L'isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellules musculaires satellites sont une population de cellules souches requis pour le développement du muscle squelettique et de la régénération post-natal, ce qui représente 2 à 5% des noyaux sublaminal dans les fibres musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos. Après une lésion, cependant, les cellules satellites initier la prolifération cellulaire pour produire des myoblastes, leurs descendants, de médiation de la régénération du muscle. La transplantation de myoblastes dérivés des cellules satellites a été largement étudiée comme traitement possible pour plusieurs maladies régénératrices y compris la dystrophie musculaire, l'insuffisance cardiaque et de dysfonction urologique. Transplantation de myoblastes dans le muscle dystrophique squelettique, cardiaque infarctus, et dysfonctionnement des canaux urinaires a montré que les myoblastes greffés peuvent se différencier en fibres musculaires dans les tissus de l'hôte et afficher une amélioration fonctionnelle partielle dans ces maladies. Par conséquent, le développement de procédés de purification efficace de cellules satellites quiescentes de MUSCL squelettiquee, ainsi que la mise en place de satellites cultures de myoblastes dérivés des cellules et des méthodes de transplantation de myoblastes pour, sont essentielles pour comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine satellite cellule auto-renouvellement, l'activation et la différenciation. En outre, le développement de thérapies à base de cellules pour la dystrophie musculaire et d'autres maladies de régénération sont également tributaires de ces facteurs.

Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation de coûteux tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de la machine. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos de la souris adulte muscle squelettique par dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Ces fraîchement isolécellules satellites quiescentes ou ex vivo des myoblastes élargis peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induite par la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que de compartiments cellulaires par satellite pour l'examen de l'auto-renouvellement activités.

Introduction

Cellules musculaires satellites sont une petite population de cellules souches myogéniques situés sous la lame basale des fibres musculaires squelettiques. Ils sont caractérisés par l'expression de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadhérine, CD34, Syndecan-3, et la calcitonine de 1 - 3. Les cellules satellites sont révélés être responsable de la régénération du muscle en tant que cellules souches musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos 4-8. Après une lésion, les cellules satellites sont activées, lancer expression de MyoD, et entrer dans le cycle cellulaire pour élargir leur progéniture, appelé cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes 3. Après plusieurs cycles de division cellulaire, les myoblastes sortent du cycle cellulaire et fusible à l'autre, afin de subir une différenciation en myotubes multi-nucléées, suivis par les fibres musculaires matures. Myoblastes isolés à partir de tissus musculaires adultes peuvent facilement être étendues ex vivo. La capacité de myoblastes pour devenir les fibres musculaires dans la régénération musculaire et àforme extra-utérines fibres musculaires dans les tissus non musculaires est exploitée par la transplantation de myoblastes, une approche thérapeutique potentielle pour la myopathie de Duchenne (DMD) 4, le dysfonctionnement urologique 9, et l'insuffisance cardiaque 10. En effet, les myoblastes ont été transplantés avec succès dans le muscle des deux mdx (modèle DMD) des souris et des patients atteints de DMD 11-14. Les myoblastes normaux injectés fusionnent avec les fibres musculaires de l'hôte pour améliorer l'histologie et la fonction du muscle malade. Des travaux antérieurs ont démontré que des sous-populations de myoblastes sont plus cellule souche analogue et restent dans un état ​​indifférencié plus dans le muscle pendant la régénération du muscle 5. Des travaux récents ont montré que les cellules satellites du muscle fraîchement isolés adulte contiennent une population de cellules souches ressemblant que présente la prise de greffe plus efficace et l'activité d'auto-renouvellement dans la régénération musculaire 5-8. Par conséquent, la purification d'une population pure de cellules satellites quiescentes de mu squelettique adultesclérose est essentielle pour la compréhension de la biologie des cellules satellites, les myoblastes et la régénération musculaire, et pour le développement de thérapies à base de cellules.

Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation d'un tri cellulaire activé par fluorescence chère (FACS) Machine 1,2,6-8. En outre, l'exposition au laser FACS a tendance à induire la mort cellulaire au cours de la séparation, ce qui entraîne un rendement plus faible des cellules satellites quiescentes 15. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos du muscle squelettique de souris adulte. Cette méthode utilise la dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Nous montrons également que l'injection intramusculaire de ces cellules satellites quiescentes fraîchement isolés ou ex vimyoblastes vo étendues peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induit la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que des compartiments cellulaires par satellite pour l'examen des activités d'auto-renouvellement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les animaux ont été logés dans un environnement SPF et ont été suivis par la recherche des ressources animales (RAR) de l'Université du Minnesota. . Les animaux ont été euthanasiés par des moyens appropriés (inhalation de CO 2 ou d'injection de KCl après avoir été anesthésiés avec une injection IP de Avertin (250 mg / kg) Tous les protocoles ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC, le numéro de code: 1304-30492 ) de l'Université du Minnesota.

1. Isolement des cellules mononucléaires du muscle squelettique de souris

  1. Sacrifier bien 1 ou 2 jeunes souris adultes (3-8 semaines).
    1. Pincez et fendre la peau de l'abdomen avec des ciseaux pointus. Décoller la peau pour montrer complètement les triceps et les muscles des membres postérieurs (tirer la peau dans des directions opposées).
    2. Retirez tous les muscles des jambes squelettiques (tibial antérieur, jumeau, et quadriceps) et les triceps le long des os avec des ciseaux. Puis transfert muscles à glacé, PBS stérile dans une plaque de 10 cm.
  2. Laver sang de muscles dans du PBS et les muscles de transfert à un nouveau stérile 6 cm plaque: 1 plaque de 1-2 souris.
  3. Retirer le tissu conjonctif, les vaisseaux sanguins, les faisceaux de nerfs, et le tissu adipogénique sous un microscope à dissection.
  4. Avec des ciseaux pour l'ophtalmologie, couper et émincer le tissu en une pâte lisse (Figures 1A et 1B). Essayez de ne pas laisser de gros morceaux, car ils ne seront pas décomposés facilement par la solution d'enzyme.
  5. Transfert muscles hachées dans un tube Falcon 50 ml, et ajouter 5 ml de solution de collagénase (0,2% de collagénase de type 2 dans 10% de FBS dans DMEM). Incuber à 37 ° C pendant 60 min.
  6. Triturer (de haut en bas avec une aiguille de calibre 18) pour homogénéiser le mélange (figure 1C). Puis incuber en outre le mélange à 37 ° C pendant 15 min.
  7. On triture à nouveau pour homogénéiser le mélange à se dissocier en suspension de cellules individuelles. Ajouter 2% de FBS dans du DMEM à 50 ml dans la suspension de cellules isolées et mélangerbien.
  8. Placez un tamis cellulaire (70 um) sur un tube de Falcon 50 ml (figure 1D). Transférer le surnageant contenant les cellules dissociées sur un tamis cellulaire, et la pipette la suspension de cellules de haut en bas sur le filtre jusqu'à ce qu'il passe à travers.
  9. Compter le nombre de cellules par hématimètre. Centrifuger les tubes à 2000 rpm à 4 ° C pendant 5 min; aspirer et jeter le surnageant.
  10. Remettre en suspension avec 10 ml de 2% de FBS dans du DMEM. Centrifuger les tubes à 2000 rpm à 4 ° C pendant 5 min; aspirer et jeter le surnageant.
  11. Remettre en suspension avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM et du transfert cellulaire suspension dans 1,5 ml microtubes. Habituellement, environ 2 x 10 6 cellules doivent être récoltées à partir de muscles de souris 1. Les cellules sont diluées à une concentration de 1 x 10 6 cellules dans 100 ul de 2% de FBS dans du DMEM.

2. Anticorps coloration et la séparation avec MACS

Au cours de la pr suivanteocedures, maintenir des conditions stériles à l'aide de tampons stériles. Chaque volume d'anticorps ajouté et le milieu de suspension cellulaire est calculée pour les cellules de muscles entiers d'une souris. Si les cellules sont récoltées à partir de deux ou plus des souris, la quantité de réactifs doit être optimisée.

  1. Ajouter 1 pi de chacun de CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, et de l'intégrine α7 anticorps dans 200 pi de la suspension cellulaire. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
  2. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de FBS à 2% dans du DMEM dans la suspension de cellules dans le tube de 1,5 ml, et centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Répétez cette étape deux fois.
  3. Aspirer et jeter le surnageant.
  4. Resuspendre les cellules avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM, et ajouter 10 ul d'anti-PE billes magnétiques. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
  5. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de tampon MACS à la suspension de cellules dans le tube de 1,5 ml, et puis centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Répétez cette étape twglace. Notez que les cellules doivent être lavés par tampon MACS avant d'être séparés par colonne magnétique.
  6. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 1,0 ml de tampon MACS.
  7. Mettre en place la colonne de LD sur une carte magnétique, et rincer la colonne avec 2,0 ml de tampon MACS (figure 1E).
  8. Transférer la suspension cellulaire sur la colonne de LD, et recueillir la fraction écoulement continu dans un tube de 1,5 ml. Cette fraction contient des cellules de PE-négatif.
  9. Centrifugeuse à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes, aspirer et jeter le surnageant.
  10. Resuspendre les cellules avec 200 ul de 2% de FBS dans du DMEM, et ajouter 10 ul d'IgG anti-souris de perles magnétiques. Incuber sur de la glace pendant 30 min.
  11. Laver les cellules: Après incubation, ajouter 1 ml de tampon MACS dans la suspension de cellules dans 1,5 ml tube, puis centrifuger à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 min. Aspirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois. Remettre les cellules avec 500 pi de tampon MACS.
  12. Mettre en place la colonne MS sur une carte magnétique, et rincer la colonne avec 500 pi de tampon MACS (figure 1F).
  13. Transfert suspendu solution de cellules sur la colonne MS, et jetez la fraction de flux continu (cellules α7 négatif intégrines).
  14. Rincer avec 1 ml de tampon MACS, et répéter cette étape deux fois.
  15. Après rinçage, enlever la colonne du champ magnétique de séparateur. Appliquer 1,0 ml de tampon MACS dans la colonne et éluer les cellules magnétiquement marquées (cellules positives α7-intégrine) dans un tube de 1,5 ml en poussant le piston de la seringue à partir du sommet de la colonne. Recueillir le flux continu dans un tube de 1,5 ml. Répétez l'élution avec 1,5 ml de tampon MACS et recueillir le flux continu.
  16. Centrifugeuse à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes, aspirer et jeter le surnageant.
  17. Remettre en suspension les cellules purifiées avec 1 ml de milieu myoblastes (20% de FBS contenait Hams F-10 avec bFGF), et cellules de la plaque sur Matrigel revêtues de 10 cmplaque avec 8 ml de myoblastes moyen (5 ml à 6 cm) plaque (figure 1G). Notez que 1-2 x 10 5 cellules peuvent potentiellement être isolés à partir de souris 1 muscle intact.

3. Maintenance

  1. Nourrir les cellules tous les jours avec un milieu de myoblastes. L'apparition de myoblastes croissance est de petite et de forme ronde exprimant MyoD (Figure 2) et Pax7 (données non présentées) dans leur noyau.
  2. Myoblastes doivent être soumises à des passages avant de 50% de confluence ou lors du démarrage de la fusion cellulaire. Après rinçage une fois avec du PBS, incuber les cellules avec une solution de trypsine à 0,25% à 37 ° C pendant 3 min dans un incubateur à CO 2 et de recueillir des cellules dissociées avec du milieu de myoblastes. Après que les cellules de centrifugation (1000 rpm pendant 5 min), avec un milieu de suspendre myoblastes et Réensemencement cellules sur de nouvelles plaques enduites de Matrigel. des plaques revêtues de collagène peuvent être utilisés après le passage 3. Une plaque peut généralement être divisée en trois à cinq plaques.

4. Différenciation

  1. Réinsérez avec différenciation moyenne tous les deux jours.
  2. Le jour 1 en milieu de Différenciation, myoblastes sortent du cycle cellulaire et subissent une différenciation en chaîne lourde de myosine (MHC)-positif myocytes. Ces myoctyes commencent fusion cellulaire avec l'autre pour générer des myotubes multinucléés. En général, la plupart des myoblastes deviennent myocytes mononucléaires positives MHC-différenciation ou des myotubes (figure 2) par jour en 3-5 Différenciation Medium.

5. Transplantation de myoblastes dans la souris pour la régénération musculaire squelettique

  1. Anesthésier les souris avec Avertin (250 mg / kg) par voie intrapéritonéale (IP) d'injection.
  2. Raser les poils de la peau autour de jambier antérieur (TA) muscle. Vingt-quatre heures avant la transplantation de myoblastes, 10 uM CTX (50 ul) est injectée par voie intramusculaire dans la souris NOD / Scid muscle TA souris pour induire la régénération des muscles par l'intermédiaire d'une seringue de 31 U d'insuline à travers la peau rasée (Figure60, 3).
  3. Myoblastes en prolifération sont dissociées avec une solution de trypsine à 0,25%, et centrifugées à 1000 rpm pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension à 1 x 10 6 cellules avec 50 ul de 2% de FBS dans du DMEM. Transférer les cellules en suspension dans un 31 G seringue à insuline.
  4. Les souris receveuses seront anesthésiés avec Avertin (250 mg / kg) par injection IP, et les 1 x 10 6 myoblastes (Figure 2) sont injectées par voie intramusculaire dans le muscle TA régénération.
  5. Récolte muscle TA par 1-4 semaines après l'injection des cellules pour l'analyse histologique (figure 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellules satellites quiescentes fraîchement isolés affichent une petite forme ronde (figure 1G), et Pax7 express comme marqueur définitif pour les cellules satellites de repos. Plus de 90% des cellules fraîchement isolées expriment Pax7 (Figure 1H et 1I). La plupart des cellules contaminées sont des cellules sanguines qui ne poussent pas efficacement in vitro suivant les conditions de culture de myoblastes. Par conséquent, des myoblastes dérivés de cellules satellites dominent dans la culture. En option, nous pouvons répéter les étapes pour MS purification sur colonne (étapes 2.11 à 2.14) pour augmenter la pureté des cellules satellites isolées. Ces cellules satellites quiescentes vont entrer dans le cycle cellulaire dans les 24 heures après l'isolement de subir des cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes. Ces cellules peuvent être soumises à des passages par trypsinisation tous les 4 jours jusqu'à ce que le taux de prolifération des cellules est réduite. Typiquement, ces cellules peuvent être maintenues jusqu'à ce que le passage 10. Ces myoblastes en prolifération expriment MyoD ( (figure 2). Ces ex vivo des myoblastes étendues peuvent être utilisés pour intramusculaires expériences d'injection de cellules pour examen de la contribution des myoblastes à la régénération des fibres musculaires et les cellules satellites auto-renouvellement. Vingt-quatre heures avant l'injection des cellules, CTX est injecté dans les muscles TA de deux mois âgés souris immunodéficientes NOD / SCID. Myoblastes dissociées sont injectés dans le muscle CTX-induite de régénération (figure 3). Le muscle injecté peut être récolté quelques jours à plusieurs mois après l'injection. Les cellules donneuses sont généralement génétiquement marquées avec une protéine fluorescente verte (GFP) du gène 6, le gène β-galactosidase 16 de la phosphatase alcaline par 18 transfection du plasmide, l'infection par le vecteur viral, ou une préparation à partir de souris transgéniques portant un transgène. Les cellules satellites de Myf5 hétérozygote + / nlacZ de souris 19, dans laquelle les cellules myogéniques peuvent être détectées après coloration au X-gal, ont été isolés. Les souris Myf5 + / nlacZ portent le β nucléaire -. Galactosidase insérée dans le locus du gène Myf5, où l'expression du gène β-galactosidase récapitule l'expression endogène Myf5 dans les deux cellules satellites et cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes 20 La figure 3 montre l'ensemble TA coloration des muscles pour la détection de β-galactosidase-positives cellules dérivées du donneur nucléaire, qui comprennent les myoblastes en prolifération, les cellules satellites auto-renouvellement, et les fibres musculaires nouvellement formées. Si nécessaire, ces muscles TA colorées peuvent être utilisées pour se histologiquections pour d'autres méthodes d'immunodétection.

Figure 1
Figure 1. Préparation des cellules satellites musculaires du muscle squelettique de souris. A:. Mincing triceps disséqués et derrière le muscle du membre par ciseaux B:. Vue agrandie de la partie A C: trituration hachées morceaux de muscle de la collagénase-traité par 18 G aiguille D:. Filtration dissocié préparation musculaire par tamis cellulaire E:. MACS séparation des dissocié les cellules musculaires par colonne LD F:. MACS séparation des cellules musculaires dissociées par MS colonne G:.. cellules satellites fraîchement isolées H:. cellules satellites fraîchement isolées de Pax7-positif I: coloration au DAPI pour panneau G.


Figure 2. Culture de cellules satellites isolées. A, B, C: myoblastes d'anticorps positif anti-MyoD dérivées de cellules satellites fraîchement isolés D, E, F:. Chaîne anti-myosine lourde (MHC)-positif de différenciation des myotubes multi-nucléées.

Figure 3
Figure 3. L'injection intramusculaire de myoblastes élargis dans le muscle squelettique de souris. A: coloration X-gal de myoblastes isolés à partir de souris Myf5 + / nlacZ B, C:. Injection intramusculaire de Myf5 + / nlacZ myoblastes dans le muscle TA. Myf5 + / nlacZ dans la régénération des fibres musculaires. Coloration X-gal a été réalisée sur TA muscle injecté avec myoblastes de 1 mois.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce protocole, les cellules satellites quiescentes peuvent être facilement purifiés à partir de muscle squelettique de souris adultes, par digestion à la collagénase et de séparation MACS médiée par des anticorps de surface. Cette méthode prend environ 6 heures et ne nécessite pas d'équipement coûteux tel qu'une machine FACS. En outre, ce procédé est relativement peu coûteux par rapport à la surface médiée par les anticorps séparation FACS. On obtient un rendement plus élevé de cellules satellites de repos est également prévu par rapport au FACS pour cette méthode puisque l'exposition au laser FACS a tendance à induire la mort cellulaire lors de la séparation 15. D'autres méthodes d'isolation tels que prédépôt ou seule la culture de la fibre musculaire nécessitent quelques jours de culture, et donc, ces méthodes sont bonnes pour les cellules satellites activées ou l'isolement des myoblastes. Cependant, les cellules satellites quiescentes ne peuvent être purifiés par ces méthodes. Prédépôt méthodes comprennent la contamination des fibroblastes sur la base de leur différence d'adhérence entre les cellules satellites activés et des myoblastess 21. Cellule satellitaire activé ou myoblastes excroissance se produit pendant la culture unique de la fibre musculaire 22. On remarque également que les souris jeunes (âgés de 1-2 mois) présentent un rendement plus élevé de cellules satellites quiescentes (1-5 x 10 5 / souris) purifiées par cette méthode de séparation de MACS par rapport à des souris âgées. Cependant, la pureté des cellules satellites de muscle au repos endommagée est réduite après cette purification MACS d'anticorps médiée depuis la surface endommagée muscle contient plus de globules infiltrées. Pour la séparation MACS des cellules satellites quiescentes, nous avons utilisé CD45, CD31, et Sca-1 en tant que marqueurs de surface cellulaire pour la sélection négative. CD45 est un fabricant de cellules pan-hématopoïétiques; CD31 est un marqueur pour les cellules endothéliales; Sca-1 est un marqueur pour les cellules endothéliales et les cellules interstitielles 23. Pour la sélection positive, nous avons utilisé un anticorps monoclonal anti-α7 intégrine, qui colore les cellules satellites quiescentes ainsi que des cellules non musculaires dans le muscle squelettique. Plusieurs groupeségalement utilisé un anticorps anti-intégrine α7 pour la purification des cellules satellites de repos à base de FACS, en combinaison avec une autre sélection positive et négative les marqueurs 7,24. En outre, d'autres groupes utilisés d'anticorps contre CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26 ou 4-Syndecan 27 marqueurs de sélection positifs pour la purification des cellules satellites de repos à base de FACS. Un anticorps monoclonal de SM/C-2.6 a également été utilisé pour la sélection positive, tandis que l'épitope de cet anticorps monoclonal n'a pas encore été identifiée 1. Aucun de ces marqueurs de sélection positifs sont cellule-spécifique de satellite de repos. Par conséquent, l'élimination complète de ces cellules nonsatellite exprimant ces marqueurs de sélection positive est essentielle pour obtenir une grande pureté des cellules satellites quiescentes après triage. Il serait peut-être plus utile d'utiliser des marqueurs de surface cellulaire spécifiques des cellules satellites tels que M-cadhérine en tant que marqueur de sélection positive.

Facellules satellites quiescentes reshly isolés peuvent être utilisés pour les profils d'expression génique et protéique, des expériences de culture pour obtenir des myoblastes et la transplantation de cellules pour cellules satellites d'auto-renouvellement des expériences et des thérapies cellulaires. Des travaux antérieurs ont démontré que les profils d'expression des gènes sont significativement différents de cellules satellites activées, ce qui peut expliquer certaines des différences biologiques entre ces deux types de cellules (comme les cellules dans la phase dormante vs division. Actif de la cellule) 1, 28. Des travaux récents ont montré que les cellules satellites de repos fraîchement isolés possèdent greffe significativement plus élevée et l'activité d'auto-renouvellement par rapport à des cellules satellites activées ou myoblastes lorsqu'elles sont transplantées dans la régénération musculaire 6-7. Par exemple, moins de 100 cellules satellites quiescentes montrent la forte contribution à la régénération des fibres musculaires ainsi que de cellules satellites auto-renouvellement 5,7. Un conséquent, les cellules satellites quiescentes ont pu être isolésD contrôlée pour leur potentiel à greffer efficacement dans le muscle endommagé, leur contribution à la régénération des fibres musculaires, et leur amélioration de la fonction musculaire chez les patients atteints de DMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Shahragim Tajbakhsh pour fournir souris Myf5 + / nlacZ. Nous remercions également Alexander Hron et Michael Baumrucker pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Muscular Dystrophy Association (MDA) et Gregory Marzolf Jr. MD Centre Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics