조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

Published 11/06/2013
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Immunology and Infection

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Summary

청소부는 질병이없는 지역에 자신의 배설물에 전염성 전염성 해면상 뇌증의 프리온을 이동시키다 수있는 가능성이있다. 우리 마우스 적응 스크래피 프리온은 미국의 까마귀의 소화 기관 (까마귀 brachyrhynchos), 죽은 동물의 일반적인 소비자 비록 통과 후 감염성 유지 여부를 확인하는 데 사용 세부 방법.

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Fischer, J. W., Nichols, T. A., Phillips, G. E., VerCauteren, K. C. Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species. J. Vis. Exp. (81), e50853, doi:10.3791/50853 (2013).

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Abstract

감염성 프리온 PRP (해상도) 재료는 가능성이 치명적인 신경 퇴행성 전염성 해면상 뇌증 (TSE) 질병 (1)의 원인이된다. 만성 소모성 질병 (CWD) 등 TSE 질병의 전송은, 동물 2,3에 동물에서뿐만 아니라 환경 소스를 4-6로 추정된다. 청소부와 육식 소비와 CWD 오염 된 썩은 고기의 배설물을 통해의 PrP 해상도 물질을 이동시키다하는 가능성이있다. 최근 작품은 미국의 까마귀의 소화 시스템 (까마귀 brachyrhynchos), 공통 북미 헤매다 ~ 7의 PrP 해상도 물질의 통과를 기록했다.

우리는 미국의 까마귀를 통해 고해상도의 PrP 물질의 통과를 문서화하는 데 사용되는 절차에 대해 설명합니다. 크로우는 RML 변형 마우스 적응 스크래피와 gavaged하고, 배설물은 4 시간 포스트 위관을 수집 하였다. 까마귀 배설물로 다음 풀링 및 복강 주사 하였다C57BL / 6 마​​우스. 그들은 마우스 스크래피의 임상 증상을 표현하고, 그 후 안락사 될 때까지 마우스는 매일 관찰 하였다. 증상이 마우스는 365 일 후 접종 할 때까지 감시했다. 웨스턴 블롯 분석은 질병 상태를 확인하기 위하여 실시 하였다. 결과 프리온 테스트 마우스에있는 질병을 일으키는 원인이 까마귀의 소화 시스템을 통해 여행 후 감염을 유지하고 배설물에 존재하는 것으로 나타났다.

Introduction

전염성 해면상 뇌증 (TSE)는 야생 동물에 영향을 미치는 치명적인 전염성 신경 퇴행성 질환, 가축, 인간입니다. TSE 질병의 전염 물질은 프리온 단백질 1의 잘못 폴딩 또는 병원성 이소 PRP (해상도)이 나타납니다. 양과 염소의 스크래피,, 소 해면상 뇌증 (동물 TSE 질환 노새 사슴 (Odocoileus의 hemionus), 흰 꼬리 사슴 (Odocoileus의 virginianus), 엘크 (Cervus의의 elaphus), 그리고 사슴 (에 Alces alces)에 만성 소모성 질병 (CWD)를 포함 국내 가축의 BSE) 으 농장 밍크의 전염성 밍크 뇌증, 고양이의 고양이 해면상 뇌증, 인간이 아닌 영장류 8과 해면상 뇌증, 이국적인 동물원에 이국적인 유제 해면상 뇌증은 가족 Bovidae의 반추. 하나의 인간 TSE 질환, 변종 크로이츠 펠트 - 야콥 병은 희귀의 PrP RES-contamin 소비에 의해 인수 될 것으로 생각됩니다ated 음식 9. 오염 된 쇠고기가 10을 소비하는 경우 마찬가지로, BSE가 인간을 감염시킬 수 있습니다. 모든 TSE 질환, 스크래피와 CWD는 동물에서 동물 2,3,11뿐만 아니라 환경 소스를 4-6로 추정되는 자립 전염병 감염에 대한 근원을 가진 유일한 두 가지입니다. 연구는 대부분의 TSE 질환은 임상 증상의 발현에의 PrP 해상도 재료의 자연적인 노출 사건에서 주목할만한 확장 배양 기간을 필요로 2-4,6,8 및 명백한 종의 장벽을 최소화하지만, 종간 전송 12-14의 가능성을 제거하지 않는 것이 좋습니다 .

감염성 프리온 PRP (해상도) 물질의 확산 메커니즘을 식별 TSE 질환이 풍경을 가로 질러 이동하는 방법에 대한 질문에 대한 답변을 위해 매우 중요하다. 실험 조사는 15, 16, 가금류 및 돼지 17과 미국의 까마귀 (까마귀 풀어야 곤충 것을 제안했습니다hyrhynchos) 7,18가의 PrP 해상도 재료의 수동적 인 사업자 또는 분배기입니다. 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통로는 최근에 그들이 TSE 질환 (7)의 분산에 재생할 수있는 역할을 시연, 설명되어 있습니다. 이러한 결과는, 까마귀, 헤매다가 발생할 수 있음이 그럴듯하게 소비하고, 질병이없는 지역에, 대변 증착을 통해 전염성 물질을 수송한다.

우리가 여기에서 설명하는 절차는 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통과를 문서화하는 데 사용되었습니다 크게 관련 미래 연구의 다른 폐품과 육식 동물의 종 - 특정 모델에 이러한 방법의 적용을 용이하게합니다. 본 연구에서는 기존의 방법의 PrP 해상도 물질의 확산 및 전반적인 부담에 기여할 수의 PrP 해상도 재료를 인신 매매의 틀에 얽매이지 않는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다.

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Protocol

우리 프로토콜은 우리가 이전에 7을 발표 한에서 적용됩니다. 동물과 관련된 모든 절차는 미국 농무부 (USDA) 동식물 건강 검사 서비스 (APHIS), 야생 동물 서비스 (WS), 국립 야생 동물 연구 센터 (NWRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 까마귀 Gavaging

  1. 미국의 까마귀의 소화관을 통해 '의사 뇌 물질'의 통과 시간을 예상하고있다.
    1. 요리 (그림 1) 투여 바늘 2를 사용하여 청색 염료 및 위관 1 까마귀와 계란을 스크램블 5 ㎖를 혼합한다.
    2. 블루 / 그린 묻은 대변 배설을 더 이상 제공하지 않습니다 때까지 까마귀에게 30 분마다 확인합니다.
  2. 감염되지 않은 및 말기 RML (챈들러 주)에 감염된 C57BL / 6 마​​우스의 뇌를 얻습니다.
  3. 1X와 총알 블렌더 균질의 정상 20 % 중량 / 부피 감염된 마우스의 뇌 균질 생성인산염 완충 생리 식염수 (PBS)과 유리 구슬, 다음 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 1 분 3,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 멸균 PBS의 10 % 중량 / 부피를 생성하는 1X PBS의 동일한 볼륨을 넣어. 필요할 때까지 -80 ° C에서 동결.
  4. 이전 위관 17 시간은 까마귀 펜에서, 물없는 음식을 제거 할 수 있지만.
  5. 무작위로 치료 그룹에 까마귀를 할당하고 경구 투여 바늘에 2를 사용하여 정상 또는 감염 중 하나를 마우스의 뇌 균질 5 ㎖에 각 까마귀 위관.
  6. 전송 개별 케이지에 까마귀와 4 시간 포스트 위관 (그림 2) 각 케이지 내의 모든 배설물을 수집하고 풀.
  7. 균일 한 질감이 달성 될 때까지 유리 구슬 총알 믹서 균질화 각 까마귀에 대한 풀링 대변을 균질화. * 까마귀 배설물은 대부분 액체하고 쉽게 혼합 할 수 있습니다.
  8. 각 까마귀를 들어, 10 ㎖의 총 부피 9.5 ㎖의 1X PBS로 대변 균질의 500 μl를 희석.
  9. 배설물 homogena을 원심 분리기1,400 XG에 15 분 동안 테 상층 액을 추출합니다.
  10. 2 차 세균 감염의 위험을 최소화 균질의 100 μL 당 100 단위의 μL / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (인비 트 로젠, NY)와 상층 액을 치료하는 다음 줄이기 위해 20 분 동안 실온에서 UV 빛의 밑에 배치 바이러스와 세균 오염의 위험이 있습니다. UV 노출 후, 남아있는 미생물의 세포막을 방해하는 30 초 70를 설정에서 3000 MP를 초음파기의 초음파 처리 샘플.

2. 마우스 접종

  1. 무작위로 다음 치료 그룹 (표 1)에 마우스를 할당 :
    1. 그룹 1 - 긍정적 인 치료 마우스는 구두로 5 ㎖에 감염된 마우스의 뇌에 gavaged 까마귀의 배설물 균질 1 ㎖로 (IP)을 복강 내 주사.
    2. 그룹 2 - 음의 치료 마우스는 경구 5ml는 정상 마우스의 두뇌와 gavaged 까마귀의 배설물 균질 1 ㎖로 IP를 접종.
    3. infecte 희석1:100 W / 1X PBS에서 V에 그룹 3, 4 D와 일반 마우스의 뇌 균질.
    4. 그룹 3 - 긍정적 인 제어 마우스는 감염된 마우스의 뇌 파쇄 액 1 ㎖로 IP를 접종.
    5. 그룹 4 - 음성 대조군 마우스는 정상 마우스의 뇌 균질 물 1 ㎖로 IP를 접종.
치료 그룹 동물의 수
그룹 1 스크래피 + 까마귀 배설물 (100)
그룹 2 스크래피 - 까마귀 배설물 25
그룹 3 스크래피 + 마우스의 뇌 10
그룹 4 스크래피 - 마우스의 뇌 5

. 표 1 스크래피 접종의 상태 (음 양의 +, -)과 동물의 수는 7을 사용했다.

  1. 복강 마우스를 접종 :
    1. 부드럽게 목덜미의 엄지와 검지 손가락으로 등쪽 목 모피로 마우스와는 복부 측면을 노출 회전.
    2. 머리가 약간 낮은 그래서 마우스의 후방 끝을 올립니다.
    3. 1cm 피부, 중간 선 1 센티미터 측면을 통해 25 G 바늘을 삽입하고 1~2cm 전방 천장 관절에 바늘 잠금 주사기를 사용.
    4. 1 ml의 마우스 체강 내에 접종 천천히 주입한다.

3. 마우스 모니터링

  1. 그들은 마우스 스크래피의 임상 증상을 표현할 때까지 매일 쥐를 모니터링합니다. 임상 적 증상이 포함될 수 있습니다 : 후만 변형, 운동 장애, 뻣뻣한 꼬리, 손질의 부족, 쇠약, 무기력합니다.
  2. 0 표시 = 없음, 1 = 보통, 2 = 심한 곳에 흔적이 분명 할 때 6 임상 증상 각각에 대해 마우스를 점수.
  3. 각 기호에 대한 일일 총 점수는 1 일 동안 ≥ 8에 도달 할 때 쥐를 안락사, ≥ 6 연속 3 일간, 또는 365에서 일 접종 (DPI)을 배치한다.
  4. 수확의 두뇌 바로 다음에 euthan-70 ° C에서 아시아 및 저장
  5. , 스크래피의 진단을 확인하기 다음과 같이 희석 된 단백질 분해 효소-K 용액 (PK)의 50 ㎍ / ㎖의 3 μL와 뇌 샘플을 소화하기 : 3.1. μL PK, 500 mM의 EDTA의 12.5 μL, pH가 8, 45 ° C에서 30 분 동안 1X PBS의 109.39 μL은 다음 8 μL 로딩 버퍼를 추가하고 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 배양하여 PK를 비활성화. 12 % SDS-PAGE 젤, electrophorese 실온에서 1 시간 동안 PBS 0.2 % 트윈 20 Immobilon (PVDF) 막 5 % 무 지방 우유와 함께 블록에 전송 상에로드 샘플. 다음, 상온에서 1 시간 동안 슈퍼 블록에 희석 냉이 퍼 옥시 다제,에 접합 Bar224 안티의 PrP 단일 클론 항체로 프로브. PBS-0.2 % 트윈 20과 1 시간 동안 멤브레인을 씻어. 시각화, G-상자 젤 문서 시스템에 화학 발광 기판과 이미지로 웨스턴 블롯 5 분을 배양합니다.

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Representative Results

사용 절차는 까마귀의 소화 시스템이 스크래피 뇌 균질 7의 경구 위관 이후의 PrP 해상도 감염 4 시간을 제거하지 않음을 보여줍니다. 의 PrP 해상도 재료로 gavaged 된 모든 스물 까마귀 이후 마우스에 대변을 통해의 PrP 해상도의 자료를 전송. 병에 걸린 마우스는 임상 마우스 스크래피 증상과 질병의 확인이 웨스턴 블롯 분석에 의해 완성되었다의 발현에 의해 확인되었다.

까마귀에 의해 섭취 된 물질의 유지 시간의 조사는 대변에있는 염료의 존재 (그림 1)에 따라 4 시간, 될 수있는 gavaged 까마귀의 소화관 통과 시간을 공개했다. 모든 배설물은 일회용 피펫으로 수집하고 각 까마귀 (그림 2)을 위해 풀링했다. 치료 까마귀 배설물에서 급성 독성 원시 배설물 상등액 파일럿 테스트 마우스에 IP를 주입 할 때 발생했습니다. 페니실린과 Stre에와 배설물 접종 처리하여ptomycin, UV 빛, 그리고 초음파 우리는이 문제를 완화.

하나 스크래피 양성 마우스의 뇌 (9 / 9) 또는 스크래피 접종 까마귀의 배설물을 접종 모든 마우스는 (66 * / 84) 임상 증상을 개발하고 (그림 3) 웨스턴 블롯 분석하여 양성, 쉽게 통과하는 스크래피를 설명 까마귀 인한 질병의 소화 시스템. * 여덟 마우스는 가능성으로 인해 독성, 접종 3 일 이내에 사망했다. 모든하지만 하나 (1 / 23) 스크래피 부정적인 접종 마우스는 웨스턴 블롯 분석에 의한 음성이었다. 우리는이 마우스가 실수로 스크래피 부정적인 까마귀에서 스크래피 양성 까마귀 배설물 대신 대변 접종 가설.

그림 1
그림 1. 까마귀는 청색 염료 (A)와 B와 혼합 계란 5 ㎖를 사용하여 수동으로 억제 경구 gavagedLUE / 대변 4 시간 포스트 위관 (B)를 녹색 스테인드. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 이전의 균질화에 피펫 까마귀 배설물 수집. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. . 생물 검정에서 마우스 뇌의 대표 SDS 페이지 웨스턴 블롯 NBH-일반 마우스의 뇌 균질, 스크래피 음성, TX 케이지 4 - 스크래피 접종 까마귀의 배설물을 접종 마우스의 뇌. (+) 및 withou로t (-). PK (단백질 분해 효소 K) 소화 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

우리는 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통과를 문서화하는 과정을 보여줍니다. 우리는 까마귀는 질병이없는 지리적 영역의 PrP 해상도 물질을 이동시키다 수있는 능력을 가지고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법을 사용했다. 다른 사람은 그것을 제거하는 데 실패 둘 다 19 ~ 21과 설치류 (22, 23) 소화 체액을 반추하는의 PrP 해상도의 저항을 평가했다. 그들은 또한 잠재적으로 썩은 트리암시놀론 주입술 해상도 물질 발생 및 프리온 질병의 확산을 촉진 풍경을 통해이 물질을 수송 할 수 이러한 기술의 미래 응용 프로그램은 다른 육식 동물 (24)에 적용되어야한다.

우리는 까마귀의 소화관을 통해 균질 마우스 뇌의 대략적인 통과 시간을 평가하는 간단한 방법을 제공하고, 우리의 스크램블 '의사 두뇌 물질에 파란색 식용 색소를 추가했습니다. 우리는 첫 번째 인이 기술을 고려하여 다른 사람을 조언연구 동물의 기존의 대변 색을 PECT 후 가장 대조적이다 식용 색소를 사용합니다. 이 연구 동물을 통과 한 식품 용 염료 염색 재료의 쉽게 식별 할 수 있습니다. 우리는 통과 시간을 추정하기 위해 식용 색소를 사용하기로 결정했습니다,하지만 다른 형광 안료 (25), 산화철 26 일 컬러 플라스틱 마커 (27), 및 컬러 금속 조각 (즉, 반짝 반짝) 28를 사용했습니다.

까마귀 배설물에서 이차 세균 감염의 위험을 최소화하고 제대로 접종 마우스는 긴 배양 기간이 필요 마우스 프리온 연구를위한 중요한 출발점입니다. 이러한 고려 사항 중 하나라도 위반하면, 초기 마우스의 사망이 발생할 가능성이있다.

조사에 대한 또 다른 가능한 도구는 경구 투여 까마귀로, 전염성 물질을 통과하는 시간 후에 설치하는 시간이 지남에 까마귀 배설물 샘플을 평가하는주기 증폭 또는 sPMCA을 misfolding의 시리얼 단백질이다마우스 생물 검정의 필요성 아웃. 풀 퍼드에 의해 PMCA 배설물 분석의 최근 발전, 등. PMCA 또한 조류 배설물을 평가하기위한 유용한 도구가 될 수 있습니다 제안, 프리온의 분 수준의 증폭은 포유 동물의 배설물 (29)에 검출 할 수 있음을 나타냅니다. 마우스 생물 검정 및 sPMCA 방식은 CWD 감염 물질로 gavaged 까마귀의 배설물에 잔류 감염을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. cervidized 유전자 변형 마우스 라인이 필요하며 복강 내 접종 대 뇌내 될 것은 더 빠른 결과를 줄 것이다.

이러한 까마귀, 독수리와 독수리 등 조류 제거제는, 즉 CWD 북미, TSE 질병의 확산에 역할을 할 수 있습니다. 이 종은 (사냥꾼 사망 cervids의 경우) 병에 걸린 시체 또는 내장에서 CWD 양성 조직을 소비하고 CWD가없는 지역이나 cervids의 인구에 자신의 배설물에서 감염 물질을 이동시키다 수 있습니다. 에, cervids에 곡물을 공급하는 사례로 야생 또는 포로설정은 음식 소스에 배변 할 수 있으며 실수로 cervids 소비 할 까마귀를 받고, 따라서 위험이 높은 연습 (VerCauteren 개인 관찰)입니다. 임의의 배설물 증착을 통해의 PrP 해상도 물질을 발생 CWD없는 동물의 확률이 낮은있을 수 있지만 또한, 까마귀 따라서 그들의 배설물이 집중되는 분야는 공동 앉을 때 사이트 다음과 같은 프리온 때문에 질병 전파 위험이 높은 영역으로 될 수 환경 (30, 31)에서 이렇게 지속적입니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는이 연구와 USDA에 사용 된 까마귀를 제공하기위한 S. 베르너에게 감사의 말씀을 전합니다, APHIS, 동물 관리 및 모니터링을위한 WS, NWRC 동물 관리 직원. 기재 또는 제품의 사용은 USDA의 보증을 의미하지는 않습니다. 이 연구를위한 자금 조달은 USDA, APHIS, 수의 서비스에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice Hilltop Lab Animals
American crows wild captured
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered Saline Invitrogen 70011-044
Sonicator Misonix
Proteinase-K solution Roche 3115887001
Loading buffer Invitrogen NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel Invitrogen NP0342
Immobilon PVDF membrane Millipore 1SEQ00010
Tween 20 Sigma Aldrich P2287
Bullet blender homogenizer Braintree Scientific BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody Cayman Chemical 10009035
Superblock Thermo Scientific 37517
chemiluminescent substrate Millipore WBKLS0500
G-box gel documentation system Syngene

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References

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