Membraanpotentiaal Dye beeldvorming van ventromedial hypothalamus neuronen van volwassen muizen om te studeren Glucose Sensing

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De activiteit van enige neuronen uit-volwassen leeftijd muizen kunnen worden bestudeerd door te distantiëren neuronen uit specifieke gebieden van de hersenen en het gebruik van fluorescerende membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming. Door het testen respons op veranderingen in glucose, kan deze techniek worden gebruikt om de glucose gevoeligheid van volwassen ventromediale hypothalamus neuronen te bestuderen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studies van neuronale activiteit worden vaak uitgevoerd met behulp van neuronen tegen knaagdieren minder dan 2 maanden als gevolg van de technische problemen in verband met het verhogen van het bindweefsel en een verminderde neuronale levensvatbaarheid die zich voordoen met de leeftijd. Hier beschrijven we een methode voor de dissociatie van gezonde neuronen van de hypothalamus van volwassen leeftijd muizen. De mogelijkheid om neuronen studie van volwassen leeftijd muizen maakt het gebruik van ziektemodellen die zich manifesteren op latere leeftijd en mogelijk meer ontwikkelingsgebied nauwkeuriger voor bepaalde onderzoeken. Fluorescentiebeelvorming van gedissocieerde neuronen worden gebruikt om de activiteit van een populatie van neuronen te bestuderen, in tegenstelling tot het gebruik elektrofysiologie een neuron bestuderen. Dit is bijzonder nuttig bij het bestuderen van een heterogene neuronale populatie waarbij het gewenste neuronale type is zeldzaam zoals hypothalamus glucose sensing neuronen. We gebruik gemaakt van membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming van volwassen ventromedial hypothalamus neuronen om hun reacties te bestuderen om change's in extracellulaire glucose. Glucose sensing neuronen worden verondersteld een rol te spelen bij centrale regulatie van de energiebalans. Het vermogen om glucose sensing studie bij volwassen knaagdieren is bijzonder nuttig omdat het overwicht van aandoeningen gerelateerd aan disfunctioneel energiebalans (bijv.. Obesitas) toe met de leeftijd.

Introduction

De hersenen reguleert energie homeostase door de neuro-endocriene en autonome zenuwstelsel. De ventromediale hypothalamus (VMH), bestaande uit de ventromediale kern (VMN) en de boogvormige nucleus (ARC), is belangrijk voor de centrale regulatie van energie homeostase. Gespecialiseerde glucose sensing neuronen, in de VMH, koppelen neuronale activiteit en perifere glucose-homeostase 1. Er zijn twee soorten glucose sensing neuronen, glucose opgewekt (GE) neuronen verhogen en glucose geremd (GI) neuronen verminderen hun activiteit extracellulair glucose toeneemt. VMH glucose sensing neuronen algemeen bestudeerd middels elektrofysiologie of calcium / membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming.

De elektrofysiologische patch clamp techniek wordt beschouwd als de gouden standaard in de studie van ex vivo neuronale activiteit. In deze techniek wordt een glazen micropipet elektrode naar de celmembraan via een grote weerstand gekoppeld(GQ) afdichting. Patch clamp elektroden mogelijk real time opname van actiepotentiaal frequentie (stroomtang) of ion geleidbaarheid (voltage clamp) verandert binnen een enkel neuron. Terwijl de patch-clamp techniek geeft informatie over veranderingen in specifieke ionkanaal geleidingen, een groot nadeel is dat slechts een neuron waargenomen tegelijk. Het duurt ongeveer 30-45 minuten van de opname te controleren of men opneemt van een glucose-sensing neuron voordat zelfs het begin van een bepaalde experimentele behandeling. Bovendien GI en GE neuronen omvatten <20% van de totale VMH neuronale populatie. Compounding dit probleem is het gebrek in veel gevallen, een identificatie cellulaire marker voor deze neuronen. Het is dus duidelijk dat ondanks waardevolle elektrische informatie die andere technieken niet patch clamp analyse bewerkelijk, tijdrovend en lage opbrengst.

Het gebruik van fluorescentie beeldvorming van gedissocieerde VMH neuronen maakt de studie van hundreds neuronen tegelijk. Calcium gevoelige kleurstoffen kunnen worden gebruikt om intracellulair calcium veranderingen, die indirect correleren met veranderingen in neuronale activiteit te meten. Membraanpotentiaal gevoelige kleurstoffen worden gebruikt om membraanpotentiaal veranderingen te monitoren. Meten cellulaire membraanpotentiaal een directere index van neuronale activiteit vergeleken met veranderingen in intracellulaire calcium. Bovendien membraanpotentiaal kleurstof (MPD) beeldvorming detecteert potentieel kleinere veranderingen in membraanpotentiaal waar actiepotentiaal afvuren niet wordt gewijzigd en intracellulair calcium niveaus zou niet kunnen veranderen. Beide fluorescentie beeldvorming technieken gebruikt om VMH glucose sensing neuronen bestuderen van jonge muizen 2-7. Terwijl de resultaten minder gedetailleerd dan die verkregen met patch clamp elektrofysiologie, de sterkte van beeldvormende experimenten is dat ze gelijktijdig evalueren van een grote populatie van cellen die onvermijdelijk zijn een groot aantal glucose sensing neuronen. MPD beeldvorming iis vooral handig voor het bestuderen van GI neuronen die meer uniform gelokaliseerd in het hele VMH zijn, dus een adequaat bevolking om te studeren in de gedissocieerde VMH (~ 15% GI). Daarentegen, terwijl GE neuronen dicht zijn gelokaliseerd in het ventrolaterale-VMN en mobiele arm gebied tussen de ARC en VMN, zij geen aanzienlijk aantal neuronen in de VMH (<1% GE) vertegenwoordigen. Bovendien, door het bestuderen van geïsoleerde neuronen, astrocyten en presynaptische effecten worden geëlimineerd. Dit kan een voordeel bestuderen eerste orde neuron effecten, evenals een nadeel omdat fysiologische verbindingen en processen verloren.

Een beperkende factor in zowel patch clamp elektrofysiologie en MPD / calcium kleurstof beeldvorming de noodzaak jongere dieren (bijv.. Muizen of ratten <8 weken oud) gebruikt. Dit is voornamelijk te wijten aan toegenomen bindweefsel in combinatie met verminderde neuronale levensvatbaarheid die optreedt met de leeftijd. In brain-slice elektrofysiologie studven, verhoogd bindweefsel maakt het moeilijker om de neuronen te visualiseren. Verhoogde bindweefsel maakt het ook moeilijker om een ​​groot aantal gezonde neuronen dissociëren voor imaging studies. Bovendien neuronen van jongere dieren langer overleven tijdens ofwel patch clamp opnamen of beeldvorming. Echter, het gebruik van jonge muizen een belangrijke beperking zijn. Neuronale activiteit en / of reacties op neurotransmitters of voorkwam nutriënten veroudering veranderen. Bijvoorbeeld, omdat energiebalans nauw verbonden is met de reproductieve status van de hypothalamus neuronen reguleren energiebalans kunnen anders reageren in de pre-vs postpubescent dieren. Bovendien zijn veel ziekten vereisen een langdurige behandeling of niet manifesteren tot volwassenheid. Prime voorbeelden van dergelijke ziekten zijn dieet obesitas of diabetes mellitus type 2. Aangezien glucose sensing neuronen worden verondersteld een rol te spelen bij deze ziekten hebben we een methode voor het succesvol kweken van gezonde volwassen VMH neuronen voor gebruik in MPD beeldvorming experiments.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dieren

  1. Alle procedures werden goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik bij de Universiteit van Geneeskunde en Tandheelkunde in New Jersey.
  2. Groepshuis mannelijke C57BL / 6 muizen op een 12 hr light/12 uur donker schema en laat ad libitum toegang tot water en voedsel. Sacrifice 4-5 maanden oud. Euthanasie van de muizen werd uitgevoerd met de chirurgische vlak van anesthesie en een secundaire vorm van euthanasie (dwz doordringen incisie in de borstholte via het membraan). Dit is consistent met de AVMA richtsnoeren inzake euthanasie.

2. Voorbereiding van perfusieoplossing, Coverslips, glazen pipetten en Media

  1. Voeg 1L perfusie oplossing bestaande uit 2,5 mM KCl, 7 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2PO 4, 28 mM NaHCO 3, 0,5 mM CaCl2, 7 mM glucose, 1 mM ascorbaat en 3 mM pyruvaat in gedestilleerd dH 2 O. Pas de osmolariteit tot ~ 300 mOsm behulp van ongeveer 80 g / l sucrose. Oxygenaat door borrelen met 95% O 2/5% CO2 en de pH op 7,4. Elk experiment wordt ongeveer 200 ml perfusievloeistof vereist. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal 2 maanden.
  2. Voeg 250 ml Neurobasal stock bevattende Neurobasal medium zonder glucose, 2,5 mM glucose en 100 U / ml penicilline streptomycine. Pas de osmolariteit van de Neurobasal voorraad tot 280 mOsm gebruik sucrose. Maak 500 ml Hibernate voorraad met Hibernate-A media zonder glucose, 2,5 mM glucose, en 100 U / ml penicilline streptomycine.
  3. Roer beide bestanden goed en filter-steriliseren met behulp Stericup vacuümfilter eenheden. Wees voorzichtig niet om glucose of andere verontreinigingen te introduceren door het glaswerk of roer bars. Wikkel de flessen in folie aan de media te beschermen tegen licht en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden.
  4. Vlam de tips van 4 autoclaaf glazen pipetten (9 in), zodat de tips niet longer scherp en de opening diameters zijn groot (~ 0,9 mm), medium-large (~ 0,7 mm), medium (~ 0,5 mm) en kleine (~ 0,3 mm). De grootste dient nauwelijks worden gepolijst en de kleinste moet ongeveer een derde van die diameter.
  5. Op de dag voor de oogst neuronen, schoon vier 25 mm dekglaasjes met behulp van 70% ethanol en die over een bunsenbrander vlam. Plaats elke dekglaasje in een steriele 35 mm cultuur schotel en voeg 2 ml steriel 1% poly-D-lysine in dH 2 O. Leg de schalen in een incubator (37 ° C) gedurende de nacht. De volgende dag, wassen met steriele dH 2 O 3x en laat coverslips volledig droog.
  6. Voeg 75 ul aliquots van 1 M melkzuur en 200 ul aliquots GlutaMAX, bewaar bij -20 ° C. Volledig ontdooien aliquots van melkzuur en GlutaMAX voor gebruik om homogeniteit.
  7. Op de dag van de oogst neuronen, maken 30 ml vers kweekmedium bestaande uit Hibernate-Een voorraad die 1 mM melkzuur, 0,5 mM GlutaMAX, en 2% B27 zonder insuline. Vortex en pH op 7,4 met 1 N NaOH.
  8. Put 10 ml kweekmedium in een 60 mm glazen petrischaal op ijs gezet 2 ml in een 15 ml conische buis op ijs en houden de resterende media bij kamertemperatuur.
  9. Op de dag van de oogst neuronen, maken 25 ml vers kweekmedium bestaande uit Neurobasal voorraad bevattende 1 mM melkzuur, 0,5 mM GlutaMAX en 2% B27 zonder insuline. Vortex en pH op 7,4 met 1 N NaOH. Laat de verse groeimedia equilibreren in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende minstens 30 minuten.

3. Cardiale perfusie

  1. Volledig ontdooien 200 ml perfusievloeistof en oxygenaat met 95% O 2/5% CO 2 op ijs gedurende ten minste 15 minuten.
  2. Was een vibratome lemmet met aceton, 70% ethanol, en dH 2 O. Plaats het mes in de vibratome.
  3. Spoel de vibratome koelkamer en perfusieslang met dH 2 O. Vul de koelkamer (4 ° C) Met perfusievloeistof en blijven zuurstof.
  4. Verdoven een muis met pentobarbitalnatrium 50 mg / ml, 1:1 verdund met steriel water, intraperitoneaal geïnjecteerd. Controleer of de muis is volledig verdoofd door knijpen de staart en het observeren geen reactie.
  5. Giet koude perfusie oplossing in de perfusie reservoir en slangen vlak voor dissectie. Spaar 20-30 ml voor hersenen dissectie en blijven zuurstof op ijs. Zwaartekracht vanaf een verhoogde 60 ml spuit door buizen en een 20 G naald zorgt voor voldoende doorstroming. Laat de oplossing loopt tot luchtbellen zijn uitgewassen. Doorgaan naar zuurstof.
  6. Bezuinigen huid boven de ribbenkast van de muis. Til de ribbenkast en voorzichtig een horizontale snede door het middenrif. Maak twee zijdelingse snijdt door de ribbenkast omhoog naar de armen naar het hart bloot te leggen. Een tang te leggen dat de ribbenkast.
  7. Maak een kleine 2 mm gesneden in de rechterboezem naar een uitgang voor het bloed uit de Vascu te wassen biedenlar systeem.
  8. Prik de linker ventrikel met de perfusie naald, net genoeg om de naald opening plaatst. Houd de naald met een hand en start de stroom perfusievloeistof met de andere hand. Na 10-15 ml van de perfusie-oplossing, moet het bloed worden uitgewassen en het effluent zal duidelijk.

4. Brain snijden en Dissection

  1. Na cardiale perfusie overdracht geoxygeneerde koude perfusievloeistof een petrischaal op ijs vlak voor gebruik.
  2. Snel onthoofden, verwijder de hersenen uit de schedel en plaats de hersenen in perfusie-oplossing. Naar de hersenen te verwijderen: trek de huid naar voren, maak een middellijn snede in de schedel naar de oogkassen, maken 2 laterale bezuinigingen naar elk oog, een tang om terug te trekken elke kant van de schedel, maak een coronale snede tussen de oogkassen, en Gebruik een spatel om voorzichtig te overhalen de hersenen uit in perfusie-oplossing. Gebruik een schaar om de optische traktaten knippen indien nodig. Doe de hypothalami niet aan te rakenc gebied en trek niet de optische traktaten want dit legt te veel druk op de mediaan eminentie en onderliggend weefsel hypothalamus.
  3. Gebruik een scheermesje en naald zijdelings trimmen het hersenweefsel ongeveer 3 mm achter en juist voor de hypothalamus, terwijl het weefsel wordt ondergedompeld (bregma -3,52 mm). Het is vooral belangrijk voor de voorste kant gesneden niveau zijn, zodat de hersenen direct zal zitten op de vibratome boorkop.
  4. Verwijder het resterende hersenweefsel van oplossing en gebruik papieren filter om lont weg oplossing uit de gemonteerde sectie hersenen.
  5. Plaats een schar van superlijm op een vibratome boorkop en verspreid de lijm om de grootte van de hersenen. Zet het hersenweefsel bovenop de lijm met de voorste zijde naar beneden en de hypothalamus tegenover het blad. Wick overtollige lijm en plaats de boorkop in de vibratome koelkamer. Wees voorzichtig veel lijm niet te laten zoals het zal borrelen rond de hersenen wanneer geplaatst in de oplossing.
  6. Met de vibratome ingesteld op een lage snelheid (niveau 2) en hoge amplitude (niveau 9), maken 300-500 micrometer plakjes tot het bereiken van de hypothalamus gebied. Maak nu dunne 100 micrometer plakjes snijden van de achterste naar de voorste. De visuele signalen zijn als volgt. Posterior aan de hypothalamus de derde ventrikel erg klein zijn (bregma -2,70 tot -2,30 mm). Op bregma -2.30 mm, is de derde ventrikel in dorsale en ventrale gescheiden delen van de coronale slice.
  7. Zodra gedeelten van de derde zekering ventrikel, maken twee 500 micrometer plakjes die de juiste regio van de VMH (bregma -2,18 tot -1,22 mm) zal bevatten. Juist voor de VMH, de derde ventrikel niet meer uitstrekt tot de ventrale vloer van de hersenen (bregma -1,06 tot -0,82) 8.
  8. Breng deze plakken op de petrischaal op ijs met cultuur media. Ontleden de VMH (VMN + ARC) zoals getoond in figuur 1. Gebruik een pipet om voorzichtig overdracht van de VMH stukken in 2 ml van de cultuur media op ijs.

5. Dissociatie en cultuur

  1. Verwijder de VMH uit ijs en plaats bij kamertemperatuur. Voeg 20 U / ml papaïne tot 4 ml van de cultuur media. Omkeren te mengen en plaats in een 34 ° C waterbad. Controleer en meng door omkeren elke minuut tot de spijsvertering media is niet meer troebel. Filter (0,22 um) in een steriele kolf en plaats het weefsel om de destructie media.
  2. Digest de weefsel door schudden bij 100 rpm bij 34 ° C gedurende 30 minuten.
  3. Bereid 1 ml medium bevattende 8% runderserumalbumine (BSA) tijdens het verteringsproces. Los 80 mg BSA in 1 ml kweekmedium en filter (0,22 um) in een conische buis.
  4. Was het weefsel door de overdracht aan 5 ml van de cultuur media in een conische buis en langzaam een ​​keer omkeren.
  5. Voeg 30 ul DNase enzym tot 6 ml van de cultuur media en meng tot aanwrijving media. Zuig het wassen media en voeg 3 ml fijnwrijving media.
  6. Gebruik de glazen pipetten om vermaal in de orde van largest naar klein. Zachtjes vermaal 10x en wacht 4 minuten voor grotere stukken te vestigen. Gebruik de tweede pipet naar de top 2 ml met een gedissocieerde celsuspensie om een ​​nieuwe conische buis te brengen. Voeg 2 ml triturering media, vermaal 10x en 3 min. wachten. Met de derde pipet boven 2 ml dragen aan de celsuspensie. Voeg 1 ml triturering media, vermaal 5x en wacht 2 minuten. Gebruik vierde pipet boven 2ml dragen aan de celsuspensie.
  7. Laag het gedissocieerde celsuspensie bovenop de 8% BSA, en let niet te mengen. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
  8. Plaats geautoclaveerd 6 mm x 8 mm kloneringscilinders in het midden van elke dekglaasje. Dekglaasjes moet volledig droog zijn. Aspireren en resuspendeer de pellet in 440 ui warm groeimedia. Vul kloneringscilinders de neuronale suspensie en plaats in de incubator gedurende 20 minuten.
  9. Verwijder de kloneringscilinders en zeer voorzichtig afwassen vuil. Vul elk gerecht wie 2 ml groeimedium. Laat cellen herstellen gedurende ten minste 1 uur voordat testen worden uitgevoerd.

6. Voorbereiding voor MPD Imaging

  1. Voeg opnemen oplossing bestaande uit 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, 1,2 mM MgSO4, 0,97 mM K 2 HPO 4, 0,23 mM KH 2PO 4, 5 mM NaHCO 3 en 25 mM HEPES. Breng de pH op 7,4.
  2. Glucose toe te voegen aan de gewenste lage glucose-oplossing (0,1-2,0 mM glucose) te maken. Meng goed en reserveer 400 ml laag glucose-opname oplossing. Glucose toe te voegen aan de overige 600 ml tot 2,5 mM glucose opname-oplossing te maken en meng.
  3. Bescherm kleurstof van licht zoveel mogelijk. Voeg 4 ml van kamertemperatuur Buffer een Blue MPD flacon. Meng goed en voeg 5 pl kleurstof per ml opname oplossing. Bewaar oplossing homogeen vermengen van de pipet tussen oplossingen. De kleurstof bevat fluorescerende molecules, welke cellen gaan met depolarisatie en uitdover moleculen, kan die het celmembraan niet oversteken. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C en binnen 4 dagen. Niet vries-dooi meer dan eens.
  4. Incubeer cellen in 2 ml 2,5 mM glucose opnemen oplossing plus kleurstof bij 34 ° C gedurende 30 minuten. Een droge verwarmingsblok worden gebruikt. Bescherming tegen licht.
  5. Bereid spuit pompen en perfusie-systeem met 2,5 mM en 0,1 mM recording oplossingen plus kleurstof. Tubing van 60 ml spuiten moet worden aangesloten op een verzamelleiding.
  6. Na het stoppen van elke pomp, wacht ~ 10 seconden voordat u oplossingen op het spruitstuk om drukopbouw in de spuit te voorkomen. Drukveranderingen veranderen vloeistof levering aan de gesloten kamer met de neuronen, waardoor veranderingen in de microscoop nadruk tijdens het experiment en verstoring van de beelden.
  7. Het spruitstuk uitgangsbuizen moet worden aangesloten op een in-line verwarming en polyethyleen buis, die wordt aangesloten op een gesloten kamer. Bubbles moet worden ontruimd en de perfusie tarief moet worden ingesteld op 0,5 ml / min. Bescherming tegen licht.
  8. Transfer 25 mm dekglaasje met aanhangend neuronen aan de gesloten kamer, en let niet te laten dekglaasje om te drogen en niet om luchtbellen te introduceren. De slip is uitgelijnd in de groeven van de onderste stuk wordt een paar druppels opnameoplossing geplaatst langs de zijkanten en het bovenste stuk wordt voorzichtig aangebracht op het dekglaasje op zijn plaats.
  9. Gebruik een pipet om de kamer te vullen met de opname-oplossing en plaats dan een 18 mm dekglaasje bovenop. Passen goed witte ring in de kamer aan de kleinere dekglaasje plaats te houden. Druk naar beneden heel langzaam en licht om luchtbellen te voorkomen worden geïntroduceerd in de gesloten kamer.
  10. Start de injectiepomp voor de 2,5 mM glucose opname oplossing, drukt u op de witte ring, en maak verbinding met de gesloten kamer. Langzaam druk te laten ontsnappen uit witte ring en maak verbinding met slang leidt tot een afvalcontainer.
e "> 7. MPD Imaging

  1. Centreer de neuronen met behulp van lage helderveld licht. Probeer de tijd de cellen worden blootgesteld aan licht te minimaliseren.
  2. Laat het perfusie-systeem te lopen voor 10 min om te zorgen voor stabilisatie van de temperatuur, focus, en kleurstof evenwicht.
  3. Tijdens het aanzuigen, opent u het MetaMorph programma en een helder beeldveld (10x) van de neuronen te nemen. Gebruik de Auto-Focus functie om 3 stapels fluorescerende beelden (150 msec, Smalle Cy3 filter, 10X) te nemen en bepalen de focus binnen 5 micrometer. Aan het einde van de 10 min aanloopperiode, controleer nogmaals de aandacht.
  4. Begin met fluorescerende beelden op te nemen elke 30 seconden gedurende 40 minuten. Stel een basislijn bij 2,5 mM glucose gedurende 10 minuten, vervolgens af glucose gedurende 15 minuten, en uiteindelijk naar 2,5 mM glucose gedurende 15 minuten. Oplossingen worden gewijzigd door het stoppen van een spuitpomp, wacht 10 seconden, draaien van een poort van het spruitstuk en vanaf een injectiepomp. Wijzigingen moeten vooruit gewenste tijdstippen ba optredensed op de vertraging tussen het spruitstuk en cellen.
  5. Na het opnemen van alle fluorescerende beelden, neem een ​​helder veld beeld van de neuronen.

8. MPD Imaging Analysis

  1. Gebruik MetaMorph tot ovaal gebieden rond elke cel te creëren in het beeld helder veld aan het einde van het experiment. Regio moet iets groter is dan elk neuron en kan minimaal 1 pixel buiten donkere rand van de cel. Niet cellen die ongezond, overlappende, of dichtbij puin zijn kiezen. Ongezonde cellen verschijnen vaak donker. Ten slotte maken 5 grote ovale gebieden in gebieden waar geen cellen of puin voor achtergrond metingen.
  2. Breng de regio om alle fluorescerende beelden en te inspecteren om te controleren of er geen beweging / verschuiving opgetreden. Gebruik de Measure-functie om de fluorescentie-intensiteit van elke regio op te nemen voor alle afbeeldingen in een Excel-bestand. Het gebruik van tijdschriften in Metamorph wordt geadviseerd.
  3. In Excel, maakt een gemiddelde van de 5 regio's achtergrond voor elke tlafbeelding ent. Dit vertegenwoordigt de gemiddelde achtergrondwaarde op elk tijdstip. Voor elk beeld / tijdstip, aftrekken van de achtergrond van alle regio metingen. De achtergrond afgetrokken fluorescentie-intensiteit zullen worden aangeduid als Intensity hiernamaals.
  4. Voor elke cel, het berekenen van de gemiddelde intensiteit gedurende 2-8 minuten opnametijd. Dit is de basislijn van de cellen in 2,5 mM glucose. Een 2 minuten buffer aan beide uiteinden van elke behandeling gebruikt om ruis te minimaliseren.
  5. Voor elke cel, het berekenen van de procentuele verandering ten opzichte van baseline: (Intensity-Baseline) / Baseline
  6. Maak een lijngrafiek met de procentuele verandering ten opzichte van baseline vs tijd.
  7. Bereken de gemiddelde procentuele verandering ten opzichte van baseline gedurende 18-23 minuten. Bereken de gemiddelde procentuele verandering ten opzichte van baseline gedurende 35-40 minuten. Terwijl beeldverwerking niet wordt gebruikt, wordt de ruis verminderd door de middeling van intensiteit binnen elke cel regio, achtergrond aftrek, en de middeling van regio intensiteit over 5 min or langer.
  8. Controle experimenten waarbij 2,5 mM glucose opname oplossing wordt uitgewisseld met 2,5 mM glucose opname oplossing worden uitgevoerd om de ruisdrempel bepalen. Bereken de gemiddelde procentuele verandering ten opzichte van baseline gedurende 18-23 minuten voor ten minste 6 gerechten en 3 muizen. Bepaal het gemiddelde en de standaardafwijking van die waarden.
  9. Stel de drempel voor een positieve depolarisatie reactie op het gemiddelde plus 2 standaarddeviaties. De gemiddelde plus 2 standaarddeviaties overeenkomt met een met p <0,05. Onze controle-experimenten bleek een verandering van 10% ten opzichte van baseline als een passende drempel waarde.
  10. Voor elke cel, beoordeelt de omkeerbare depolarisatie respons op basis van 2 criteria. Ten eerste moet de gemiddelde procentuele verandering van basislijn gedurende 18-23 minuten meer dan 10%, de drempel in het voorgaande stap. Ten tweede moet de gemiddelde procentuele verandering ten opzichte van baseline gedurende 35-40 minuten minder dan de helft van de gemiddelde procentuele veranderingbasislijn tijdens minuten 18-23. Het tweede criterium is gekozen omdat bleek strenger dan stimulatie met glutamaat of KCl te zijn. Ongezonde neuronen vaak reageren op stimulatie met glutamaat of KCl hoewel hun reacties op verminderde glucose zijn niet omkeerbaar.
  11. Voor elk gerecht Bereken het% gedepolariseerd neuronen. Deze waarde wordt gebruikt om het% GI neuronen kwantificeren tussen de verschillende behandelingsgroepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De precieze dissectie van de VMH buurt van andere hypothalamus gebieden belangrijk om consistente resultaten te verkrijgen. De opname van andere gebieden zou de VMH neuronale bevolking te verwateren, het veranderen van de% van gedepolariseerd neuronen berekend. Bovendien hebben glucose sensing neuronen geïdentificeerd in andere gebieden hypothalamus, zoals de laterale hypothalamus, die functioneel en mechanistisch kunnen van VMH glucose sensing neuronen. Figuur 1 illustreert de correcte anatomische locaties voor goede dissectie. Volgens het protocol bovenstaande kan hersenweefsel met de correcte VMH regio worden gezien. Verdere dissectie nauwkeurig scheiden VMN en ARC, terwijl de totaliteit van elke subpopulatie, niet mogelijk. Figuur 2 toont een voorbeeld van gezonde gedissocieerd VMH neuronen. Met immunocytochemie bevestigden we dat onze voorbereiding is> 90% neuronen. Alleen gezonde neuronen worden gebruikt voor data-analysessis en gerechten met te veel ongezonde neuronen moet worden weggegooid. Neuronen die ongezond zijn vaak zeer donkere randen, het nemen van de MPD in grotere mate, en hebben onregelmatige vormen. Bovendien moet neuronen worden uitgeplaat bij een dichtheid zodanig dat de meeste neuronen tijdens opname elkaar niet raken. Neuronen gekozen voor de analyse mag niet raken andere cellen of puin.

Gegevens verkregen uit opnames van een GI neuron en een nonGI neuron zijn weergegeven in figuur 3. Na het verkrijgen van een basislijn voor 10 min, werd de extracellulaire glucose daalde 2,5-0,1 mM. De GI neuron geeft een robuuste omkeerbare respons groter is dan de vooraf bepaalde drempel van 10% verandering ten opzichte van baseline. De toename in fluorescentie weerspiegelt depolarisatie. Terwijl GE neuron hyperpolarisatie responsen worden gedetecteerd, de frequentie te laag is (<1% neuronen) voor succesvol gebruik van deze techniek voor dit subtype van glucose sensing neuron. Een reeks van fysiologische glucose dalingen werden getest en het percentage VMH neuronen die reversibel gedepolariseerd werd berekend voor elke schaal. Figuur 4 toont dat een positief verband bestaat tussen de grootte van de glucose daling en het percentage depolariserende neuronen. Dit toont aan dat succesvolle primaire kweek van volwassen muizen neuronen kunnen worden gebruikt in combinatie met fluorescentie beeldvorming om voor de studie van volwassen VMH GI neuronen.

Figuur 1
Figuur 1. Frontale doorsnede met markers voor de juiste VMH dissectie. De ontleed weefsel bevat de VMN en ARC met minimale besmetting van andere hypothalamus gebieden. Diagonale deelstukken van ~ 25-30% onder de bovenkant van het derde ventrikel worden aangebracht ~ 25-30% tussen het punt waar de cortex aan de hypothalamus gebied (blauw *) en de derde ventrikel(3V). Aangepast van bregma -2,8 mm Paxinos en Watson 1998 9, overeenkomend met Mouse Brain bregma-1.7mm. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Brightfield beeld van gezonde VMH neuronen van een volwassen muis. Dit beeld werd genomen 24 uur na dissociatie en is gebruikt voor MPD beeldvorming. Een paar voorbeelden van neuronen die zou (blauw *) of niet (rood x) worden gebruikt voor de analyse zijn gemarkeerd. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figure 3. Vertegenwoordiger MPD fluorescentie sporen van een GI neuron (groene lijn) en een nonGI neuron (oranje lijn). Cellen werden geperfuseerd met 2,5 mM glucose (G) opname oplossing gedurende 10 minuten, gevolgd door een daling tot 0,1 mm G gedurende 15 min en een terug tot 2,5 mM G gedurende 15 minuten. In de GI neuron, de procentuele verandering ten opzichte van baseline toegenomen tot meer dan 10% gedurende de 0,1 mm G perfusie periode (40% gemiddeld 20-25 min) en daalde tot minder dan de helft van deze toename in de 2,5 mm G omkering periode (15 % gemiddeld 35-40 min). Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 4
Figuur 4. Het percentage volwassen VMH neuronen die reversibel depolariseren reactie verminderde glucose gedetecteerd met fluorescent MPD beeldvorming. Apositieve relatie bestaat tussen de omvang van de afname van de glucosespiegel en het percentage van depolariserende neuronen. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De sleutel tot de mogelijkheid om de activiteit van neuronen bestuderen van volwassen muizen is de mogelijkheid om gezonde neuronen dissociëren. Dissociatie van de hypothalamus neuronen van volwassen muizen is moeilijker bij een aantal belangrijke stappen in het protocol vergeleken met neuronen van juveniele muizen. We hebben dit probleem op een aantal manieren. Maken dikke 500 urn hersenenplakken minimaliseert mechanische beschadiging van neuronen ten opzichte van de gebruikelijke 250-350 urn plakjes voor hersenweefsel jongere muizen. Echter, dikkere plakken vereisen meer aandacht voor cardiale perfusie en papaïnedigestie van hersenweefsel. Als er bloed wordt gezien op hersenweefsel, evalueren de precisie en de plaatsing van de snede in de rechterboezem en de naald geplaatst in de linker hartkamer. Het debiet en de hoeveelheid van de perfusie-oplossing kan worden aangepast. Een grondige perfusie is noodzakelijk omdat bloed is giftig voor de neuronen en resulteert in een lagere opbrengst van gezonde neuronen. Papaïne digestie moeten efficiënt genoeg om tevoor een zachte wrijven en gemakkelijk los van enkele cellen van hersenweefsel. Een inefficiënte papaïne digestie wordt vermoed wanneer de VMH weefsel zakt snel eind digestie wanneer grote stukken weefsel aanwezig zijn in de tweede trituratie. Met goede vertering worden weefselstukken nauwelijks waargenomen door het blote oog tijdens de derde trituratie. Als de aanwrijving is niet zacht, zal neuronale gezondheid lijden. Indien een inefficiënte papaïne digestie wordt vermoed, kan de concentratie van papaïne verhoogd met 5 U / ml of een nieuw buisje papaïne worden gebruikt. De papaïne concentratie dient niet boven 30 U / ml toegenomen sinds deze neuronale gezondheid kan schaden.

De blootstelling aan BSA is een cruciale stap in het protocol. Na getritureerd cellen zijn de BSA gradiënt gecentrifugeerd zowel de tijd neuronen worden blootgesteld aan BSA en de hoeveelheid BSA toegestaan ​​de pellet te blijven worden geminimaliseerd. De bovenstaande vloeistof en de BSA gradiëntmoet onmiddellijk worden opgezogen na het centrifugeren periode. Afzuiging kan worden gebruikt om de meerderheid van de supernatant te verwijderen, maar de laatste ~ 100 ul moeten handmatig worden verwijderd met een pipet waardoor de celpellet niet wordt verstoord. Een ander belangrijk aspect van het verkrijgen van gezonde neuronen is celdichtheid optimaliseren. Neuronen plated te dun zijn niet zo gezond. Omdat er zo weinig neuronen worden verkregen van elke muis hersenen, is het niet praktisch om cellen te tellen voordat plating. Gedurende de tijd die besteed zou worden tellen dat een aanzienlijk aantal cellen hechten aan de kunststof en verloren gaan. Met behulp van 4 gerechten per muis (~ 1 x 10 4 cellen / ml) als uitgangspunt, empirische bepaling van het aantal gerechten is de meest praktische aanpak voor het bereiken van optimale neuron dichtheid. De opbrengst van VMH neuronen van oudere muizen kunnen worden verwacht dat ongeveer de helft van de opbrengst van jonge muizen zijn. Verdere problemen tot neuron opbrengst te verbeteren omvat de kwantificering van neuronen resterendebij elke stap van de dissociatie protocol te stappen van zware neuronale uitputtingsslag lokaliseren.

Met behulp van onze protocol, kan gezonde gedissocieerd neuronen overleven in cultuur tot 2-3 dagen. Het gebruik van gefilterde astrocyt geconditioneerd kweekmedium laat neuronen overleven tot 2 weken in kweek. Groeimedia kan worden geconditioneerd door het incuberen op samenvloeiing primaire astrocyten overnachten. Astrocyten uit dezelfde knaagdier stam, hetzelfde geslacht en de hersenen regio moeten worden benut. Terwijl het gebruik van astrocyt geconditioneerd medium voert andere variabele, kan deze wijziging noodzakelijk dat alternatieve experimenten meer tijd in kweek vereist. Bovendien, om redenen die niet duidelijk zijn, hebben wij gevonden dat de mogelijkheid om glucose zin gemakkelijk verloren suboptimale neuronale gezondheid, ondanks het behoud van reacties op andere stimuli, zoals glutamaat. Zo moet extra zorg worden genomen. Neuronale reacties op verminderde glucose te observeren, is het noodzakelijk om contaminati voorkomendoor bacteriën, schimmels, zouten, zepen, en glucose. Al het glaswerk en steriele kunststoffen moeten grondig worden gewassen met dH 2 O. Naast levende verontreinigingen, zou detergenten en zouten neuronale integriteit en activiteit beïnvloeden. Kleine hoeveelheden glucose kan aanzienlijk veranderen glucose concentraties. Deze resultaten zouden verstoren omdat glucose sensing neuronen zijn zeer gevoelig voor kleine veranderingen in extracellulaire glucose in het nonhyperglycemic fysiologische bereik van 0,1-2,5 mM 10,11.

Bij het gebruik MPD beeldvorming, consistentie en side-by-side experimenten tussen behandelingsgroepen zijn essentieel voor zinvolle resultaten. Verschillende behandelingsgroepen moeten worden getest op dezelfde dag als mogelijk of ten minste om de andere dag. Dit minimaliseert mogelijke variaties in cultuur preparaten of MPD porties. Daarnaast vonden we de minste variatie optreedt wanneer beeldvorming wordt uitgevoerd binnen 24 uur van neuron dissociatie om bovengenoemde redenen. Aangezien de resultatenworden geanalyseerd als een% van de depolariserende neuronen, nauwkeurigheid en consistentie in VMH dissectie en neuronale voorbereiding is ook essentieel. De totale VMH neuronale populatie geoogst moet constant zijn en mag niet neuronen uit andere regio's bevatten. Daarom moet het protocol boven op de voet en precies gevolgd worden. Indien alternatieve experimenten worden uitgevoerd en onderhoud bevolking geen probleem, weefsel stempels kan worden gemaakt VMN of ARC neuronen isoleren.

De hier beschreven methoden vaststellen hoe je gezond VMH neuronen oogsten uit een volwassen muis en hoe MPD beeldvorming gebruiken om glucose-sensing neuronen te bestuderen. In plaats daarvan zou experimenten ontworpen VMH neuronale reacties onderzoeken andere dan glucose veranderingen stimuli. Als alternatief kan de dissociatie protocol worden geëxtrapoleerd oogst neuronen uit andere hersengebieden. Met behulp van neuronen van volwassen muizen, kunnen studies nu worden uitgevoerd met muizen ziekte modellen die of de voortgang met de leeftijd te ontwikkelen. Moreover, kan gezonde volwassen neuronen verder bestudeerd door naast MPD beeldvormingstechnieken zoals calcium beeldvorming, elektrofysiologie, eencellige PCR, immunocytochemie of een combinatie van deze technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
  2. Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
  3. Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
  4. Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
  5. Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
  6. Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
  7. Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
  8. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (2004).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th edn, Academic Press. (1998).
  10. Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
  11. Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics