Induksjon av Invasive Transitional Cell blære carcinoma in Immune Intakt Menneskelige MUC1 transgene mus: En modell for Immunterapi Development

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Et N-butyl-N-(4-hydroksybutyl) nitrosamin-indusert blærekreft modell ble utviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene mus for å teste MUC1-rettet immunterapi. Etter administrering av en MUC1-målrettet peptid vaksine, ble en cytotoksisk T-lymfocytt respons på MUC1 bekreftet ved å måle serum cytokin nivåer og T-celle spesifikke aktivitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vang, D. P., Wurz, G. T., Griffey, S. M., Kao, C. J., Gutierrez, A. M., Hanson, G. K., Wolf, M., DeGregorio, M. W. Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice: A Model for Immunotherapy Development. J. Vis. Exp. (80), e50868, doi:10.3791/50868 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En preklinisk modell av blærekreft ble utviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) mus for det formål å evaluere immunterapi og / eller cytotoksisk kjemoterapi. Ved induksjon av blærekreft, C57BL / 6 mus (MUC1.Tg og villtype) ble behandlet oralt med carcinogen N-butyl-N-(4-hydroksybutyl) nitrosamin (OH-BBN) ved 3,0 mg / dag, 5 dager / uke i 12 uker. For å vurdere effekten av OH-BBN på serum cytokin profil under tumor utvikling, ble fullblod samlet inn via submandibular blør før behandlingen og hver fjerde uke. I tillegg ble en MUC1-målrettet peptid vaksine og placebo administrert til grupper av mus ukentlig i åtte uker. Multiplex fluorometriske microbead immunoanalyses av serumcytokinene under tumor utvikling og etter vaksinasjon ble utført. Ved opphør, interferon gamma (IFN-γ) / interleukin-4 (IL-4) elispot analyse for MUC1 spesifikke T-celle immunrespons og histopatologiske evalueringer av tumor typeog karakteren ble utført. Resultatene viste at: (1) forekomst av blærekreft i både MUC1.Tg og vill type mus var 67%, (2) overgangsreglene celle carcinoma (TCC) utviklet ved forholdet 2:1 i forhold til plateepitelkreft karsinom (SCC) , (3) inflammatoriske cytokiner økte med tiden i løpet av tumorutvikling, og (4) administrering av peptidet vaksine induserer en Th1-polariserte cytokin serum profil og en MUC1 spesifikk T-celle-respons. Alle svulster i MUC1.Tg mus var positive for MUC1 uttrykk, og halvparten av alle svulster i MUC1.Tg og vill type mus var invasiv. I konklusjonen, ved hjelp av et team tilnærming gjennom samordning av innsatsen til pharmacologists, immunologer, patologer og molekylærbiologer, har vi utviklet en immun intakt transgen musemodell av blærekreft som uttrykker hMUC1.

Introduction

Blærekreft er den fjerde vanligste formen for kreft og den åttende største årsaken til kreft dødsfall i amerikanske menn. I USA, er anslagsvis 72 500 nye tilfeller og 15 000 dødsfall av blærekreft forventet blant menn og kvinner samlet i 2013 en. Forekomsten av blærekreft er omtrent tre ganger så høy hos menn sammenlignet med kvinner. I USA, overgangsstønad karsinomer (TCC) står for over 90% av tilfellene, mens plateepitelkreft karsinom (SCC) har en insidens på mindre enn 2% 2. Den samlede relative 5-års overlevelse for papillær TCC er 91,5% sammenlignet med bare 30,9% for SCC to. Selv om ikke-invasiv papillær TCCs stå for ca 75% av tilfellene på tidspunktet for diagnosen, selv med behandling mer enn 50% av pasientene vil oppleve et tilbakefall innen fem år, med opp til 30% av disse pasientene utvikler seg til muskel invasiv sykdom 3,4 . Typiske behandlingsregimer for ikke-muskel invasive sykdom inkluderer transurethral reseksjon (TUR) etterfulgt av intravesikal kjemoterapi. Hos pasienter med høyverdig Ta eller T1 svulster, kan en gjenta TUR utføres før kjemoterapi 3,4. For pasienter med lavgradige Ta tilbakefall eller høyverdig Ta eller T1 lesjoner, etterfulgt TUR etter adjuvant kjemoterapi eller immunterapi i form av Bacillus Calmette-Guerin (BCG) kan brukes 3,4. Intravesikal BCG har vist seg å være overlegen i forhold til intravesikal mitomycin C med hensyn til tiden for tilbakefall 5.. For T2 muskel invasiv sykdom, er radikal cystektomi med eller uten neoadjuvant kjemoterapi den anbefalte behandlingen tre. Hos pasienter med SCC, synes radikal cystektomi å være den mest effektive behandlingen seks. Gitt de svært høy forekomst av tilbakefall til tross for de beste behandlinger tilgjengelig, er det et klart behov for nye og mer effektive behandlingsformer for blærekreft.

Utvide nye immunotherapies for bladdeh kreft er en mulig tilnærming som kan holde løftet for å forlenge sykdomsfri overlevelse. Historisk har BCG vært den eneste effektive immunterapi for blærekreft. Virkningsmekanismen er antatt å involvere den ikke spesifikke induksjon av en T-hjelper 1 (Th1) type immunrespons via økende nivåer av interleukin-2 (IL-2) og interferon gamma (IFN-γ) 4.. Cellular eller Th1 immunitet, er kritisk i cancer immunoterapi som humoral eller Th2 har immunitet aldri vist seg å være effektiv mot faste tumorer, med unntak av antistoffer rettet mot vekstfaktorreseptorer 7. I et forsøk på å forbedre fordelene med BCG monoterapi, ble IFN-α 2B/BCG kombinasjon immunterapi evaluert i en fase II klinisk studie med noe svar åtte. En alternativ tilnærming til immunterapi for blærekreft kan være å målrette tumor-assosierte antigener (TAA), identifisering av noe som har gjort cancer immunoterapi mer spesifikk 7

En slik TAA er mucin 1 (MUC1), som er et celleoverflate-glykoprotein overuttrykt i mange epitelcelle kreftformer slik som blære-, bryst-, lunge-og bukspyttkjertelkreft 9,10. Uttrykket og modifikasjon av MUC1 er også vesentlig endret i løpet av karsinogenese, eksponerer slik at underglycosylation antigene sekvenser av aminosyrer er kjent som variabelt antall tandem gjentar (VNTR) på peptid kjerne. Mens MUC1 er en selv-molekyl, er disse immunodominante VNTR regionene normalt ikke utsatt på grunn av omfattende glykosylering, og dermed de blir sett av immunsystemet som utenlandske 11,12. Cytotoksiske T-lymfocytter (CTLs) som spesifikt gjenkjenner MUC1 epitoper har blitt isolert fra de tumor-drenerende lymfeknutene brystkreftpasienter 13, så vel som blod og benmarg av myelom 14,15, slik MUC1 et potensielt mål for en cellulær immunrespons. De immunodominante VNTRs av underglycosylated form av MUC1 er anerkjent av CTLs, noe som resulterer i ødeleggelse av kreftceller 16-19. Native cellulære og / eller humorale immunresponser mot cancerøse MUC1 er imidlertid ikke sterk nok til å eliminere svulster. Å forsterke den allerede eksisterende svake immunforsvar mot MUC1, kan syntetiske immunodominante peptider bli introdusert gjennom vaksinering for å generere en CTL respons sterk nok til å være av klinisk nytte 18,20. En MUC1 liposomale vaksine har allerede vist seg å øke overlevelse i lungekreftpasienter 21,22, generere CTLs stand til å drepe MUC1-positive kreftceller, og produsere en Th1-polarisert cytokin respons 23,24. Med et høyt nivå av MUC1 uttrykk 9,11,25, er blærekreft en logisk kandidat for testing MUC1-rettet immunterapi 26,27. Videre har MUC1 potensial som en prognostisk faktor i blæren 28 kreft, MUC1 uttrykk i TCC er signifikant assosiert med scene og karakter, og metastatisk TCChar vist seg å fortsette å uttrykke MUC1 29..

For å evaluere den potensielle nytten av MUC1-rettet immunterapi i blærekreft, utviklet vi en immun intakt menneskelig MUC1 (hMUC1)-uttrykke transgen (MUC1.Tg) mus modell av blærekreft congenic på C57BL / 6 bakgrunnen 30. Humant MUC1 er uttrykt som en selv-protein under kontroll av sin egen promoter, noe som resulterer i en vev uttrykk mønster i overensstemmelse med det som for mennesker 30,31. Musene ble indusert med den kjente blære karsinogen N-butyl-N-(4-hydroksybutyl) nitrosamin (OH-BBN) 32, og deretter ble det resulterende tumorer ble vurdert med hensyn hMUC1 ekspresjon og tumor type, grad. For å vurdere effekten av kreftfremkallende på Th1/Th2 cytokin nivåer under tumor utvikling, ble serumprøver samlet periodisk for multiplex analyse. Mus ble deretter behandlet med en MUC1-rettet peptid vaksine og serum cytokin og immunresponser ble evaluted ved multiplex fluorometrisk microbead immunoassay og elispot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier og eksperimenter ble utført under en protokoll godkjent av University of California, Davis Institutional Animal Care og bruk Administrative Advisory Committee.

En. MUC1.Tg Mouse Avl og forplantning

  1. UC Davis Mouse Biology Program (MBP) raser villtype C57BL / 6 mannlige mus med heterozygot MUC1.Tg C57BL / 6 hunnmus å etablere vår kolonien. MUC1.Tg avkom blir levert for studier etter behov.
  2. MBP personell klippe tærne av avkommet i et definert mønster (0-99) for mus identifikasjon, og når dette er aktuelt klippet halen. Tå eller hale vev behandles for genotyping ved hjelp av standard DNA-ekstraksjon og Polymerase Chain Reaction (PCR) analyse.

2. Study Design

  1. Studer gruppeoppgaver
    1. Veie hver mus separat på en balanse og noter vekten i gram for hver mus.
    2. Denne delen av prosedyren involves metodikk og utformingen av studien. For den første delen av studien, tildele alder-matchet MUC1.Tg og vill type mus til å starte blærekreft induksjon med OH-BBN. Avlive mus åtte uker etter siste OH-BBN dose for å bekrefte tilstedeværelse av blæren svulster ved histologi.
    3. For den andre delen av studien, randomize mannlige MUC1.Tg mus inn riktig antall behandlings-og kontrollgrupper. Disse musene vil bli overvåket for serumcytokinene og T-celle immunrespons under induksjon og tumor utvikling, og deretter ved avslutning av studien åtte uker etter siste OH-BBN dose.
  2. Blærekreft Induksjon
    1. OH-BBN er kreftfremkallende og meget giftig. Vennligst les og følg retningslinjene fra sikkerhetsdatavbladet ved håndtering og lagring av dette kjemikaliet.
    2. Beregn dosering løsning konsentrasjonen som trengs for å levere den nødvendige dose (3 mg), i et volum på 100 ul til hver mus på grunnlag av gjennomsnittlige vekter og number av mus i hver studie og gruppe.
    3. Fortynn OH-BBN i 100% etanol. Bringe den endelige konsentrasjon til 30 mg / ml med sterilt vann. Den endelige etanol: vann-konsentrasjon bør være 20:80, v / v.
    4. Administrere OH-BBN muntlig ved hjelp av rustfritt stål, 20 G tilførsel med sonde nåler daglig, 5 dager / uke i 12 uker, basert på behandlingen gruppeoppgave starter i en alder av 8 uker.
  3. Vaksinering Behandlinger
    1. Rekonstitueres hver ampulle av lyofilisert vaksine peptid i 600 ul av 0,9% steril saltløsning og grundig resuspender ved å trekke oppløsningen gjennom en 0,5 tommers 27 G nål 6x. Ved hjelp av saltvann, juster konsentrasjon slik at den ønskede dose leveres i et volum på 100 ul.
    2. Fra og med uke 20, etter siste dose av OH-BBN, gi vaksinen på en ukentlig basis for en åtte-ukers syklus ved subkutan injeksjon av 100 ul hjelp av en 25 G kanyle (uke nummer tilsvarer en alder av musene).
  4. Overvåking og Prøvetaking
    1. Veie alle mus og palpate for tilstedeværelsen av nye svulster gang hver uke. Avlive noen mus som har mistet ≥ 20% av kroppsvekt eller om det er opplagte svulster, blod i urinen, og / eller urinretensjon.
    2. Før første OH-BBN dose og deretter ved 4 ukers mellomrom etterpå, samle fullblod via submandibular blør. Samle blod i serum levrer rør (BD Microtainer), og la 30 min for blodet å koagulere.
    3. Sentrifuger blodprøver i en mikrosentri-fuge ved 3500 x g i 10 min. Nøye overføre serum til skrukork kryorør ved hjelp av en pipette.
    4. Flash fryse i flytende nitrogen, og oppbevar ved -80 ° C inntil videre analyse av multiplex.
    5. Åtte uker etter siste dose av OH-BBN, avlive alle mus med CO 2 kvelning.
    6. Plasser hver mus på en disseksjon bord og peke ut av alle fire lemmer.
    7. Bruk pinsett og saks, maKe et horisontalt snitt i den øvre mageregionen. Sett saksen i snittet mellom epidermal lag og bukveggen og forsiktig skille huden fra underliggende vev ved hjelp av tang.
    8. Gjør en loddrett innsnitt fra den horisontale snitt etter midtaksen mot den fremre ende av mus. Skille huden fra brystkassen, og bruk en 1 ml sprøyte og en 22 G nål, punktere hjertet og samle blod med en glatt og jevn uavgjort.
    9. Se trinn 2.4.3 og 2.4.4 for serum isolasjon og lagring.
    10. Bruk pinsett og saks, klippe og skallet tilbake resten av epidermal lag. Skjær gjennom bukveggen og bukhinne og aseptisk fjerne blæren svulst for Immunohistokjemi (IHC) og Western blot.
    11. Samle milt for celleviabilitet analyse (Muse) og elispot. For IHC, sted blære tumor prøven i vev kassett og fikse i kjølt formalin over natten i romtemperatur. Dagen etter, erstatte formalin med 70% etanol.
    12. For Western blot analyse av tumor, homogenisere svulsten, legger protein utvinning buffer pluss Halt proteasehemmere og overføre til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    13. Vortex i 30-60 sek og hold på is i 5 min. Flash fryses i flytende nitrogen, og tining i det omliggende vann. Gjenta prosessen med vortexblanding, frysing og tining to ganger.
    14. Sentrifuger prøvene ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C og overføre de cellulære ekstrakter som nye merkede rør.
    15. Kvantifisere konsentrasjonen ved å utføre en Bicinchoninic Acid Protein Assay (BCA) for protein målinger. Oppbevar prøver ved -80 ° C til den er klar for Western blot analyse.

3. Molecular Biology / Western

Følgende prosedyrer ble utført for å verifisere uttrykk for MUC1 i mus blære tumor vev ved hjelp av standard Western Blot protokollen (data ikke visern).

  1. Separer proteinekstrakter ved SDS-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og deretter overføre til PVDF membran bruker semidry apparat.
  2. Blokker proteinet overført membranen med 5% fettfri melk i 0,1% Tween-20 i fosfatbufret saltvann (PBS-T) pH 7,4 i 1 time på en orbital rister ved romtemperatur.
  3. Inkuber membranen i 1 time ved romtemperatur på en rister med anti-MUC1 eller anti-β-aktin-antistoff i 0,1% PBS-T.
  4. Vask membranen ved dekantering av løsningen og tilsette 0,1% PBS-T. Virvle membran på ryster i 5 min og dekanter. Gjenta dette trinnet to ganger.
  5. Inkuber membranen i 1 time ved romtemperatur med et pepperrot peroksidase (HRP)-konjugert sekundært antistoff.
  6. Vask 3x (se trinn 3.4).
  7. Følg protokoll for Enhanced Chemiluminesence (ECL) kit for å aktivere og lese fluorography.

4. Multiplex Fluorometrisk microbead Immunoassay

<ol>
  • Oppsett og beregninger
    1. Ved hjelp av en 96-brønners plate kartet, tildele blanks, standarder, kontroller og ukjente til brønnene. Beregne antall og volum av analytter, fange antistoffer og streptavidin-fysoerytin (SA-PE) som trengs for analysen.
    2. Tillat alle buffere og fortynningsmidler til romtemperatur. Forbered standarder og prøvefortynninger ved hjelp av en blank 96-brønners plate.
    3. Rekonstituerer serum matrise og frysetørret standard i henhold til produsentens protokoll og gjøre 01:05 serielle fortynninger av standard med riktig væske i 96-brønners plate. For de tomme brønner, bruke riktig fortynning.
    4. Fortynn alle kontroller og ukjente prøver 1:02 i hensiktsmessig fortynningsmiddel i resten av 96-brønns plate.
    5. For vulsten blanding, pipetter det nødvendige volum av den passende fortynning til et 15 ml rør. Vortex hver perle ampulle i 20 sek og pipette det nødvendige volumet av hver analytt inn i 15 ml rør. Alltid beskytte vulstene mot lys for å unngå fotobleking. Ikke plasser 96-brønners plate på absorberende materiale for å unngå tap av prøven gjennom fukttransporterende.
  • Assay Protocol
    1. Prewet 96-brønns filter bunnplate med 200 pl analyse-buffer og tillate fullstendig bløtlegging av filteret. Forsiktig drenere ved hjelp av 96-brønns plate vakuum-apparat og Tørk bunnen av platen med et papirhåndkle.
    2. Ved hjelp av en flerkanals pipette, 25 pipette mL serum matrise til brønnene er tilordnet de blanks og standarder og pipette 25 mL av Assay Buffer til brønnene tildelt for kontrollene og ukjente.
    3. Pipetter 25 mL av blank, standarder, kontroller og ukjente til de respektive respektive brønnene. Vortex vulsten blanding i 20 sekunder og overføre perlene til et reservoar.
    4. Pipetter 25 pl av perlen blandingen i hver brønn. Dekk platen med aluminiumsfolie eller en ugjennomsiktig plate lokk for å beskytte mot lys.
    5. Klargjør fangst antistoff løsning. Pipetter den nødvendige mengde av 0,1% PBS-T og fange-antistoff til et 15 ml rør og virvle i 10 sek. Overfør den-fangst-antistoff blandingen til et reservoar og pipette 25 ul i hver brønn.
    6. Rist platen ved 500 rpm i en time ved romtemperatur på en plateryster. Tapp-og vaske platene med 200 ul 0,1% PBS-T to ganger. Hell av vannet og tørk tørt.
    7. Klargjør SA-PE-løsning. Pipetter det nødvendige volum av 0,1% PBS-T og SA-PE inn i et 15 ml rør og virvle i 10 sek. Overfør løsningen til et reservoar og pipette 25 ul i hver brønn.
    8. Rist platen ved 500 rpm i 30 minutter ved romtemperatur på en plateryster. Tapp-og vaske platene med 200 ul 0,1% PBS-T to ganger. Drain og bMange tørr.
    9. Pipetter 100 mL av 0,1% PBS-T og riste på en plate rister ved 500 rpm i minst to minutter for å resuspendere kulene. Lese og analysere platen på Luminex LX200 maskinen.
  • 5. IFN-γ/IL-4 elispot Forberedelse og analyse

    1. I et biologisk miljø kabinett, behandle miltene gjennom 100 pm sikter nylon vevet inn i 5 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) i sterile Petri-skåler. Layer splenocyttene på 3 ml lymfocytt separasjon medium i sterile 15 ml rør.
    2. Sentrifuger rørene ved 600 xg i 15 minutter for å skille lymfocyttene fra de røde blodlegemer. Overfør de lagdelte lymfocytter over gradient til nye sterile 15-ml rør.
    3. Juster volumet til 10 ml med steril PBS. Sentrifuger suspensjonen ved 600 xg i 10 minutter for å pelletere cellene.
    4. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PBS for cellenes levedyktighet og telle med Museanalysator. Følg Muse Count & Livskraftig Kit protokollen.
    5. Gjør serielle fortynninger av lymfocytter i 1,5 ml skrulokk sentrifugerør på fortynningsfaktorer av 1:10, 1:20 og 1:40 (eller ved behov) i Count & Livskraftig Reagens (minimum totalt volum 300 mL). Pipetter hver fortynning opp og ned flere ganger for å mikse og analysere på Muse.
    6. Forbered en plate kart av prøvene og vilkår for ELISPOT plate. Klargjør ELISPOT plate i henhold til produsentens protokoll og pipetten 100 mL av mediet, peptid (10 pg / ml), eller krafse peptid (10 pg / ml) til hver brønn.
    7. Pipetter 100 ul celle-suspensjon, 1,0 x 10 leverer seks celler til hver brønn og inkuber platen ved 37 ° C over natten.
    8. Følg produsentens protokoll for ELISPOT analysen. Analyser utviklet elispot plate ved hjelp av en disseksjon mikroskop.
    9. Kvantifisere resultatene ved å telle antallet fargede flekker tilsvarende krng til hvert analytt i hver brønn. Flekkene tilsvarer antallet av flekk-dannende celler (SFC) i hver brønn.

    6. Immunhistokjemi (IHC) og Hematoxylin & eosin (H & E) Farging

    1. Ta blære svulstvev bevart som beskrevet ovenfor (avsnitt 2.4.11), bygge inn i parafin og trinn-delen på fire mikrometer for immunhistokjemisk analyse.
    2. Utfør IHC ved hjelp av en MUC1 antistoff som gjenkjenner tandem gjenta regionen MUC1. Bruk Forsøksdyrutvalgets Kit peroksidase for å redusere reaktiviteten av det sekundære museantistoff med endogent immunglobulin til stede i vevet.
    3. Utfør H & E flekker ved hjelp av standard protokoller.

    7. Statistiske metoder

    For Multiplex Fluorometrisk microbead Immunoassay, bruker en tosidig Student t-test for å sammenligne gjennomsnittlig observert serum cytokin konsentrasjoner mellom behandling og kontroll grupper. For elispot, bruk en one-way ANOVA å sammenligne stedet danner kolonier mellom media kontroll, eggerøre peptid og peptid grupper. Bruk Dunnetts multiple sammenligningstest for å minske sannsynligheten for et falskt positivt resultat. En p-verdi på ≤ 0,05 regnes som signifikant forskjellig for alle analyser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De prekliniske vurdering av virkningene av nye immunterapi og kombinasjoner i blærekreft krever utvikling av en egnet dyremodell. I vår transgen musemodell, resulterte induksjon med kjemisk karsinogen OH-BBN i en høy rate av blærekreft forekomsten av overveiende TCC med noen SCC, som er lik blæren kreft hos mennesker. Å bestemme tumorhistologi, MUC1 uttrykk status og immunrespons til peptid vaksine behandling, ble 21 MUC1.Tg og 18 villtype mus avlives for innsamling av blod, blærer, og milt (figur 1) åtte uker etter OH-BBN induksjon (uke 28). Blæren kreftforekomst sats for både MUC1.Tg (14/21) og vill type (12/18) mus var 67%. Hematoxylin og eosin (H & E) farging bekreftet tilstedeværelsen av både TCC og SCC, med TCCs overveiende på forholdet 2:1. Blant disse, observerte vi et utvalg av lav og høy grad av ikke-invasiv til høyverdig invasive svulster.Alle MUC1.Tg blærekreft prøver var positive for MUC1 uttrykk ved IHC (figur 2). Det bør bemerkes at antistoffet som brukes for MUC1 IHC gjenkjenner både normale og kreftceller humant MUC1.

    Under modellutvikling, ble serumnivåene av inflammatoriske cytokiner overvåkes serielt mellom uke 8-28. Vi observerte at inflammatoriske cytokin-nivåer økte med tiden fra induksjon ved slutten av studien (Fig. 3). Denne cytokin mønsteret er svært likt det vi har observert tidligere i vår lungekreft modell 33, som sterkt antyder at økt inflammatorisk cytokin nivåer kan korrelere med tumor utvikling.

    For å vurdere Th1 serum cytokin respons på peptid-vaksine, 15 vaksinert og 14 placebo-behandlede mus var MUC1.Tg avlivet og blodet ble oppsamlet ved slutten av studien i uke 28, 24 timer etter den siste behandling vaksine. Multiplex analyse (Figure 4) viser økt Th1 serum cytokin nivåer av TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70) og IL-17 i vaksinen gruppen sammenlignet med placebogruppen. Nivåene av TNF-α, ble IFN-γ, og IL-17 signifikant høyere (p <0,05) i vaksinen-behandlede mus. Disse resultatene tyder på en Th1 polariserte cytokin respons på peptid vaksine.

    For å evaluere Th1/Th2 immunrespons på peptid vaksine, ble splenocytes vurdert av IFN-γ/IL-4 elispot. Tjuefire timer etter siste behandling, ble milt samlet inn og behandlet for å isolere lymfocytter for ELISPOT analyse. Lymfocytter ble talt opp og vurderes for levedyktighet av Muse Analyzer (figur 5). Elispot platene ble sådd med 1 x 10 6 levedyktige celler per brønn og utviklet 48 hr senere. Representative resultater (figur 6) viser en klar og bestemt IFN-γ respons på peptidet, som bekrefter en Th1 immunrespons mot peptidetvaksine.

    Figur 1
    Figur 1. Mus obduksjon. Obduksjon ble utført ved 28 uker, 8 uker etter utløpet av OH-BBN induksjon. Lever, blære svulst, og milt er indikert. Asterisk (*) markerer punktering punkt for blodprøvetaking. I dette eksempelet var et høyverdig, invasiv SCC observert. Klikk her for å se større bilde .

    Figur 2
    Figur 2. Representative blære vevsdelene farget med H & E (til venstre) og menneskelig MUC1 IHC (til høyre) av norma l blære, invasiv plateepitelkarsinom, og invasiv overgangsordning celle carcinoma. (A) Normal urinblæren med slimhinner foret med overgangsordning epitel, som viser diffuse MUC1 reaktivitet. (B) Reir av invasiv SCC (pil) i submucosa. Organisert keratin lag (asterisk) linje blæren slimhinner. Diffuse MUC1 reaktivitet er sett i reir av SCC. (C) Mucosa inneholder TCC projisere inn i lumen (til venstre, til høyre). Overgangsordning celle carcinoma er anaplastic med invasjonen i submucosa og muskel (pil og innfelt). Slimhinner og TCC projisere inn i lumen viser diffuse MUC1 reaktivitet (høyre, til høyre), mens invasiv TCC har mindre fremtredende reaktivitet (til høyre, til venstre). Bar = 200 mikrometer (viktigste panel) og 50 mikrometer (innfelt). Klikk her for å se større bilde .

    3 "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "width =" 600px "/>
    Figur 3. Inflammatoriske serumcytokinene på ulike stadier av svulst utvikling. Serial serum prøver ble samlet av submandibular blør ved baseline (8 uker), deretter hver 4. uke deretter til studiet avslutning. Blod ble samlet (N = 4), og serum ble isolert og analysert for tilstedeværelse av 20 cytokiner. Konsentrasjoner representerer representerer gjennomsnittet av samleprøver og barer området. Pilene viser punktet hvor OH-BBN dosering avsluttet. Klikk her for å se større bilde .

    Figur 4
    Figur 4.Th1 serumcytokinene følgende peptid vaksine behandling. Serumprøver ble samlet ved studium avslutning, 24 timer etter den endelige dose av vaksinen (n = 15) eller placebo (n = 14) og analysert for tilstedeværelse av 20 cytokiner. Data er vist som middelverdier Cytokinkonsentrasjoner og barer representerer positive standardavvik. * P <0,05 Klikk her for å se større bilde .

    Figur 5
    Figur 5. Representative mus splenocyte histogram. Mouse splenocytes ble isolert ved studiestart oppsigelse og vurderes for telling og levedyktighet ved hjelp av en Muse Analyzer. Venstre panel, celle viablility basert på celle størrelse. Høyre panel, celle levedyktighet basert på kjerneholdige celler (levende celler i grønn sone, døde celler i hvit sone). Klikk her for å se større bilde .

    Figur 6
    Figur 6. Splenocyte LISpot analyse ved studiestart avslutning. (A) Representant brønnene viser IFN-γ (røde prikker) og IL-4 (blå prikker) produksjon i respons til media, eggerøre peptid og peptid. En klar IFN-γ, antigen-spesifikk respons ble observert med peptid eksponering. (B) Grafisk fremstilling av typiske IFN-γ ELISPOT data som viser den gjennomsnittlige (± standardavvik) flekk danner kolonier i respons til media, eggerøre peptid og peptid._blank "> Klikk her for å se større bilde.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den vellykkede induksjon av invasiv overgangsordning og plateepitelkreft blære carcinoma in human MUC1.Tg mus tilbyr en preklinisk modell for Immunterapi utvikling. Immunoterapeutiske studier krever bruk av en spontan, intakt immun-modell for å evaluere den inflammatoriske responsen til tumorprogresjon over tid, så vel som av immunresponsen mot immunterapi. I en spontan svulst utvikling modell, forblir svulst microenvironment intakt og svulster utvikle seg på et mer representativt vekstrate som gjør det mulig for vurderingen av antitumor effekten av behandlingen. Videre kan immunsystemet skal måles og overvåkes gjennom biomarkører, slik at for evaluering av behandling effekt.

    Andre tumor bærende mus modeller som er beskrevet i litteraturen for testing immunterapi inkludere både xenograft modeller og transplantasjon modeller. Selv om disse modellene er praktisk og har blitt omfattende brukt i kreftforskning,det er en rekke viktige begrensninger for å vurdere når gjennomføre immunotherapeutic studier. Hverken xenografter eller transplanterte tumorer utvikler spontant, og spre de i et mikromiljø som ikke er representativt for den vev hvorfra tumorer opprinnelig ble utledet. Videre xenografts og transplanterte svulster vokse raskere enn spontane svulster, slik at mindre tid til å studere immun effekten av terapien. Viktigst, disse modellene krever vertene med nedsatt immunforsvar.

    I tillegg til vår modell, er det en rekke andre kjemisk indusert blærekreft modeller. For eksempel, N-[4 - (5-nitro-2-furyl)-2-tiazolyl] formamid (FANFT) og N-metyl-N-nitrosourea (MNU) har også blitt vist å indusere blærekreft i både rotter og mus . Men disse kjemikaliene er litt forskjellig med hensyn til histologisk av svulstene de induserer. FANFT induserer hovedsakelig uroteliale cell carcinoma (UCC) med noen SCC, mens MNU induserer papillær karsinom som til slutt resulterer i muskel-invasive svulster med en lav forekomst av metastaser 34. OH-BBN er ofte brukt for blærekreft induksjon i gnagermodeller fordi TCCs som utvikler likne høy klasse menneskelige TCCs 34. Kreft i urinblæren er også blitt indusert i hunder, kaniner og rotter, så vel som hos mus ved anvendelse OH-BBN. Selv hjørnetenner deler samme metabolske prosesser med mennesker i forhold til bioaktivering av kreftfremkallende stoffer 35, er latenstid for blærekreft utvikling i beagler 37 uker 36, og eksperimenter med hunder har både økonomiske og etiske hensyn. Kaniner har enda lengre ventetid perioder, og da lagt til dosering periode, er minimum 21 måneder for å TCC og SCC utvikling 37. I likhet med mus, rotte modeller utvikle svulster som er histopathologically lik mennesker, med korte dosering perioder på 8 uker og ventetid perioder med fem uker 38

    Tidligere har vi utviklet to immun intakt menneskelige MUC1-uttrykker spontane tumor modeller for både lunge 33 og brystkreft 39. For å kunne vurdere immunotherapies i blærekreft, har vi utviklet en OH-BBN-indusert, spontan mus modell av blære carcinoma. I likhet med de tidligere beskrevne modeller 33,39, svulster som utvikles i denne modellen uttrykker tumor-assosiert antigen MUC1 som en selv-molekyl, som er målet av peptidet vaksine. Denne modellen viste en 67% forekomsten av svulster i blæren, som alle var positive for uttrykk for menneskelig MUC1. Histologiske vurderinger viste at TCCs dominerte, som er konsistent med hva som er observert i human blærekreft. Denne modellen er ideell for å studere bilencinogenesis, forebyggende strategier og behandling av lokaliserte og avansert blærekreft hos mennesker. I fremtiden planlegger vi å forfølge flere studier av immunterapi i kombinasjon med kjemoterapeutika og stråleterapi i den beskrevne blærekreft modell.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, og GKH erklærer ingen konkurrerende interesser. MWD er Principal Investigator av et tilskudd mottatt fra Merck KGaA, og MW er ansatt i Merck KGaA.

    Acknowledgments

    Forfatterne ønsker å takke UC Davis Mouse Biology Program for avl musene. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent 
    N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) TCI America B0938
    20 G Gavage Needles Popper Sons, Inc. 7921 Stainless steel
    Peptide Vaccine N/A N/A investigational agent
    BD Microtainers BD 365957
    Tissue Cassettes Simport M490-12
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific SF100-4
    Lysis Buffer Pierce 87787
    Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Scientific 78444
    Pierce BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
    Mouse Cytokine 20plex Kit Invitrogen LMC006
    Magnetic Microsphere Beads Luminex MC100xx-01 xx is the bead region
    Anti-mouse TNF- Capture Antibody BD Pharmingen 551225
    Anti-mouse TNF- Detection Antibody BD Pharmingen 554415
    Anti-mouse IFN- Capture Antibody Abcam ab10742
    Anti-mouse IFN- Detection Antibody Abcam ab83136
    PBS, pH 7.4 Sigma P3813-10PAK
    Tween-20 Fisher BP337-500
    Assay Buffer Millipore L-MAB
    Cytokine Standard Millipore MXM8070
    Multi-screen HTS 96well filter plates Millipore MSBVN1210
    SA-PE Invitrogen SA10044
    100 m Nylon Tissue Sieves BD 352360
    Splenocyte Separation Media Lonza 17-829E
    TNF- /IL-4 ELISpot plates R&D Systems ELD5217
    Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody Epitomics 2900-1
    Goat Anti-actin monoclonal antibody Sigma A1978
    Anti-rabbit HRP antibody Promega W401B
    Goat anti-mouse HRP antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2005
    PVDF membrane BioRad 162-0174
    Mini Protean TGX Precast Gels BioRad 456-1083
    Muse Count & Viability Kit Millipore MCH100104
    MUC1 Antibody BD Pharmingen 550486 IHC antibody
    Animal Research Peroxidase Kit Dako K3954 IHC staining
    Equipment and Software
    Millipore plate vaccum apparatus Millipore MSVMHTS00
    Luminex Lx200 Millipore / Luminex 40-013 Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
    Luminex Xponent Software Millipore / Luminex N/A Version 3.1; included with Luminex Lx200
    Milliple Analyst Software Milliplex / VigeneTech 40-086 Version 5.1
    Muse Cell Analyzer Millipore 0500-3115
    Muse Software Millipore N/A Version 1.1.0.0; included with Analyzer
    Dissecting Microscope Unitron Z730
    Graphpad Prism Software Graphpad Software Inc. N/A Version 5.1
    Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus BioRad 165-8001
    Trans Blot SD Cell and PowerPac BioRad 170-3849

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
    2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215 (2007).
    3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60, (4), 244-272 (2010).
    4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17, (4), 256-268 (2010).
    5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169, (1), 90-95 (2003).
    6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93, (2), 216-220 (2004).
    7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411, (6835), 380-384 (2001).
    8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24, (4), 344-348 (2006).
    9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122, (1), 61-69 (2004).
    10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4, (1), 45-60 (2004).
    11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91, (6), 560-566 (2003).
    12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14, (9), 619-625 (1992).
    13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51, (11), 2908-2916 (1991).
    14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153, (5), 2102-2109 (1994).
    15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105, (5), 2132-2134 (2005).
    16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, (18), 7159-7163 (1989).
    17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151, (7), 3693-3703 (1993).
    18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7, (7), 963-975 (2008).
    19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
    20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4, (4), 493-502 (2005).
    21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23, (27), 6674-6681 (2005).
    22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137, (9), 1337-1342 (2011).
    23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10, (12), 1907-1916 (1998).
    24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3, (1), 49-57 (2001).
    25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73, (3), 256-262 (1994).
    26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42, (5), 726-732 (2001).
    27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18, (2), 363-370 (2000).
    28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41, (11), 1191-1195 (1988).
    29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
    30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58, (2), 315-321 (1998).
    31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26, (1), 47-62 (2003).
    32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2, (3), 251-254 (1981).
    33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
    34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87, (2), 139-160 (1976).
    35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, (3), 374-381 (2006).
    36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75, (5), 385-387 (1984).
    37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28, (6), 339-343 (1989).
    38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39, (8), 3040-3043 (1979).
    39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18, (10), 2861-2871 (2012).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics