Análise sistemática de
1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 6, 1,2,3,4,5

Bioengineering

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Summary

Este estudo utilizou um sistema de microfluídica multi-bem placa, aumentando significativamente o rendimento dos estudos rolantes célula sob fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante. Dada a importância da laminagem celular na célula de multi-passo homing cascata e a importância de homing celular após entrega sistémica de populações exógenas de células em pacientes, este sistema oferece a possibilidade de uma plataforma de pesquisa para melhorar a terapia de base celular.

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Levy, O., Anandakumaran, P., Ngai, J., Karnik, R., Karp, J. M. Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System. J. Vis. Exp. (80), e50866, doi:10.3791/50866 (2013).

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Abstract

Um grande desafio para a terapia de base celular é a incapacidade para atingir sistemicamente uma grande quantidade de células viáveis ​​com eficiência elevada para os tecidos de interesse após a infusão intravenosa ou intra-arterial. Consequentemente, o aumento homing celular é atualmente estudada como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Célula de rolamento sobre o endotélio vascular é um passo importante no processo de homing célula e podem ser sondados in vitro utilizando uma câmara de fluxo de placas paralelas (PPFC). No entanto, este é um ensaio de transferência extremamente fastidioso, de baixo, com as condições de fluxo mal controlada. Em vez disso, foi utilizado um sistema de microfluídica multi-bem placa que permite estudo das propriedades de rolamento celular em um maior rendimento sob precisamente controlado, fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante 1,2. Neste artigo, vamos mostrar como as propriedades de rolamento do HL-60 (leucemia promielocítica humana) células em superfícies E-revestido-selectina P-e, assim como em superfícies revestidas de monocamada de células pode ser readily examinada. Para melhor simular as condições inflamatórias, a superfície do canal microfluídico foi revestida com células endoteliais (ECs), que foram, em seguida, activados com fator de necrose tumoral-α (TNF-α), aumentando significativamente as interacções com células HL-60 em condições dinâmicas. A taxa de transferência melhorada e multi-parâmetro plataforma de análise de software integrado, que permite a rápida análise de parâmetros como rolando velocidades e caminho de rolamento, são vantagens importantes para avaliar as propriedades da célula rolando in-vitro. Permitindo a análise rápida e precisa de abordagens de engenharia destinados a impactar rolamento celular e homing, esta plataforma pode ajudar a terapia baseada em células exógena antecedência.

Introduction

Um dos principais desafios na tradução clínica de sucesso da terapia baseada em células é a entrega ineficiente ou direcionamento de células sistemicamente infundidos aos locais desejados 3,4. Consequentemente, há uma busca constante de abordagens para melhorar homing celular e, especificamente, celular rolando, como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Celular rolando sobre os vasos sanguíneos é um passo fundamental na cascata homing célula, classicamente definidos para leucócitos que são recrutados para sítios da doença 5. Este passo é governado por interacções específicas entre selectinas endoteliais, isto é, P-e E-selectina seus ligantes de contador na superfície de leucócitos 5,6 (P-e E-sel), e. Para uma melhor compreensão e melhoria da eficiência de homing celular e, especificamente, a etapa de rolamento, são de grande importância na busca de novas plataformas para melhorar a terapia baseada em células. Até agora isso tem sido conseguido através de câmaras de fluxo de placas paralelas (PPFCs), compreendendo dois plataforma planaes com uma junta entre eles, com uma porta de entrada e saída localizada sobre a placa superior, através da qual uma suspensão de células é perfundido através da utilização de uma bomba de seringa, 7,8, 9. A superfície da placa de fundo pode ser revestida com uma monocamada de células / substratos relevantes e a interacção entre as células e a superfície perfundidos sob fluxo de cisalhamento é então explorado 7. No entanto, PPFC é uma baixa, reagente-consuming, e método bastante tedioso, com formação de bolhas, vazamento e refluxo mal controlada apresentando grandes inconvenientes.

Uma técnica alternativa para o PPFC tradicional é um sistema de microfluídica placa multi-bem, o que permite maior desempenho de transferência de ensaios celulares (até 10 vezes maior do que PPFCs) sob, o fluxo de cisalhamento controlado por computador precisa, com baixo consumo de reagente 1,10. Experiências de rolamento celular são realizados no interior dos canais de microfluidos, que pode ser revestido com as monocamadas de células ou substratos modificados e usi fotografadang de um microscópio, com propriedades de rolamento facilmente analisados ​​utilizando um software adequado. Neste estudo, demonstramos a capacidade deste sistema de microfluídica placa multi-bem, estudando as propriedades de rolamento de leucemia promielocítica humana (HL-60) células em diferentes superfícies. HL-60 de rolamento em substratos como a P-e E-sel, bem como sobre monocamadas de células que expressam diferentes receptores de rolamento, foi analisado. Além disso, o anticorpo (Ab) bloqueio foi usado para demonstrar o envolvimento directo de selectinas específicas na mediação do movimento de rolamento de células HL-60 sobre essas superfícies. Experimentos rolamento foram realizados com maior produção, sob fluxo de cisalhamento estável, com o mínimo consumo de reagente / celular, permitindo a análise eficiente dos parâmetros-chave do rolamento tais como a velocidade de rolamento, o número de células de rolamento, e rolando propriedades do caminho.

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Protocol

1. Cultura de Células

  1. Leucemia promielocítica humana (células HL-60)
    1. Culturas células HL-60 em 75 centímetros 2 frascos com 15 ml de Iscove Modified Médio (IMDM) de Dulbecco, suplementado com 20% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v / v), L-glutamina e 1 % (v / v) de Penicilina-Estreptomicina.
    2. Mudança de mídia a cada 3 dias por aspiração metade do volume de suspensão celular e substituindo-o por meios IMDM completa.
    3. Para diacetato de carboxifluoresceína, coloração de éster de succinimidilo (CFSE), centrífuga de HL-60 de suspensão de células (400 x g, 5 min), ressuspender em uma solução de 1 ^ M de CFSE (preparado em PBS pré-aquecido) e incubar durante 15 min a 37 ° C. Em seguida, as células de centrífuga, sobrenadante aspirado e as células ressuspender em meio pré-aquecido fresco por 30 min. Lave as células em PBS e depois usar para experimentos de rolamento (ver Figura 1B imagem representativa de CFSE corados células HL-60 em P-revestido de superfície para sel).

  1. Células endoteliais microvasculares Pulmonares (LMVECs)
    1. O revestimento 100 milímetros pratos de Petri com solução de gelatina a 0,1% (v / v em PBS) e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
    2. LMVECs cultura em placas de Petri de 100 milímetros revestido com gelatina em meio completo de crescimento endotelial (endotelial basal médio 2 (EBM-2)), suplementado com um kit de suplemento de crescimento específico, ver REAGENTES). Mudança de mídia a cada dois dias e as células sub-cultura ao atingir 80-90% de confluência.
    3. Para a sub-cultura, lavar as células com PBS e, em seguida, separar as células com 4 mL de 1x tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C e neutraliza em um volume igual de completos EBM-2 media. Transferência da suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifuge (400 xg, 5 min). Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio completo endoteliais e contagem de células com um hemocitómetro. Não excesso de passagem das células, como isso afeta sua morfologia e função de usar apenas as células com menos de 7 passagem para todos os experimentos.
  1. Ovário de hamster chinês-P-selectina (CHO-P) Células
    1. Células CHO-P, que são células CHO transfectadas estavelmente para expressar humano P-sel, foram fornecidos por colaboradores (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
    2. Células Cultura CHO-P no T175 cm 2 frascos de 25 ml de F-12 mídia.
    3. Para passaging, lavar as células com 10 ml de PBS durante 4-5 segundos e depois trypsinize em 10 ml de 1x tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C, seguido de neutralização em meios completos.
    4. Centrifugar a suspensão de células (400 x g, 5 min), aspirar o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio cheios e contagem das células comum hemocitômetro.

2. Operação do Sistema Integrado Microfluidic Multi-bem placa

  1. Certifique-se que todo o equipamento está conectado corretamente e ligar os diferentes módulos: computador, controlador, microscópio invertido, e câmera CCD.
  2. Abra o software de imagem, certifique-se o módulo de placa multi-bem eo módulo de imagem são devidamente apresentados na tela.
  3. Conecte os tubos para a armadilha de vapor (ligado ao controlador) e também conectá-los para a interface de pressão.
  4. Colocar a placa de multi-poços na placa de aquecimento / adaptador. Adicionar reagentes aos poços (a seguir descritos) e interface de prender em cima da placa. Coloque a placa para a imagem latente no palco automatizado.
  5. A interface anexa à parte superior da placa e se aplica uma pressão pneumática a partir do controlador para o topo dos poços, a condução do fluido através dos canais de microfluidos para o caudal definido, facilmente controlados utilizando a placa de multi-poçostela do módulo no modo Manual.
  6. Reagentes do canal de fluxo através de uma área de observação, localizado entre os poços. Dimensões do canal microfluídicos são 350 m de largura x 70 mM de altura. O comprimento do canal linear é de 1 mm e na parte inferior dos canais compreende uma lamela de vidro de 180 um, o que é compatível com o campo claro, de fase, de fluorescência e microscopia confocal.
  7. Adquirir vídeos usando uma câmera CCD (aquisição de fluxo, 11 frames / seg) e analisar através de software compatível.

3. Revestimento de Canais Microfluidic com um substrato proteico ou uma monocamada de células

  1. Revestimento de canais microfluídicos com fibronectina ou P-/E-selectin
    1. Preparar 1 mL de 20 ug / ml de solução de fibronectina em PBS. Alterar o volume com base no número de canais a serem revestidas (usar 25-50 ul de fibronectina por canal).
    2. Adicionar 25-50 mL de solução de fibronectina para cada entrada bem. Aplicar a força de cisalhamento de 2 dyn / cm 2durante 5 minutos para perfundir o canal. Por favor, note que a gota de líquido que aparece na saída do bem. Incubar durante 30-45 minutos à TA
    3. Aspirar a solução de poços (não aspirar diretamente do círculo do meio que alimenta o canal) 1,13. Adicionar 200-500 ul de PBS a uma tomada bem e lavar com PBS canal por aplicação de fluxo de cisalhamento de 2 dines / cm 2 durante 5 min. O canal é agora devidamente revestidos com fibronectina e pronto para ser utilizado.
    4. Para revestir com P-ou E-sel, preparar uma solução a 5 mg / ml de proteína recombinante humana desejada em PBS, e os canais de revestimento tal como descrito acima, com 1 h de incubação a 37 ° C para permitir que o revestimento de superfície.
  2. Criação de CHO-P ou LMVEC monocamada dentro do canal microfluídicos
    1. Suavemente trypsinize células de placas de cultura durante 3 min, têmpera usando um volume de 2 vezes de meios completos e centrifugação (5 min a 400 x g). Suspenda as células com 10 ml de meio completo e centrifugar (5 min a 400 xg) again.
    2. Contar as células para determinar a concentração de células na suspensão. Para assegurar a formação de uma monocamada confluente LMVEC no interior do canal, trazer a concentração de células de 15-20 milhões de células / ml. Para confluente CHO-P monocamada de células, usar 50-60000000 células / ml. Número inicial de células utilizado para determinar a experiência em conformidade - Use 25-50 mL de suspensão de células para cada canal.
    3. Adicionar 25-50 mL de suspensão de células na concentração apropriada para a entrada do poço. Coloque a placa no palco microscópio e introduzir células no canal (2 dyn / cm 2) até que as células são observadas na tela preenchendo os canais inteiros, e depois parar o fluxo.
    4. Preencha tanto saída e de entrada com 200 mL de tanto LMVEC cheio ou meio CHO. Deixe as células assentar e aderir durante 3 horas na incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
    5. Após a incubação de 3 horas, lave o canal com total media (2 dyn / cm 2, 10-15 min) para remover desapegadocélulas. As células devem agora aparecer completamente confluentes eo canal já está pronto para uso. Dependendo da densidade de sementeira inicial de células, 2-3 hr adicional de tempo de estabilização pode ser necessário para assegurar a cobertura completa da superfície com as células.

4. LMVEC Activation Pro-inflamatório e anticorpo bloqueador de P-/E-selectin

  1. Prepara-se uma solução de TNF-α (10 ng / ml) em meio basal LMVEC.
  2. Para induzir a activação inflamatória do LMVEC nos canais, adicionar 100 ul da solução de TNF-α para a entrada e assim introduzir a solução para dentro do canal por aplicação de fluxo de cisalhamento de 2 dines / cm 2 durante 5 min. Para canais de controlo (células endoteliais não activado), adicionar 100 ul de LMVEC meio basal para a entrada e assim introduzir no interior do canal (2 dines / cm 2 a 5 min). Canal está pronto para um ensaio de rolamento.
  3. Para bloquear P-sel e E-sel em LMVECs e células CHO-P, introduzir neutralizar P-sel (clone AK4, 5 mg / ml em bameios de sal) ou E-sel (P2H3 clone, 5 ug / ml em meio basal) anticorpos para o canal e incubar durante 1 hora a 37 ° C. Em seguida, lava-canais com meio basal (2 dines / cm 2 a 5 min). Canais estão prontos para um ensaio de rolamento.

5. HL-60 Rolando Ensaio sobre Substrato / Telemóveis Revestido-monocamada canais microfluídicos

  1. Examinar cuidadosamente os canais ao microscópio para confirmar que os canais são adequadamente revestidas (no caso do revestimento com células, uma monocamada confluente de células plenamente devem ser observados).
  2. Para preparar a HL-60 de suspensão de células para as experiências de rolamento, centrífuga HL-60 de suspensão de células (5 min a 400 xg) e lavar uma vez com meio basal. Contar as células e ressuspender em IMDM (meios basais, contendo Ca 2 + e Mg 2 +) para criar uma suspensão de células HL-60 com 5 milhões de células / ml. Use 25-50 ul de suspensão celular para cada canal para realizar o ensaio de rolamento.
  3. Adicionar 25-50 mL da suspe celularnsion para a saída bem, colocar a placa dentro placa titular o controlo de temperatura (37 ° C) e no palco microscópio. Em seguida, introduzir células no canal através da aplicação de força de cisalhamento de 2 dyn / cm 2 (células devem ser observados dentro de 10-15 seg fluindo da tomada de entrada).
  4. Para examinar a resposta de rolamento como uma função da tensão de cisalhamento, para reduzir o cisalhamento 0,25 dines / cm 2 e 20-30 adquirem vídeos sec (utilizando a função "aquisição de fluxo") em cada corte desejado (cisalhamento aumentam gradualmente a partir de 0,25 até 5 dines / cm 2. Também é possível a utilização de tesouras mais elevados).
  5. Adquirir vídeos usando uma câmera CCD (aquisição de fluxo, 11 frames / seg) e analisar os caminhos de rolamento e rolamento velocidades através de um software compatível.

6. Citometria de fluxo para detectar a expressão de moléculas de superfície

  1. Após tripsinização, preparar uma suspensão de células (com 1-2 x 10 5 células / amostra) de tipo de célula desejada (HL-60, CHO-P ou LMVECs) em PBS (- / -), suplementado com 2% de FBS. Lave as células duas vezes e trazer o volume da amostra de 50 ul (utilizando o mesmo tampão).
  2. Incubar cada amostra com o fluoróforo conjugado desejado Ab (ver tabela em anexo para obter informações detalhadas) a 4 ° C por 20 min (cubra com papel alumínio).
  3. Lave as células duas vezes (mesmo tampão) e trazer o volume final da suspensão de células coradas com 200 ul. Analisar amostras usando um citómetro de fluxo para detectar a expressão de moléculas de superfície.

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Representative Results

Células HL-60 rolam em superfícies P-e E-selectin, mas não sobre f ibronectina

Células HL-60 são considerados "rolos" padrão de ouro em que expressam uma variedade de ligandos homing, incluindo os ligantes de rolamento P-glicoproteína ligando sel-1 (PSGL-1) e sialil-Lewis X (sLex) 5,14 (Figura 1A ). A proteína de superfície PSGL-1 age como um andaime para o tetra-sacarídeos Slex, mediando a interação específica com P-e E-sel, que são sobre-regulada no endotélio durante a inflamação 5,6,15. Para testar as capacidades do sistema de microfluídica placa multi-bem, numerosos canais microfluídicos foram revestidas em simultâneo com diferentes substratos e interações contínuas das células HL-60 com essas superfícies foram analisadas. Células HL-60 exibiram um comportamento de rolamento robusta em P-revestidos por sel superfície, com células primeiro capturados de fluxo, seguido de um movimento de rolamento distinto. Como mostrado na Figura 1C, e consistement com a literatura, as células HL-60 exibem um comportamento semelhante nas superfícies de rolamento e-sel, mas não em substratos revestidos com fibronectina 14,16-19. Velocidade celular, analisados ​​através de um software compatível, foi plotada contra a tensão de cisalhamento, mostrando uma resposta de rolamento robusta de células em P-e E-sel com uma velocidade média entre 1-12 mM / seg.

Células HL-60 em rolo CHO-P monocamada revestindo o canal microfluídico

Em seguida, buscou-se avaliar a viabilidade da utilização deste sistema de microfluídica para testar de forma eficiente as interações entre células de interesse e uma monocamada de células de revestimento da superfície. Para explorar a interacção de células HL-60 com uma monocamada de células que expressa os marcadores de rolamento, que utilizou células CHO-P, que são transfectadas de forma estável para expressar P-, mas não a L-, sel (Figura 2A. Ver também Figura 2B para representante imagem de células HL-60 sobre a monocamada de células CHO-P revestem o canal microfluídico) 11,12. HL-60 de células exibido uma resposta forte de rolamento sobre as células CHO-P (Figura 2C). Para testar se este movimento de rolamento é de facto mediada por P-sel, a monocamada CHO-P foi pré-incubada com anticorpos de bloqueio para ambos P-ou E-sel, antes da perfusão de células HL-60 para o canal. Conforme mostrado na Figura 2C, o bloqueio da monocamada de CHO-P, com um P-sel Ab resultou numa redução significativa no número de rolamento células HL-60 na superfície, demonstrando que a P-sel fato medeia HL-60 de rolamento, como descrito anteriormente 14,18. Realizar o ensaio em um canal microfluídicos permite a triagem rápida de diferentes condições e bloqueio eficiente dos receptores usando apenas pequenos volumes, em torno de 25 mL. Controle Isotype ou Ab bloqueando E-sel (o que não é expresso em células CHO-P) não afetou o número de células em células CHO rolando-P, demonstrando a força desse ensaio em precisão pin-apontando o envolvimento direto de surfac específicoe marcadores em interações rolantes celulares.

Laminação de células HL-60 em uma LMVECs-activadas por TNF é mediada por E-selectina

As células endoteliais são conhecidos por regulada pelos marcadores da superfície de adesão, tais como a P-e E-sel, durante a inflamação, auxiliando no recrutamento de leucócitos para locais de inflamação 5,6. No entanto, enquanto que os CEs murino expressam tanto P-e E-sel em resposta a estímulos inflamatórios, como a interleucina-1 (IL-1) e factor de necrose tumoral-α (TNF-α), ECs humano apenas expressam E-sel em resposta a estes citocinas 20,21. Isto foi validado no nosso ensaio de citometria de fluxo, que mostra a expressão de E-sel, mas não P-sel, em células endoteliais microvasculares de pulmão (LMVEC) em resposta a estimulação de TNF-α (Figura 3A). A placa de multi-poços de microfluidos consiste de vários canais de microfluidos separados, permitindo o teste de transferência mais elevada de várias condições diferentes. Usamos este projeto vantajosoao prato LMVECs dentro dos canais microfluídicos (Figura 3B) para analisar rapidamente as interações de células HL-60 com ECs sob várias condições. Para simular configurações inflamatórias, LMVECs foram pré-tratadas com a citocina pró-inflamatória, o TNF-α. Curiosamente, células HL-60 não interagir com LMVECs activado-un, e as células não foram observadas para rolar sobre esta superfície. Pelo contrário, as células HL-60 exibiu uma forte comportamento evolutivo no TNF-α LMVECs activado, com uma velocidade média de 5-15 mM / seg (Figura 3C).

Em seguida, teve como objetivo explorar o envolvimento de P-sel ou E-sel na interação de rolamento entre as células HL-60 e os LMVECs ativados. Para isto, o TNF-activado-α ECs foram pré-incubados com o P-sel ou anticorpos bloqueadores de E-sel, e o rolamento de células HL-60 foi analisada. Como mostrado na Figura 4A, o bloqueio de E-sel, que foi regulado para cima em TNF-α LMVECs activada resultou em uma significdeclínio formiga do número de células de rolamento sobre a monocamada endotelial activado. Em contraste, utilizando um isotipo de controlo ou um Ab contra a P-sel, o que não era expresso em células endoteliais do activado, não tiveram um efeito significativo sobre a HL-60 de rolamento sobre a camada endotelial activado. Esses dados demonstram o envolvimento direto dos E-sel em HL-60 rolando no TNF-α-ativada ECs, de acordo com relatórios anteriores 20,21. A partir dos vídeos adquiridos, o software de análise permite que se rastrear os caminhos de células individuais que interagem com o substrato. Usamos esse recurso para controlar especificamente o caminho de células individuais que interagiram com TNF-α-ativada ECs w / wo bloqueio E-sel. Como mostrado na Figura 4B, o número de células de rolamento em LMVECs activados desbloqueados foi significativamente maior do que em E-sel-bloqueados CEs activado. Além disso, verificou-se que o movimento de rolamento de HL-60 em LMVECs desbloqueados é contínuo e robusto, enquanto que os caminhos de rolamento de célulasem E-bloqueado-sel ECs foi fragmentada (cada cor representa uma célula diferente, ver, por exemplo células af vs gl na Figura 4B). Em consistência com esta descoberta, a velocidade de rolamento de células HL-60 na desbloqueado TNF-α-ativada ECs foi significativamente menor do que a sua velocidade de rolamento em E-bloqueado-sel ECs (Figura 4C).

Figura 1
Figura 1. Células HL-60 rolam em superfícies de E-selectina-revestidos P-e. (A) células HL-60 expressar os ligantes rolando PSGL-1 e Slex (Iso CTR - Controle de isotipo, não Ab - sem anticorpo). Imagem snap shot Representante do CFSE corados células HL-60 em P-sel (B) superfície revestida sob fluxo. (C) células HL-60 rola robustamente em superfícies de E-revestimento-sel P-e, mas não sobre a superfície revestida de fibronectina. Velocidade de rolamento é plotado contra o estresse de cisalhamento (n = 10-15 células por ponto de dados, as velocidades foram analisados ​​pelo software compatível). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. HL-60 de rolamento em CHO-P monocamada de células é directamente mediada por P-sel. (D) As células CHO-P expressam P-sel, mas não a L-sel. (B) Imagem representativa de células HL-60 sobre a monocamada de células CHO-P revestindo a superfície do canal microfluídico (ampliação de 10X). (C) HL -60 célula rolando CHO-P monocamada é directamente mediada por P-sel, como demonstrado pelo ensaio de bloqueamento Ab (desbloqueado - CHO-P monocamada não foi incubada com um anticorpo, monocamada isotipo ctr-CHO-P incubada com um controlo do isotipo; * p <0,05, ANOVA one-way foi utilizada com o teste post-hoc HSD de Tukey, barras de erro representamSEM, n = 3.

Figura 3
Figura 3. Células HL-60 rolar no TNF-α-ativada LMVECs. (A) a activação de TNF-α LMVECs de induzir a expressão de superfície de E-sel, mas não P-sel. (B) Imagem representativa do confluente LMVEC monocamada em dois canais de microfluidos (ampliação 4X). (C) células HL-60 exibem um resposta de rolamento robusta em TNF-α-ativada LMVECs, mas não em LMVECs ativado-un. Iso CTR - Controle de isotipo, unact ECs - células endoteliais inativos, TNF-α ECs-ACT - células endoteliais. TNF-α-ativada Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4 < Br /> Figura 4. HL-60 de rolamento em TNF-activado-α LMVECs é mediada pela E-selectina. (A) HL-60 de rolamento em TNF-activado-α LMVECs é mediada por E-sel, em vez de P-sel, como demonstrado por Ab bloqueador ensaio (monocamada isotipo ctr-CE incubadas com um controle isotipo; * p <0,05, ANOVA one-way foi utilizada com o teste post-hoc HSD de Tukey, barras de erro representam SEM, n = 3) (B) análise do caminho celular revela contínua. e laminagem robusta de células HL-60 em células endoteliais activadas bloqueadas em relação ao rolamento fragmentado, fracos observados no E-sel-bloqueados CEs activados (cada cor representa uma célula diferente. análise foi realizada por meio de um software adequado). (C) HL-60 de rolamento velocidade em TNF-α ECs-ativado é mais lento em ECs ativados desbloqueados em relação a E-sel-bloqueado ECs ativado (tensão de cisalhamento utilizados:. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, teste t, barras de erro de dois cauda desemparelhados representam SEM, n = 17-36 por grupo de células)."target =" _blank www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "> Clique aqui para ver maior figura.

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Discussion

Um dos grandes desafios na tradução bem sucedida de terapia baseada em células exógena é a incapacidade de produzir com eficiência células para locais de lesão e inflamação com alta eficiência de enxerto 3. Laminagem celular representa um passo crítico no processo de homing célula, facilitando a desaceleração de células nas paredes de vasos sanguíneos, o que levou à sua adesão firme e transmigração através do endotélio para os tecidos 5. Para uma melhor compreensão do processo de laminação de tipos de células candidato pode levar ao desenvolvimento de técnicas para melhorar o homing das células e contribuir significativamente para a melhoria da terapia baseada em células.

PPFC é uma ferramenta amplamente utilizada para explorar rolagem celular, bem como outros comportamentos celulares sob um fluxo de cisalhamento. A aplicação de PPFC pela análise de adesão dos neutrófilos no endotélio foi estudada pela primeira vez por Lawrence et al. Em 1987, e desde então disponíveis comercialmente produçãots foram desenvolvidos 8,9. PPFCs consistem de duas placas planas separadas por uma junta de vedação que controla as dimensões da câmara 7. A placa superior contém uma entrada e porta de saída, o qual, através da utilização de uma bomba de seringa permite que a perfusão da suspensão de células através da câmara 7,8. Há também uma porta adicional de que se aplica uma pressão negativa (vácuo) para manter as placas pressionadas juntas 7. Embora as câmaras de fluxo de placa paralelas têm sido eficazmente utilizados para investigar as respostas celulares, incluindo o rolamento de células, sob condições de fluxo de cisalhamento, existem numerosas limitações que reduzem a sua eficácia. Uma das principais limitações das câmaras de escoamento é o elevado número de células e os grandes volumes de reagentes que são necessários devido ao grande volume morto dentro do sistema de fluxo de 7. Um outro ponto crítico é a presença de bolhas de ar, que pode surgir com facilidade, durante a montagem da câmara de fluxo, potencialmente prejudicando a monocamada de células e substratorevestimento sobre a placa de fundo 22. No entanto, outras modificações têm sido feitas a PPCFs tradicionais para incorporar uma porta adicional sobre a placa superior para funcionar como uma armadilha de bolhas para facilitar a remoção de bolhas de ar 23. Configuração do experimento PPFC também é tedioso, e da célula de fluxo é suscetível ao vazamento se a junta estiver danificada ou não montados com cuidado. Finalmente, existe uma diferença entre as taxas de cisalhamento desejadas e experimentalmente aplicadas, o que resulta em um intervalo estreito de taxas de fluxo uniformes. Por teoricamente comparando quatro PPFCs com diferentes posições de entrada e saída, verificou-se que duas das configurações modelado taxas de cisalhamento que desviaram as taxas de cisalhamento calculadas em até 75% 24. Para reutilizar a mesma câmara requer etapas de lavagem demoradas, e combinado com os desafios acima descritos, o que torna os PPFCs bastante tedioso e baixo rendimento.

Em nosso estudo, foi utilizado um totalmente integrado multi-bem psistema de microfluídica tarde, contando com a controlada com precisão 1,2,13 fluxo de cisalhamento. Este 48 placa bem microfluídicos inclui 24 canais microfluídicos, com cada par de poços adjacentes conectados com um 1,25 canal microfluídicos. 10-12 ensaios de rolamento pode ser realizada em uma hora, permitindo a triagem rápida de várias dezenas de condições em apenas um dia. Os canais de microfluidos pode ser facilmente revestida com um substrato proteico ou monocamadas de células, e a interacção entre as células de interesse e a superfície pode ser visualizada usando um microscópio, adquirida por uma câmara CCD e analisadas por software compatível. Parâmetros-chave, tais como a quantificação de células, o cálculo da velocidade de rolamento e análise do caminho faixa específica podem ser facilmente obtidos para analisar de forma eficiente o comportamento de rolamento em vários substratos 13. Neste estudo, avaliou-se a eficiência deste sistema em estudar rolamento célula usando HL-60 linha de células de leucemia promielocítica, bem estabelecidas "rolos" que expressam chaveligandos de rolamento, tal como a PSGL-1 e de sLex, o que em conjunto actuam como ligandos de contrapartida para P-e E-sel 15,26. Em correlação com os relatórios anteriores, as células HL60 realmente exibiu um comportamento de rolamento robusta em E-revestido de sel canais microfluídicos P-e, com velocidades lentas de rolamento 1-12 mM / seg 14,17-19. Células HL-60 não role na superfície de fibronectina, consistente com relatos prévios que demonstram que indiferenciadas células HL-60 não apresentam interacções adesivas com fibronectina 16. O design do sistema de microfluidos placa multi-poços, permitindo-se a ensaios de 10-12 / h em comparação com apenas 1-2 ensaios / h que podem ser testados usando PPFCs, aumenta significativamente a taxa de transferência de, pelo menos, 5 vezes. Além disso, PPFCs precisa ser remontado e lavado antes de cada reuso, ainda abrandar taxa de performance. Além disso, o fluxo facilmente controlada permite o rápido desempenho das experiências dependentes de cisalhamento, que pode então ser facilmente analisadas através de software adequado.

(Figura 2A) 11,12. Células HL-60 exibiram uma resposta de rolamento significativa sobre as células CHO-P, demonstrando a capacidade de usar este sistema para explorar eficazmente as interacções célula-célula sob fluxo de cisalhamento dado um desenho que evita a formação de bolhas que podem comprometer a integridade da monocamada de células , que muitas vezes ocorre quando se usa PPFCs 22,23. Em seguida, bloqueou as células CHO-P com anticorpos P-ou E-sel para explorar seu potencial envolvimento no processo de laminação. P-sel bloqueio reduziu significativamente o número de células de rolamento sobre a monocamada de células CHO-P, indicando o envolvimento directo de P-sel na mediação da HL-60 de rolamento, de acordo com relatórios anteriores 14,18,20.O controlo de E-sel Ab e isotipo não teve nenhum efeito sobre o rolamento em HL-60 em células CHO-P, demonstrando que Ab bloqueador pode ser utilizado neste sistema de microfluidos para detectar de forma eficiente marcadores específicos que medeiam as interacções célula-célula. Importante, cada canal requer apenas o volume mínimo de Abs dispendioso ou de suspensão de células para este ensaio, tão pouco como 25-50 ul, ao contrário do PPFC consome reagente e as suas típicas grandes volumes mortos 7.

Nós próxima testou este sistema placa multi-bem, analisando as interações entre células HL-60 e ECs revestimento do canal microfluídicos. CEs são conhecidos por expressar P-e E-sel durante o processo inflamatório 5. Para proporcionar CEs com um estímulo inflamatório, que pré-tratadas com TNF-los α. Enquanto E-sel foi regulada, P-sel não era, de acordo com a literatura, mostrando que ECs humano expressar E-sel, mas não P-sel, em resposta a ativação do TNF-α, desde o primata promotor P-sel carece de TNF -α elementos de resposta, resulting na indução de transcrição de apenas E-sel 20,21. Condições inflamatórias, em seguida, foram simuladas no interior do canal através da incubação a monocamada de EC com o TNF-α, seguido por perfusão de células HL-60 para explorar as suas interacções com a superfície CE. Enquanto HL-60 não interage com os CEs sem activação, fizeram exibir uma resposta robusta de laminagem na produção de TNF-activado-α ECs (Figura 3C), correlacionada com a sua resposta descrita na literatura 22. Ab experiências (Figura 4A) de bloqueio, em seguida, mostrou que a E-sel, mas não P-sel, bloqueio resultou numa redução significativa da HL-60 de rolamento em ECs activado. Estes dados demonstram o envolvimento direto dos E-sel, e não P-sel, na mediação do rolamento de HL-60 em TNF-α-ativada humana ECs 20,21. O Ab bloqueando experimentos, inversamente mostrando rolamento E-sel-mediada em ECs ativado vs P-sel-mediada rolando no CHO-P, valida ainda mais a viabilidade ea pertinência de Ab blockiexperimentos ng rapidamente realizada neste sistema de microfluídica. Curiosamente, esta inibição da laminagem não estava completa (redução de cerca de 70%), sugerindo que outros receptores de superfície, como por exemplo a VCAM-1, também participam em HL-60 de rolamento em activado ECs 27. Análise do caminho trilha revelou ainda outro fenômeno interessante - enquanto a laminação de HL-60 na desbloqueado ECs ativado foi contínuo e robusto, o baixo número de células que ainda rolou no E-sel bloqueado ativado ECs exibido um caminho de rolamento fragmentado no ECs bloqueado ( Figura 4B). Este fenómeno não foi observado nas células endoteliais incubadas com o bloqueio de P-sel ou controlo de isotipo (dados não mostrados). Isto sugere fortemente que, embora uma resposta de rolamento é possível através de outros marcadores quando CE E-sel é bloqueado, este rolamento depende de interacções fracas, parciais HL-60-CE, apoiar apenas um, a resposta de rolamento parcial solta com a ECs activada 5,22 ,27-29. Isto é apoiado pelos dados mostrados na Figura 4C 30-33, e melhorar o rendimento da microfluídica através do sistema de multi-prato bem apresentado, evidencia ainda mais o potencial desta tecnologia para análise eficiente e preciso de propriedades rolamento chave para a melhoria aplicações terapêuticas .

Este estudo centrou-se no exame de HL-60 célula rolando em substratos de proteína e monocamadas de células sob fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante e controlada com precisão usandoum sistema de microfluidos de multi-poços da placa. Da mesma forma, outros tipos de células e outros substratos monocamadas / células pode ser prontamente utilizado para estudar as suas propriedades de rolamento. A facilidade de utilização e análise simples que permite uma análise precisa de importantes propriedades de rolamento e Ab bloqueio ou activação com diferentes factores de crescimento ou os inibidores podem ser utilizados para explorar o envolvimento potencial de marcadores moleculares em resposta ao rolamento. Isto pode ser especialmente útil para o estudo de rolamento de células estaminais e direcção, o qual pode ser modificado para melhorar a terapia baseada em células estaminais 34-36. É importante ressaltar que várias condições podem ser testadas com maior rendimento (5-10 vezes superior vs PPFCs), permitindo estudo rápido e eficiente de propriedades de rolamento devido ao design da placa. Outros ensaios relevantes para homing de células, tais como a adesão celular, a quimiotaxia e a transmigração também pode ser estudada utilizando este sistema 1,10,13. Em geral, este sistema de microfluidos surge como uma técnica poderosa para o estudo de células e de rolamento should servir como uma ferramenta útil para ajudar na tradução clínica da terapia baseada em células exógena.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgments

Células CHO-P foram um presente amável do Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde HL095722 concessão para JMK Este trabalho também foi apoiado em parte por um Movember-Prostate Cancer Foundation Prêmio Desafio para JMK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells ATCC CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156
EBM-2 Media Lonza CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements Lonza CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots Lonza CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x Gibco 12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) Gibco 11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S) Gibco 15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM Gibco 25030
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals Sa550
Petri Dishes BD Falcon BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) MedSupply Partners TC1500
T75 Flasks BD Falcon 353136
Gelatin Solution (2%) Sigma G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E R&D Systems BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA21
Anti-hP-Selectin R&D Systems BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control BD Bioscience 555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 Santa Cruz SC70545
FITC Conjugated Santa Cruz SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control Santa Cruz SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 BD Pharmingen 556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control BD Pharmingen 550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4) Santa Cruz SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 Millipore MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control Santa Cruz SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha PeproTech 300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry Invitrogen C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma Invitrogen 33016-015
Equipment
Bioflux 1000 Fluxion Biosciences Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Bioscience CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera Photometrics

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