Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spier satelliet-cellen zijn een stamcel populatie vereist voor postnatale skeletspieren ontwikkeling en regeneratie, goed voor 2-5% van sublaminal kernen in spiervezels. Bij volwassen spier-, satelliet-cellen zijn normaal mitotically rust. Na verwonding echter satellietcellen initiëren cellulaire proliferatie myoblasten, hun nakomelingen, de regeneratie van spieren te produceren mediëren. Transplantatie van satelliet-cel afgeleide myoblasten is vaak bestudeerd als mogelijke therapie voor verschillende ziekten waaronder regeneratieve spierdystrofie, hartfalen en urologische stoornissen. Myoblast transplantatie in dystrofe skeletspieren, infarct hart, en disfunctioneren urinewegen heeft aangetoond dat geënt myoblasts kunnen differentiëren in spiervezels in de ontvangende weefsels en tonen gedeeltelijke functionele verbetering bij deze ziekten. Daarom is de ontwikkeling van efficiënte zuiveringswerkwijzen van rustende cellen van satelliet skelet muscle, alsmede de per satelliet cel afkomstige myoblasten culturen en transplantatie werkwijzen voor myoblasten, essentieel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen achter Sat cel zelf-vernieuwing, activatie en differentiatie. Bovendien, de ontwikkeling van cel-gebaseerde therapieën voor spierdystrofie en andere regeneratieve ziekten zijn ook afhankelijk van deze factoren.

De huidige potentiële zuiveringswerkwijzen van latente satelliet cellen vereisen het gebruik van dure fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) machines. Hier presenteren we een nieuwe methode voor de snelle, zuinige en betrouwbare zuivering van latente satelliet cellen uit volwassen muis skeletspier door enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische-geactiveerde cel sortering (MACS). Na isolatie van zuivere rustende satelliet cellen kunnen deze cellen worden gekweekt om grote aantallen myoblasten vinden na een aantal passages. Deze vers geïsoleerderustende satelliet cellen of ex vivo geëxpandeerde myoblasten kunnen getransplanteerd worden in cardiotoxine (CTX) geïnduceerde regeneratie muis skeletspieren de bijdrage van donor afgeleide cellen onderzoeken in regenererende spiervezels, alsmede satelliet cel compartimenten voor het onderzoek van zelfvernieuwing activiteiten.

Introduction

Spier satelliet cellen zijn een kleine populatie van myogene stamcellen zich onder de basale lamina van spiervezels. Ze worden gekenmerkt door de expressie van PAX7, Pax3, c-Met, M-cadherine, CD34, Syndecan-3 en calcitonine 1 - 3. Satelliet cellen bewezen belast spierregeneratie spier stamcellen zijn. Bij volwassen spier-, satelliet-cellen zijn normaal mitotically rust 4-8. Na letsel, zijn satelliet-cellen geactiveerd, initiëren uitdrukking van MyoD, en voer de celcyclus aan hun nageslacht uit te breiden, genoemd myogene voorloper cellen of myoblasts 3. Na verscheidene celdeling, myoblasten verlaat de celcyclus en de zekering elkaar om differentiatie te ondergaan in meerdere kernen myotubes, gevolgd door volwassen spiervezels. Myoblasten geïsoleerd uit volwassen spier kan gemakkelijk worden uitgebreid ex vivo. De capaciteit van myoblasten tot spiervezels in regenererende spieren envorm buitenbaarmoederlijke spiervezels in nonmuscle weefsels wordt uitgebuit door myoblast transplantatie, een mogelijke therapeutische benadering voor Duchenne spierdystrofie (DMD) 4, urologische dysfunctie 9, en hartfalen 10. Inderdaad, myoblasten met succes getransplanteerd in de spier van zowel mdx (DMD model) muizen en DMD patiënten 11-14. De geïnjecteerde normale myoblasten fuseren met gastheer spiervezels de histologie en functie van de aangetaste spieren verbeteren. Vorige werk aangetoond dat subpopulaties van myoblasts meer zijn stamcel-achtige en blijven in een ongedifferentieerde staat langer in de spieren tijdens spierregeneratie 5. Recent onderzoek heeft aangetoond dat vers geïsoleerde satelliet-cellen uit volwassen spier bevatten een stamcel-achtige bevolking die efficiënter innesteling en zelfvernieuwing activiteit in regenererende spieren 5-8 vertoont. Daarom zuivering van een zuivere populatie van latente satelliet cellen van het skelet mu volwassenSCLE is essentieel voor het begrip van de biologie van satelliet-cellen, myoblasts en spierregeneratie, en voor de ontwikkeling van cel-gebaseerde therapieën.

De huidige potentiële zuiveringswerkwijzen van latente satelliet cellen vereisen het gebruik van een duur-fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) machine 1,2,6-8. Bovendien FACS laserbelichting neiging celdood bij scheiding, waarbij lagere opbrengst van latente satelliet-cellen 15 veroorzaakt induceren. Hier presenteren we een nieuwe methode voor de snelle, zuinige en betrouwbare zuivering van latente satelliet cellen uit volwassen muis skeletspieren. Deze werkwijze gebruikt enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische-geactiveerde celsortering (MACS). Na isolatie van zuivere rustende satelliet cellen kunnen deze cellen worden gekweekt om grote aantallen myoblasten vinden na een aantal passages. We tonen ook aan dat intramusculaire injectie van deze vers geïsoleerde rustende satelliet cellen of ex vivo geëxpandeerde myoblasten kunnen worden getransplanteerd in cardiotoxine (CTX) geïnduceerde regeneratie muis skeletspieren de bijdrage van donor afgeleide cellen te regenereren spiervezels, alsmede satelliet cel compartimenten voor het onderzoek van zelfvernieuwing-activiteiten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dieren werden gehuisvest in een SPF-omgeving en werden gevolgd door de Research Animal Resources (RAR) van de Universiteit van Minnesota. . De dieren werden gedood met passende middelen (CO 2 inhalatie of KCl injectie na te zijn verdoofd met IP injectie van Avertin (250 mg / kg) Alle protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, Code nummer: 1304-30492 ) van de Universiteit van Minnesota.

1. Isolatie van mononucleaire cellen van Mouse Skeletal Muscle

  1. Goed offeren 1 of 2 jonge volwassen muizen (3-8 weken).
    1. Knijp en sneed de huid van de buik met een scherpe schaar. Afpellen huid om helemaal te kunnen zien triceps en achterste ledematen spieren (de huid in tegengestelde richting te trekken).
    2. Verwijder al het been skeletspieren (tibialis anterior, gastrocnemius, en quadriceps) en triceps langs de botten met een schaar. Vervolgens transfer spieren om ijskoude, steriele PBS in een 10 cm plaat.
  2. Wassen bloed van de spieren in PBS en overdracht spieren om een ​​nieuwe steriele 6 cm plaat: 1 plaat voor 1-2 muizen.
  3. Verwijder bindweefsel, bloedvaten, zenuwbanen en adipogene weefsel onder een dissectie microscoop.
  4. Met een schaar voor oogheelkunde, gesneden en gehakt het weefsel tot een gladde pulp (figuren 1A en 1B). Probeer grote stukken niet te verlaten, want zij zullen niet worden vastgesteld gemakkelijk door het enzym oplossing gebroken.
  5. Breng gehakt spieren in een Falcon buis van 50 ml en voeg 5 ml collagenase oplossing (0,2% collagenase type 2 in 10% FBS in DMEM). Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
  6. Vermaal (op en neer met een 18 G naald) om mengsel (figuur 1C) te homogeniseren. Dan verder incuberen van het mengsel bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  7. Vermaal opnieuw om mengsel te homogeniseren van elkaar te scheiden in enkele celsuspensie. Voeg 2% FBS in DMEM tot 50 ml in de enkele celsuspensie en mengook.
  8. Plaats een cel zeef (70 micrometer) op een Falcon 50 ml tube (figuur 1D). Breng het supernatant dat de gedissocieerde cellen op een cel zeef en pipet de celsuspensie op en neer op het filter totdat het doorstromende.
  9. Tel het aantal cellen door hemocytometer. Centrifugeer de buizen bij 2.000 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten; aspireren en gooi het supernatant.
  10. Resuspendeer met 10 ml 2% FBS in DMEM. Centrifugeer de buizen bij 2.000 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten; aspireren en gooi het supernatant.
  11. Resuspendeer met 200 ul van 2% FBS in DMEM en overdracht celsuspensie in 1,5 ml microcentrifuge buizen. Meestal duurt ongeveer 2 x 10 6 cellen worden geoogst van spieren van muis 1. De cellen worden verdund tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen in 100 ul 2% FBS in DMEM.

2. Antilichaamkleuring en scheiding met MACS

Tijdens de volgende procedures, onderhouden steriele omstandigheden door steriele buffers. Elk volume van antilichamen toegevoegd en celsuspensie medium berekend voor cellen uit spieren van muis 1. Als cellen van 2 of meer muizen geoogst, dient de hoeveelheid reagentia worden geoptimaliseerd.

  1. Voeg 1 ul elk van CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE en integrine α7 antilichaam in 200 ul van de celsuspensie. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  2. Was de cellen: Na incubatie, voeg 1 ml 2% FBS in DMEM in de celsuspensie in 1,5 ml buis en centrifugeer bij 2000 rpm bij 4 ° C gedurende 3 minuten. Herhaal deze stap tweemaal.
  3. Zuig en gooi het supernatant.
  4. Resuspendeer cellen met 200 ul van 2% FBS in DMEM en voeg 10 ul van anti-PE Magnetic Beads. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  5. Was de cellen: Na incubatie, voeg 1 ml MACS buffer aan de celsuspensie in 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 2000 rpm bij 4 ° C gedurende 3 minuten. Herhaal deze stap twijs. Merk op dat cellen door MACS buffer worden gewassen alvorens te worden gescheiden door magnetische kolom.
  6. Zuig en gooi het supernatant. Resuspendeer de cellen met 1,0 ml MACS-buffer.
  7. Opgericht LD kolom op een magneetbord, en spoel de kolom met 2,0 ml MACS buffer (figuur 1E).
  8. Breng de celsuspensie op de kolom LD, en verzamel de doorstroomfractie in een 1,5 ml buis. Deze fractie bevat PE-negatieve cellen.
  9. Centrifugeer bij 2000 rpm bij 4 ° C gedurende 3 min, zuigen en de bovenstaande vloeistof.
  10. Resuspendeer cellen met 200 ul van 2% FBS in DMEM en voeg 10 ul van anti-muis IgG magnetische kralen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
  11. Was de cellen: Na incubatie, voeg 1 ml MACS-buffer in de cel suspensie in 1,5 ml buis en centrifugeer bij 2000 rpm bij 4 ° C gedurende 3 minuten. Zuig en gooi het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal. Resuspendeer cellen met 500 ui MACS buffer.
  12. Opgericht MS kolom op een magneetbord, en spoel de kolom met 500 pi van MACS buffer (Figuur 1F).
  13. Overdracht gesuspendeerd cel oplossing op de kolom MS en de doorstroomfractie (integrine α7-negatieve cellen) verwijderen.
  14. Spoelen met 1 ml MACS-buffer en tweemaal herhaal deze stap.
  15. Na spoelen, verwijdert kolom uit het magnetische veld van de separator. Breng 1,0 ml MACS buffer op de kolom en elueer de magnetisch gelabelde cellen (α7 integrine-positieve cellen) in een 1,5 ml microcentrifugebuis door op de zuiger uit de top van de kolom. Verzamel de doorstroom in een 1,5 ml buis. Herhaal de elutie met 1,5 ml MACS-buffer en laat de doorstroming.
  16. Centrifugeer bij 2000 rpm bij 4 ° C gedurende 3 min, zuigen en de bovenstaande vloeistof.
  17. Resuspendeer gezuiverde cellen met 1 ml myoblasten medium (20% FBS bevatte Ham F-10 met bFGF), en plaat cellen op Matrigel beklede 10 cmplaat met 8 ml myoblast Medium (5 ml in 6 cm plaat) (figuur 1G). Merk op dat 1-2 x 10 5 cellen mogelijk kan worden geïsoleerd uit 1 intact muizenspier.

3. Onderhoud

  1. Feed cellen elke dag myoblasten medium. Het uiterlijk van groeiende myoblasten is een kleine ronde vorm tot expressie MyoD (figuur 2) en PAX7 (gegevens niet getoond) in hun kern.
  2. Myoblasten worden gepasseerd voordat 50% confluentie of bij het starten celfusie. Na eenmaal spoelen met PBS, geïncubeerd cellen met 0,25% trypsine-oplossing bij 37 ° C gedurende 3 min in een CO2 incubator en laat gedissocieerde cellen met myoblasten medium. Na centrifuge cellen (1000 rpm gedurende 5 min), op te schorten met myoblast medium en replate cellen op nieuwe Matrigel-beklede platen. Collageen beklede platen kunnen worden gebruikt na passage 3. Een plaat kan gewoonlijk worden opgesplitst in 04:57 platen.

4. Differentiation

  1. Opnieuw ingevoerd met differentiatiemedium om de dag.
  2. Per dag 1 in Differentiatie Medium, myoblasts verlaat de celcyclus en ondergaan differentiatie in myosine zware keten (MHC)-positieve myocytes. Deze myoctyes beginnen celfusie met elkaar meerkernige myotubes genereren. Typisch, de meeste myoblasts geworden MHC-positieve onderscheidende mononucleaire myocytes of myotubes (figuur 2) overdag 3-5 in Differentiatie Medium.

5. Myoblast transplantatie in Muis voor Skeletal Muscle Regeneration

  1. Verdoven de muis met Avertin (250 mg / kg) door intraperitoneale (IP) injectie.
  2. Scheer de huid haar rond op tibialis anterior (TA) spier. Vierentwintig uur voor myoblast transplantatie, is 10 uM CTX (50 pl) intramusculair geïnjecteerd in de Nod / Scid muis TA spier spierregeneratie induceren via een 31 G insuline spuit door geschoren huid (figuur60, 3).
  3. Prolifererende myoblasten worden gescheiden in 0,25% trypsine-oplossing en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Zuig en gooi het supernatant. Resuspendeer 1 x 10 6 cellen met 50 gl 2% FBS in DMEM. Breng de geschorste cellen in een 31 G insulinespuit.
  4. Ontvangende muizen worden verdoofd met Avertin (250 mg / kg) door IP injectie, en 1 x 10 6 myoblasten (figuur 2) worden intramusculair geïnjecteerd in regenererende TA spier.
  5. Oogst TA spier door 1-4 weken na celinjectie voor histologische analyse (Figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vers geïsoleerde rustige satelliet cellen vertonen een kleine, ronde vorm (figuur 1G) en een automatische PAX7 als een definitieve marker voor latente satelliet cellen. Meer dan 90% van vers geïsoleerde cellen brengen PAX7 (Figuur 1H en 1I). De meeste besmette cellen zijn van bloedcellen, die niet efficiënt doen groeien in vitro volgende myoblast kweekomstandigheden. Zo, satelliet-cellen afgeleide myoblasts domineren in de cultuur. Optioneel kunnen we de stappen voor MS zuiveringskolom herhalen (stappen 2,11-2,14) de zuiverheid van geïsoleerde satelliet cellen te verhogen. Deze latente satelliet-cellen zal de celcyclus te voeren binnen 24 uur na isolatie aan myogene voorlopercellen of myoblasts ondergaan. Deze cellen kunnen worden gepasseerd door behandeling met trypsine om de 4 dagen tot de proliferatie tarief wordt verlaagd. Meestal kan deze cellen worden gehandhaafd tot passage 10. Deze uitdijende myoblasts uiten MyoD ( (figuur 2). De ex vivo geëxpandeerde myoblasten kunnen worden voor intramusculaire injectie cel experimenten voor onderzoek van myoblasten bijdrage regenererende spiervezels en zelf-vernieuwing satellietcellen. Vierentwintig uur voor cel injectie wordt CTX geïnjecteerd in TA spieren van 2 maanden oude Nod / Scid immunodeficiënte muizen. Gedissocieerde myoblasten worden geïnjecteerd CTX-geïnduceerde regenererende spier (figuur 3). De geïnjecteerde spier kan worden geoogst enkele dagen tot enkele maanden na injectie. Donor cellen worden typisch genetisch gemerkt met groen fluorescerend eiwit (GFP) gen 6, β-galactosidase gen 16 alkalische fosfatase gen 18 door plasmide transfectie, virale vector infectie, of het preparaat uit transgene muizen die een transgen. Satelliet cellen van heterozygote Myf5 + / nLacZ muizen 19, waarbij myogene cellen kunnen worden gedetecteerd na X-gal kleuring, werden geïsoleerd. De Myf5 + / nLacZ muizen dragen nucleair β -. Galactosidase gen ingevoegd in de Myf5 locus waarbij de β-galactosidase genexpressie recapituleert de expressie van endogene Myf5 in zowel satelliet cellen en myogene voorlopercellen of myoblasten 20 Figuur 3 toont gehele TA spier kleuring voor de detectie van nucleaire β-galactosidase-positieve donor-afgeleide cellen, die prolifereren myoblasten, zelf-vernieuwing satelliet cellen en nieuw gevormde spiervezels bevatten. Indien nodig kunnen deze gekleurd TA spieren worden gebruikt voor histologische seegen voor verdere immunodetectie methoden.

Figuur 1
Figuur 1. Bereiding van spier satelliet cellen uit muizen skeletspier. A:. Fijnhakkend ontleed triceps en achterste ledematen spieren door schaar B:. Vergrote weergave van paneel A C: triturating-collagenase behandeld gehakt spier stukken van 18 G naald D:. Filtreren gescheiden spier voorbereiding door cel zeef E:. MACS scheiding van gedistantieerd spiercellen door LD kolom F:. MACS scheiding van gescheiden spiercellen door MS kolom G:.. Vers geïsoleerde satelliet cellen H:. PAX7-positieve vers geïsoleerde satelliet-cellen I: DAPI kleuring voor paneel G.


Figuur 2. Cultuur van geïsoleerde satelliet cellen. A, B, C: anti-MyoD antilichaam-positieve myoblasten afgeleid van vers geïsoleerde satellietcellen D, E, F:. Anti-myosine zware keten (MHC)-positieve differentiëren meerdere kernen myotubes.

Figuur 3
Figuur 3. Intramusculaire injectie van geëxpandeerd myoblasts in muis skeletspieren. A: X-gal kleuring van myoblasts geïsoleerd van Myf5 + / nLacZ muizen B, C:. Intramusculaire injectie van Myf5 + / nLacZ myoblasts in TA spier. Myf5 + / nLacZ muizen in regenererende spiervezels. X-gal kleuring werd uitgevoerd op TA spier geïnjecteerd met myoblasten van 1 maand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol kan rustende satellietcellen gemakkelijk worden gezuiverd uit volwassen skeletspier van muizen door collagenase digestie en oppervlakte-antilichaam-gemedieerde MACS scheiding. Deze methode duurt ongeveer 6 uur en geen dure apparatuur zoals een FACS-machine. Daarnaast is deze methode is relatief goedkoop in vergelijking met oppervlakte-antilichaam-gemedieerde FACS scheiding. Een hogere opbrengst van latente satelliet-cellen wordt ook verwacht in vergelijking met FACS voor deze methode omdat FACS laserbelichting neiging celdood bij scheiding 15 induceren. Andere isolatiemethoden, zoals preplating of spier vezel kweken vereisen een paar dagen cultuur, en derhalve zijn deze werkwijzen goed voor geactiveerde satelliet cellen of myoblasten isolatie. Echter, satelliet rustende cellen niet worden gezuiverd door deze werkwijzen. Preplating methoden te voorkomen fibroblast besmetting op basis van hun aanhankelijkheid verschil tussen geactiveerde satelliet cellen en myoblasts 21. Geactiveerde satelliet cel of myoblast uitgroei optreedt tijdens enkele spiervezels cultuur 22. Merken we ook dat jongere muizen (1-2 maanden oud) hebben een hogere opbrengst van latente satelliet-cellen (1-5 x 10 5 / muis) gezuiverd door deze MACS scheiding methode ten opzichte van oudere muizen. Echter, zuiverheid van satelliet rustende cellen van beschadigde spieren verminderd na deze oppervlakte-antilichaam-gemedieerde MACS zuivering omdat de beschadigde spieren bevat meer geïnfiltreerd bloedcellen. Voor de MACS scheiding van latente satelliet-cellen, hebben we gebruik gemaakt CD45, CD31, en SCA-1 als celoppervlaktemerkers voor negatieve selectie. CD45 is een maker voor pan-hematopoietische cellen; CD31 is een marker voor endotheelcellen; Sca-1 is een marker voor zowel endotheelcellen en interstitiële cellen 23. Voor de positieve selectie, gebruikten we een anti-integrine α7 monoklonaal antilichaam, dat rustende satelliet cellen en enkele nonmuscle cellen in skeletspier vlekken. Verschillende groepenook gebruikt een anti-integrine α7 antilichaam voor FACS-gebaseerde rustende satelliet cel zuivering, in combinatie met andere positieve en negatieve selectiemerkers 7,24. Ook andere groepen gebruikt antilichamen tegen CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26 of Syndecan-4 27 als positieve selectie markers voor FACS-gebaseerde latente satelliet cel zuivering. Een SM/C-2.6 monoklonaal antilichaam werd ook gebruikt voor de positieve selectie, terwijl de epitoop voor deze monoklonale antilichamen nog niet geïdentificeerd 1. Geen van deze positieve selectiemerkers zijn rustende Sat celspecifieke. Daarom zal een volledige afschaffing van dergelijke nonsatellite cellen die deze positieve selectie markers is essentieel voor het verkrijgen van hoge zuiverheid van latente satelliet-cellen na sortering. Het zou nuttiger satelliet celoppervlak celspecifieke merkers zoals M-cadherine als een positieve selectiemerker.

Freshly geïsoleerd rustende satelliet cellen kunnen worden gebruikt voor gen-en eiwitexpressie profielen cultuur experimenten myoblasten en celtransplantatie voor satelliet-cel zelf-vernieuwing experimenten vinden en celtherapie. Eerder werk toonde dat genexpressie aanzienlijk verschillen van geactiveerde satelliet cellen, die enkele van de biologische verschillen tussen deze twee celtypes (zoals cellen in de slapende fase vs. Actieve celdeling) 1, 28 kan verklaren. Recent onderzoek heeft aangetoond dat vers geïsoleerde rustige satelliet-cellen bezitten aanzienlijk hoger innesteling en zelfvernieuwing activiteit vergeleken met geactiveerde satelliet cellen of myoblasts wanneer getransplanteerd in regenererende spieren 6-7. Bijvoorbeeld minder dan 100 rustende satelliet cellen vertonen sterke bijdrage aan regenererende spiervezels en zelf-vernieuwing satellietcellen 5,7. Daarom rust satelliet-cellen geïsoleerd kon worden eend getest op hun potentieel om efficiënt engraft in beschadigde spier, hun bijdrage aan de spiervezels regeneratie, en de verbetering van de spierfunctie in DMD patiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflict verklaard.

Acknowledgements

Wij danken dr. Shahragim Tajbakhsh voor het verstrekken Myf5 + / nLacZ muizen. We danken ook Alexander Hron en Michael Baumrucker voor het kritisch lezen van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Vereniging van de Spierdystrofie (MDA) en Gregory Marzolf Jr MD Center Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics