Isolasjon, Kultur, og Transplantasjon av Muscle satellitt celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isoleringen og kulturen i en ren populasjon av hvilende satellittceller, en muskel stamcelle befolkning, er avgjørende for forståelsen av muskelstamcellebiologi og regenerering, samt stamcelletransplantasjon for terapi i muskeldystrofi og andre degenerative sykdommer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Muskelsatellittceller er en stamcelle befolkningen nødvendig for postnatal skjelettmuskelutvikling og regenerasjon, sto for 2-5% av sublaminal kjerner i muskelfibrene. I voksen muskel, satellittceller er normalt mitotisk sovende. Etter skade, men satellittceller initiere cellulære proliferasjon for å produsere myoblaster, deres progenies, for å formidle til regenerering av muskelen. Transplantasjon av satellitt celle-avledet myoblasts har vært mye studert som en mulig behandling for flere regenerative sykdommer, inkludert muskeldystrofi, hjertesvikt, og urologisk dysfunksjon. Myoblast transplantasjon i dystrofe skjelettmuskulatur, infarcted hjerte, og dysfunctioning urinkanalene har vist at innpodet myoblasts kan differensiere i muskelfibre i verts vev og vise delvis funksjonell forbedring i disse sykdommene. Derfor er utviklingen av effektive rensemetoder quiescent satellittceller fra skjelett muscle, så vel som etablering av satellitt celle-stammer myoblast kulturer og transplantasjonsmetoder for myoblaster, er essensielle for å forstå de molekylære mekanismer som ligger til satellittceller selvfornyelse, aktivering og differensiering. I tillegg til utvikling av celle-baserte terapier for muskeldystrofi og andre regenererende sykdommer er også avhengig av disse faktorene.

Imidlertid, nåværende potensielle rensemetoder quiescent satellittceller krever bruk av dyre fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) maskiner. Her presenterer vi en ny metode for rask, økonomisk og pålitelig rensing av hvil satellitt celler fra voksne mus skjelettmuskulatur ved enzymatisk dissosiasjon fulgt av magnetisk-aktivert celle sortering (MACS). Etter isolering av rene quiescent satellittceller, kan disse cellene bli dyrket for å oppnå store mengder av myoblaster etter flere passeringer. Disse ferske isolerthvilsatellittceller eller ex vivo utvidede myoblasts kan transplanteres inn Cardiotoxin (CTX)-indusert regenererende mus skjelettmuskulatur for å undersøke bidraget fra donor-deriverte celler til å regenerere muskelfibre, samt satellitt celle avdelinger for undersøkelse av selvfornyelse aktiviteter.

Introduction

Muskelsatellittceller er en liten bestand av myogeniske stamceller som ligger under basal lamina av skjelettmuskelfibre. De er preget av uttrykket av Pax7, Pax3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, og calcitonin 1 - 3. Satellittceller har vist seg å være ansvarlig for muskelregenerasjonenen som muskel stamceller. I voksen muskel, satellittceller er normalt mitotisk sovende 4-8. Etter skade, er satellitt celler aktiveres, initiere uttrykk for MyoD, og gå inn i cellesyklus for å utvide sitt avkom, betegnes myogeniske forløper celler eller myoblasts tre. Etter flere runder med celledeling, myoblaster gå ut av cellesyklusen og sikring til hverandre for å gjennomgå differensiering til multi-nukleære myotubes, etterfulgt av moden muskelfibre. Myoblaster isolert fra voksen muskel kan lett utvides ex vivo. Kapasiteten for myoblasts å bli muskelfibre i regenererende muskler og tilskjema ektopiske muskelfibre i nonmuscle vev blir utnyttet av myoblast transplantasjon, en potensiell terapeutisk tilnærming for Duchenne muskeldystrofi (DMD) 4, urologisk dysfunksjon 9, og hjertesvikt 10. Faktisk myoblasts har blitt transplantert i muskel av begge MDX (DMD-modellen) muse og DMD pasienter 11-14. De injiserte normale myoblaster smelter med vertsmuskelfibre for å forbedre histologi og funksjon av den syke muskler. Tidligere arbeid har vist at subpopulasjoner av myoblasts er mer stamcellelignende og forbli i en udifferensiert tilstand lenger i muskelen under muskelregenerasjonenen fem. Nyere arbeider har vist at nylig isolerte satellittceller fra voksne muskel inneholde en stamcelle-liknende befolkning som viser mer effektiv engraftment og selvfornyelse aktivitet i regenererende muskel 5-8. Derfor, rensing av en ren populasjon av hvil satellitt celler fra voksne skjelett muscle er avgjørende for å forstå biologien til satellittceller, myoblasts og muskel gjenfødelse, og for utvikling av cellebasert terapi.

Imidlertid, nåværende potensielle rensemetoder quiescent satellittceller krever bruk av en kostbar fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) maskin 1,2,6-8. I tillegg tenderer FACS lasereksponering for å indusere celledød under separasjonen, noe som fører til lavere utbytte av quiescent satellittceller 15. Her presenterer vi en ny metode for rask, økonomisk og pålitelig rensing av hvil satellitt celler fra voksne mus skjelettmuskulatur. Denne metoden benytter enzymatisk dissosiasjon etterfulgt av magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Etter isolering av rene quiescent satellittceller, kan disse cellene bli dyrket for å oppnå store mengder av myoblaster etter flere passeringer. Vi viser også at intramuskulær injeksjon av disse nylig isolerte hvilsatellittceller eller ex vivo utvidet myoblasts kan transplanteres inn Cardiotoxin (CTX)-indusert regenererende mus skjelettmuskulatur for å undersøke bidraget fra donor-deriverte celler til å regenerere muskelfibre, så vel som til satellittcelle avdelinger for undersøkelse av selvfornyelsesarbeid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrene ble plassert i en SPF miljø og ble overvåket av Forsknings Animal Resources (RAR) ved University of Minnesota. . Dyrene ble avlivet av egnede midler (CO 2 innånding eller KCl injeksjon etter å ha blitt bedøvet med IP injeksjon av Avertin (250 mg / kg) Alle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, kodenummer: 1304-30492 ) ved University of Minnesota.

En. Isolering av mononukleære celler fra mus Skeletal Muscle

  1. Riktig ofre en eller to unge voksne mus (3-8 uker).
    1. Knip og slit huden på magen med skarp saks. Skrelle av huden til å vise helt triceps og hind lem muskel (dra huden i motsatt retning).
    2. Fjern alle ben skjelettmuskulaturen (tibialis anterior, gastrocnemius, og quadriceps) og triceps langs benene med saks. Deretter overfører muskler til iskald, sterile PBS i en 10 cm plate.
  2. Vask blod av muskler i PBS og overføre muskler til en ny steril 6 cm plate: en plate for 1-2 mus.
  3. Fjern bindevev, blodkar, nervebunter, og adipogenic vevet under en disseksjon mikroskop.
  4. Bruke saks for oftalmologi, klippe og hakke vevet inn i en jevn masse (figur 1A og 1B). Prøv å ikke forlate store stykker, ettersom de ikke vil bli brutt ned lett av enzym-oppløsningen.
  5. Overfør hakket muskler i et Falcon 50 ml rør og tilsett 5 ml av kollagenase-løsning (0,2% kollagenase type 2 i 10% FBS i DMEM). Inkuber ved 37 ° C i 60 min.
  6. Trituratet (opp og ned med en 18 G nål) for å homogenisere blandingen (figur 1C). Da videre inkuberes blandingen ved 37 ° C i 15 min.
  7. Triturer igjen for å homogenisere blandingen for å dissosiere til enkeltcellesuspensjon. Tilsett 2% FBS i DMEM opp til 50 ml inn i det enkeltcellesuspensjon, og blandogså.
  8. Plasser en celle sil (70 mikrometer) på en 50 ml Falcon-rør (Fig. 1D). Overfør supernatanten inneholdende de dissosierte cellene på en celle sil, og cellesuspensjonen pipettere opp og ned på filteret inntil det passerer gjennom.
  9. Count celle nummer av hemocytometer. Sentrifuger rørene ved 2000 rpm ved 4 ° C i 5 min; aspirer og kast supernatanten.
  10. Resuspender med 10 ml 2% FBS i DMEM. Sentrifuger rørene ved 2000 rpm ved 4 ° C i 5 min; aspirer og kast supernatanten.
  11. Resuspender med 200 ul av 2% FBS i DMEM og overføre cellesuspensjon i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Vanligvis bør omtrent 2 x 10 til 6 celler høstes fra musklene i en mus. Celler vil bli fortynnet til en konsentrasjon på 1 x 10 til 6 celler i 100 ul av 2% FBS i DMEM.

2. Antistoffarging og Løsrivelse med MACS

Under følgende procedures, opprettholde sterile forhold ved hjelp av sterile buffere. Hvert volum av antistoff tilsatt, og cellesuspensjonen medium er beregnet for celler fra hele muskler i en mus. Dersom cellene er høstet fra to eller flere av musene bør mengden av reagenser som skal optimaliseres.

  1. Legg 1 mL hver av CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, og integrinet α7 antistoff i 200 ul av cellesuspensjonen. Inkuber på is i 30 min.
  2. Vask celler: Etter inkubering tilsett 1 ml av 2% FBS i DMEM til cellesuspensjonen i 1,5 ml rør og sentrifuger ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 min. Gjenta dette trinnet to ganger.
  3. Aspirer og kast supernatanten.
  4. Suspender cellene med 200 mL 2% FBS i DMEM, og legge til 10 mL av Anti-PE Magnetperler. Inkuber på is i 30 min.
  5. Vask celler: Etter inkubering, tilsett 1 ml MACS-buffer til cellesuspensjonen i 1,5 ml mikrosentrifugerør, og sentrifuger ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 min. Gjenta dette trinnet twisen. Legg merke til at cellene må vaskes for MACS-buffer før de blir separert ved magnetisk kolonne.
  6. Aspirer og kast supernatanten. Resuspender cellene med 1,0 ml MACS-buffer.
  7. Sett opp LD kolonne på en magnetkortet, og skylle kolonnen med 2,0 ml MACS-buffer (figur 1E).
  8. Overfør cellesuspensjonen til en LD-kolonnen, og samle gjennomstrømningsfraksjonen inn i et 1,5 ml rør. Denne fraksjonen inneholder PE-negative celler.
  9. Sentrifuger ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 min, aspirasjons-og kast supernatant.
  10. Suspender cellene med 200 mL 2% FBS i DMEM, og legge til 10 mL av anti-mus IgG Magnetperler. Inkuber på is i 30 min.
  11. Vask celler: Etter inkubering tilsett 1 ml MACS-buffer til cellesuspensjonen i 1,5 ml rør og deretter sentrifuger ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 min. Aspirer og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet to ganger. Suspender cellene med 500 mL av MACS buffer.
  12. Sett opp MS kolonne på en magnetisk bord, og skyll kolonnen med 500 mL av MACS buffer (figur 1F).
  13. Overføring suspendert celleløsning på MS-kolonnen, og kast gjennomstrømningsfraksjon (integrin α7-negative celler).
  14. Skyll med en ml MACS buffer, og gjenta dette trinnet to ganger.
  15. Etter skylling, fjerner kolonne fra det magnetiske felt av separatoren. Påfør 1,0 ml MACS-buffer til kolonnen, og eluering av de magnetisk merkede celler (integrin α7-positive celler) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved å skyve sprøytestemplet fra toppen av kolonnen. Samle gjennomstrømning inn i et 1,5 ml rør. Gjenta eluering med 1,5 ml MACS-buffer og samle gjennomstrømning.
  16. Sentrifuger ved 2000 rpm ved 4 ° C i 3 min, aspirasjons-og kast supernatant.
  17. Resuspender rensede celler med 1 ml myoblast-medium (20% FBS inneholdt Hams F-10 med bFGF), og plate-celler på Matrigel-belagte 10 cmplate med 8 ml myoblast Medium (5 ml i 6 cm-plate) (figur 1G). Legg merke til at 1 til 2 x 10 5 celler kan potensielt bli isolert fra en intakt mus muskel.

Tre. Vedlikehold

  1. Strøm celler annenhver dag med myoblast medium. Utseendet av voksende myoblaster er av liten og rund form uttrykker MyoD (figur 2) og Pax7 (data ikke vist) i sin kjerne.
  2. Myoblasts bør passaged før 50% samløpet, eller når du starter celle fusjon. Etter skylling en gang med PBS, inkuberes cellene med 0,25% Trypsin-oppløsning ved 37 ° C i 3 min i en CO2 inkubator, og samle cellene dissosiert med myoblast medium. Etter sentrifuge celler (1000 rpm i 5 min), suspendere med myoblast medium og replate celler på nye Matrigel-belagte plater. Kollagen-belagte plater kan brukes etter passering 3. Én plate kan vanligvis deles inn i 4:57 plater.

4. Praktrentiation

  1. Refeed med Differensiering Medium annenhver dag.
  2. Etter dag 1 i Differensiering Medium, myoblasts avslutte cellesyklus og gjennomgå differensiering i myosin tung kjede (MHC)-positive myocytes. Disse myoctyes begynne celle fusjon med hverandre for å generere multinucleated myotubes. Vanligvis, de fleste myoblasts bli MHC-positive differensierings mononukleære myocytes eller myotubes (figur 2) etter dag 3-5 i Differensiering Medium.

5. Myoblast Transplantasjon inn Mouse for Skeletal Muscle Regeneration

  1. Anaesthetize musen med Avertin (250 mg / kg) ved intraperitoneal (IP) injeksjon.
  2. Barbere huden hår rundt på tibialis anterior (TA) muskel. Tjuefire timer før myoblast transplantasjon, er 10 mikrometer CTX (50 mL) intramuskulært injisert i Nod / SCID mus TA muskler til å indusere muskelregenerasjonenen via en 31 G insulinsprøyte gjennom barbert huden (Figur60, 3).
  3. Prolifererende myoblaster blir dissosiert med 0,25% Trypsin-oppløsning og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Aspirer og kast supernatanten. Resuspender 1 x 10 6 celler med 50 pl 2% FBS i DMEM. Overfør de suspenderte celler inn i en 31 G insulinsprøyte.
  4. Mottaker mus blir bedøvet med Avertin (250 mg / kg) ved IP-injeksjon, og 1 x 10 6 myoblaster (figur 2) er intramuskulært injisert i regenererende muskel TA.
  5. Harvest-TA muskel ved 1-4 uker etter celle injeksjon for histologisk analyse (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nylig isolerte hvilsatellittceller vise en liten, rund form (figur 1G), og uttrykte Pax7 som en definitiv markør for hvilsatellittceller. Mer enn 90% av nylig isolerte celler uttrykker Pax7 (figur 1H og 1I). De kontaminerte celler er fra blodceller som ikke effektivt vokse in vitro etter myoblast dyrkningsbetingelser. Således satellitt celle-stammer myoblaster dominerer i kulturen. Eventuelt kan vi gjenta trinnene MS kolonnerensing for (trinn 2,11 til 2,14) for å øke renheten av isolerte satellittceller. Disse hvilsatellittceller vil gå inn i cellesyklus innen 24 timer etter isolasjon til å gjennomgå myogeniske forløper celler eller myoblasts. Disse cellene kan bli passaged ved trypsinering hver 4 dager før celle-proliferasjon frekvensen reduseres. Vanligvis kan disse cellene opprettholdes inntil passasje 10. Disse prolifererende myoblasts uttrykke MyoD ( (figur 2). Disse ex vivo utvidet myoblasts kan benyttes for intramuskulære celle injeksjon eksperimenter for undersøkelse av myoblast bidrag til å regenerere muskelfibre og selvfornyende satellittceller. Tjuefire timer før celle injeksjon, er CTX injisert i TA musklene i to måneder gamle Nod / SCID immunsvikt mus. Dissosierte myoblaster som injiseres i CTX-indusert regenererende muskel (figur 3). Den injiserte muskelen kan høstes noen dager til flere måneder etter injeksjon. Donor-celler er vanligvis genetisk merket med grønt fluorescerende protein (GFP) gene 6, β-galaktosidase-genet 16 alkaliske fosfatase-genet 18 av plasmid-transfeksjon, viral vektor infeksjon, eller preparatet fra transgene mus som bærer et transgen. Satellitt celler fra heterozygot Myf5 + / nLacZ mus 19, der myogeniske celler kan oppdages etter X-gal flekker, var isolert. De Myf5 + / nLacZ mus bære atom β -. Galaktosidase-genet innsatt i Myf5 gen locus, hvor β-galaktosidase genekspresjon sammenfatter ekspresjonen av endogene Myf5 i begge satellittceller og myogeniske forløper celler eller myoblaster 20 Figur 3 viser hele TA muskel farging for påvisning av kjernefysiske β-galaktosidase-positiv donor-avledede celler, som inkluderer prolifererende myoblaster, selv-fornyende satellittceller og nydannede muskelfibre. Om nødvendig, kan disse farget TA muskler benyttes for histologisk sections for ytterligere immuno-deteksjons metoder.

Figur 1
Figur 1. Fremstilling av muskelsatellittceller fra mus skjelettmuskel. A:. Hakking dissekert triceps og hind lem muskel ved saks B:. Forstørret visning av panel A C: triturating kollagenaseklassene behandlet hakket muskel brikker med 18 G nål D:. Filtrerende dissociated muskel forberedelse av celle sil E:. MACS separasjon av dissosiert muskelceller av LD kolonne F:. MACS separasjon av dissosiert muskelceller ved MS kolonne G:.. nylig isolerte satellittceller H:. Pax7-positive nylig isolerte satellittceller I: DAPI farging for panel G.


Figur 2. Culture of isolerte satellittceller. A, B, C: Anti-myod antistoff-positive myoblaster avledet fra nylig isolerte satellittceller D, E, F:. Anti-myosin tung kjede (MHC)-positive differensierende flerkjerneholdige myotubes.

Figur 3
Fig. 3. Intramuskulær injeksjon av ekspanderte myoblaster i mus skjelettmuskel. A: X-gal farging av myoblaster isolert fra Myf5 + / nLacZ mus B, C:. Intramuskulær injeksjon av Myf5 + / nLacZ myoblaster inn i muskelen. Myf5 + / nLacZ mus inn regenererende muskelfibre. X-gal farging ble utført på TA muskel injisert med myoblasts av en måned.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen, kan hvil satellitt celler lett bli renset fra voksen skjelettmuskulatur av mus ved collagenase fordøyelsen og overflate antistoff-mediert MACS separasjon. Denne metoden tar ca 6 timer, og trenger ikke noen kostbart utstyr som for eksempel en FACS-maskin. I tillegg er denne fremgangsmåte forholdsvis billig sammenlignet med overflate-antistoff-mediert FACS separasjon. Et høyere utbytte av quiescent satellittceller er også forventet i forhold til FACS for denne metoden fra FACS lasereksponering har en tendens til å indusere celledød under separasjonen 15.. Andre isolasjonsmetoder som forhåndspålegg eller enkelt muskel fiber dyrking krever noen dager til kultur, og dermed, disse metodene er gode for aktiverte satellittceller eller myoblast isolasjon. Imidlertid kan quiescent satellittceller ikke renses ved slike metoder. Forhåndspålegging metoder utelukke fibroblast forurensning på grunnlag av sin tilslutning forskjell mellom aktiverte satellittceller og myoblasts 21. Aktivert satellitt celle eller myoblast utvekst oppstår under enkelt muskel fiber kultur 22. Vi har også lagt merke til at yngre mus (1-2 måneder gammel) viser en høyere yield på hvilsatellittceller (1-5 x 10 5 / mus) renset ved dette MACS separasjonsmetode sammenlignet med eldre mus. Men renhet av hvil satellitt celler fra skadede muskelen er svekket etter denne overflate antistoff-mediert MACS rensing siden skadet muskel inneholder mer infiltrert blodceller. For MACS separasjon av hvilsatellittceller, benyttet vi CD45, CD31, og Sca-en som celleoverflatemarkører for negativ seleksjon. CD45 er en maker for pan-blodkreft celler; CD31 er en markør for endotel-celler; Sca-en er en markør for både endotelceller og interstitiell celler 23. For den positiv utvelgelse, benyttet vi en anti-inte α7 monoklonalt antistoff, som flekker hvilsatellittceller samt noen nonmuscle celler i skjelettmuskulatur. Flere grupperogså anvendes et anti-integrin-antistoff α7 for FACS-baserte quiescent satellittceller rensing, i kombinasjon med andre positive og negative seleksjonsmarkører 7,24. I tillegg vil andre grupper benyttet antistoffer mot CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26, eller Syndecan-4 27 som positive seleksjonsmarkører for FACS-baserte sovende satellitt celle rensing. En SM/C-2.6 monoklonalt antistoff ble også benyttet for positiv utvelgelse, mens epitopen for dette monoklonale antistoff ikke er blitt identifisert ennå en. Ingen av disse positive seleksjonsmarkører er stillestående satellitt celle-spesifikke. Det er derfor viktig for å oppnå høy renhet quiescent satellittceller etter sortering fullstendig eliminering av slike nonsatellite celler som uttrykker disse positive seleksjonsmarkører. Det kan være mer nyttig å bruke satellittcellespesifikk celleoverflatemarkører som M-cadherin som en positiv seleksjonsmarkør.

Freshly isolerte quiescent satellittceller kan anvendes for gen-og protein uttrykk profiler, kultur eksperimenter for å skaffe myoblaster og celletransplantasjon for satellittceller selv-fornyings eksperimenter, og celleterapier. Tidligere arbeid har vist at genekspresjonsprofiler er vesentlig forskjellige fra aktiverte satellittceller, noe som kan forklare noen av de biologiske forskjeller mellom disse to celletyper (slik som cellene i den sovende fase vs. Aktive celledeling) 1, 28. Nyere arbeider har vist at nylig isolerte hvilsatellittceller besitter betydelig høyere engraftment og selvfornyelse aktivitet sammenlignet med aktiverte satellittceller eller myoblasts når transplantert inn regenererende muskel 6-7. For eksempel, mindre enn 100 hvilsatellittceller viser robust bidrag til å regenerere muskelfibre samt til selvfornyende satellittceller 5,7. Derfor kunne hvil satellitt celler isoleres end testet for deres potensial til å effektivt engraft i skadet muskel, deres bidrag til muskel fiber gjenfødelse, og deres forbedring av muskelfunksjon i DMD pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt erklært.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Shahragim Tajbakhsh for å gi Myf5 + / nLacZ mus. Vi takker også Alexander Hron og Michael Baumrucker for kritisk lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra muskeldystrofi Association (MDA) og Gregory Marzolf Jr MD senter Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics