

Freshly単離された静止衛星細胞は、遺伝子およびタンパク質発現プロファイル、筋芽細胞、衛星細胞の自己再生実験のための細胞移植を得るための培養実験、および細胞療法のために使用することができる。以前の研究は、遺伝子発現プロファイルは、1、28(例えば、活性細胞分裂休眠期の細胞のような)これらの2つの細胞型間の生物学的相違点のいくつかを説明し得る、活性化衛星細胞と有意に異なることを実証した。最近の研究では、新たに単離し、静止衛星細胞が筋肉6-7の再生に移植し、活性化衛星細胞や筋芽細胞と比較して有意に高い生着および自己複製活性を有することを実証しました。例えば、100未満の静止衛星細胞は、自己再生衛星細胞に5,7筋線維を再生ならびにに対してロバストな貢献を示している。したがって、静止衛星細胞は、ANを単離することができdは効率的に損傷した筋肉、筋線維の再生への貢献、およびDMD患者における筋機能の彼らの改善に生着するそれらの潜在能力について試験した。

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Disclosures

利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgements

私たちは、Myf5の+ / nLacZマウスを提供するための博士Shahragim Tajbakhshに感謝します。我々はまた、この原稿の重要な読書のためのアレクサンダー·フロン川とマイケルBaumruckerに感謝します。この作品は、筋ジストロフィー協会(MDA)とグレゴリーMarzolfジュニア、MDセンター賞からの補助金によって支えられている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

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References

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