चूहों में एक वीडियो विश्लेषण प्रणाली का प्रयोग प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग टेस्ट

1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences
Published 3/01/2014
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Behavior
 

Summary

यह लेख चूहों में सीखने भय और स्मृति का आकलन करने के लिए एक वीडियो विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर एक प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.

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Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. J. Vis. Exp. (85), e50871, doi:10.3791/50871 (2014).

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Abstract

प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग परीक्षण जानने के लिए और पर्यावरण cues और प्रतिकूल अनुभवों के बीच एक संघ को याद करने के लिए चूहों की क्षमता का आकलन है कि व्यवहार परीक्षण में से एक है. इस परीक्षण में, चूहों एक कंडीशनिंग कक्ष में रखा जाता है और एक वातानुकूलित उत्तेजना (एक श्रवण क्यू) के कर्कट और एक aversive असुविधाजनक उत्तेजना (एक बिजली footshock) दिया जाता है. एक देरी समय के बाद, चूहों ही कंडीशनिंग चैम्बर और श्रवण क्यू की प्रस्तुति के साथ एक अलग ढंग से आकार का कक्ष के संपर्क में हैं. परीक्षण के दौरान व्यवहार बर्फ़ीली डर स्मृति के एक सूचकांक के रूप में मापा जाता है. स्वचालित रूप से व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, हम http://www.mouse-phenotype.org/ पर एक मुफ्त डाउनलोड के रूप में उपलब्ध है जो ImageFZ अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करते हुए एक वीडियो विश्लेषण प्रणाली विकसित की है. इधर, हमारे प्रोटोकॉल का विवरण दिखाने के लिए, हम प्रासंगिक के लिए हमारी प्रक्रिया का प्रदर्शन और ImageFZ syst का उपयोग C57BL/6J चूहों में भय कंडीशनिंग परीक्षण cuedउन्हें. इसके अलावा, हम अपने प्रोटोकॉल और एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा बने उस के साथ ImageFZ प्रणाली या एक photobeam आधारित कंप्यूटर माप प्रणाली द्वारा मापा ठंड समय की तुलना करके वीडियो विश्लेषण प्रणाली के प्रदर्शन को मान्य किया. हमारे प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, ImageFZ से प्राप्त आंकड़ों ImageFZ प्रणाली का उपयोग कर व्यवहार विश्लेषण अत्यंत विश्वसनीय है यह दर्शाता है कि एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा विश्लेषण के समान ही थे. वर्तमान फिल्म लेख परीक्षण प्रक्रियाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है और प्रयोगात्मक स्थिति की समझ को बढ़ावा देंगे.

Introduction

प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग परीक्षण कृन्तकों 1-3 में साहचर्य सीखने भय और स्मृति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल व्यवहार प्रतिमान है. इस परीक्षा में व्यापक रूप से ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों 1,4-16 में डर सीखने और स्मृति के neurobiological तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सांस लेने के अपवाद के साथ पूरा गतिहीनता के रूप में परिभाषित किया गया है जो बर्फ़ीली व्यवहार, भयभीत स्थितियों के लिए एक सामान्य प्रतिक्रिया है. जानवरों के एक बिजली footshock साथ एक श्रवण क्यू की एक जोड़ी करने के लिए सामने आ रहे हैं के बाद इस व्यवहार प्रतिमान में, वे साहचर्य डर सीखने और स्मृति के एक सूचकांक के रूप में मापा जाता है, जो ठंड व्यवहार, प्रदर्शित करके डर उत्पादक उत्तेजना का जवाब. इस परीक्षण कम विस्तृत उपकरण, अन्वेषक द्वारा कम शारीरिक श्रम, और अन्य सीखने और स्मृति कार्यों से चूहों के लिए बहुत कम प्रशिक्षण समय की आवश्यकता है, यह आम तौर पर 2 दिनों के लिए लगभग 5-10 मिनट / दिन माउस प्रति की आवश्यकता है. परीक्षण प्रक्रिया सी हैmple और प्रदर्शन करने के लिए कम समय की आवश्यकता है, अन्वेषक ध्यान से निरीक्षण और माउस व्यवहार उपाय होना चाहिए, इसलिए कई स्वचालित माप सिस्टम व्यवहार विश्लेषण 17-20 संचालन करने के लिए विकसित किया गया है. हम ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ विकसित की है, जो हमारे वीडियो विश्लेषण प्रणाली, हमें आसानी से ठंड व्यवहार का विश्लेषण और अत्यंत विश्वसनीय परिणामों का निर्माण करने की अनुमति देता है. इस अनुच्छेद के हमारे परीक्षण प्रक्रिया के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है और ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कैसे करें.

Protocol

प्रयोगों के सभी स्थानीय पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा स्थापित मार्गदर्शन और प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाना चाहिए.

1. तंत्र की स्थापना

  1. कंडीशनिंग और संदर्भ परीक्षण के लिए तंत्र एक electrifiable ग्रिड फर्श के साथ एक वर्ग कक्ष, एक ध्वनि स्रोत, और एक calibrated सदमे जनरेटर है. विभिन्न चैम्बर आकार आयाम x 27 सेमी x 30 सेमी 21 से 25 सेमी x 35 सेमी x 30 सेमी 22 54 सेमी से बदलती के साथ किया जाता है. कवर धातु ग्रिड के साथ (0.2 सेमी व्यास, 0.5 सेमी अलग स्थान) इस प्रोटोकॉल में, तंत्र (तरफ दीवारों में सफेद; पारदर्शी सामने और पीछे दीवारों में 33 सेमी एक्स एक्स 28 सेमी 25 सेमी) एक ऐक्रेलिक वर्ग कक्ष के होते हैं एक पारदर्शी ऐक्रेलिक ढक्कन (चित्रा 1 ए) के द्वारा. यह काले agouti, या पतला ब्राउन चूहों के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक सफेद ऐक्रेलिक मंजिल (चित्रा 1 बी) पर चैम्बर जगह करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि मैं के साथ एक छवि विश्लेषण प्रणाली(मुफ्त डाउनलोड के लिए उपलब्ध, सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें) mageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम प्रत्येक कब्जा वीडियो छवि में एक सफेद पृष्ठभूमि से एक अंधेरे विषय अलग है. सूरजमुखी मनुष्य चूहे भी काले धातु ग्रिड और एक काले एक्रिलिक मंजिल (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रोशनी तंत्र के ऊपर छत से जुड़े होते हैं. ग्रिड मंजिल एलईडी रोशनी से 100 लक्स पर प्रकाशित है. एक सफेद शोर / टोन जनरेटर (चित्रा 1C) से जुड़े एक वक्ता 5 सेमी एक वातानुकूलित उत्तेजना (सीएस) के रूप में एक श्रवण क्यू (एक सफेद शोर, 55 डीबी) पेश करने के लिए ढक्कन के ऊपर एक छत पर मुहिम शुरू की है. ग्रिड असुविधाजनक प्रोत्साहन (अमेरिका) के रूप में एक बिजली footshock देने के लिए एक सदमे जनरेटर (चित्रा 1C) के लिए तार कर रहे हैं. परीक्षण के चैम्बर में परीक्षण के दौरान बाहरी शोर को कम करने के लिए एक soundproof कमरे (170 सेमी x 210 सेमी x 200 सेमी) (चित्रा -1) में रखा गया है. इस हालत में भी वर्तमान में एक के अधीन नहीं किया जा रहा है कि चूहों को रोकता हैएक श्रवण क्यू या परीक्षण चूहों के वोकलिज़ेशन सुनवाई से परीक्षण करें.
  2. cued परीक्षण के लिए तंत्र एक नया संदर्भ प्रदान करने, कंडीशनिंग चैम्बर से अलग गुण है कि एक कक्ष से बना है. यह माउस कंडीशनिंग चैम्बर से संबंधित नहीं होने के रूप में उपन्यास के संदर्भ में मानते है, ताकि जितना संभव संवेदी संकेत बदलने के लिए जरूरी है. आम तौर पर, एक अलग आकार बॉक्स या एक त्रिकोणीय चैम्बर प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, विभिन्न प्रकाश और / या घ्राण संकेत भी माउस के लिए प्रदान की जाती हैं. इस प्रोटोकॉल में, तंत्र एक ऐक्रेलिक त्रिकोणीय कक्ष है (33 सेमी x X 32 सेमी 29 सेमी, प्रत्येक पक्ष दीवार में सफेद) सूरजमुखी मनुष्य के लिए, काला agouti, या पतला ब्राउन चूहों या एक फ्लैट, काला मंजिल के लिए एक फ्लैट, सफेद फर्श के साथ चूहे, एक पारदर्शी ऐक्रेलिक ढक्कन (चित्रा 1E) के साथ कवर किया. एलईडी रोशनी तंत्र के ऊपर छत से जुड़े होते हैं. मंजिल की रोशनी स्तर 30 लक्स पर सेट किया जाता है. एक वक्ता 5 सेमी जनसंपर्क के लिए ढक्कन के ऊपर छत पर मुहिम शुरू की हैकंडीशनिंग के समय में चूहों के लिए प्रदान की जाती है कि के रूप में ही है कि एक श्रवण क्यू esent. त्रिकोणीय चैम्बर कंडीशनिंग और संदर्भ परीक्षण प्रदर्शन कर रहे हैं, जिसमें कमरे से एक अलग soundproof कमरे में स्थित है.
  3. प्रत्येक कक्ष ट्रैक्टर वीडियो फाड़नेवाला और यूएसबी माउस के व्यवहार पर नजर रखने के लिए छवि पर कब्जा डिवाइस, और तंत्र और माउस की छवियों के माध्यम से एक Windows कंप्यूटर से कनेक्ट करने में एक छत पर लगे चार्ज कपल्ड डिवाइस (सीसीडी) कैमरे से लैस है द्वारा कब्जा कर लिया और विश्लेषण कर रहे हैं आवेदन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम ImageFZ (प्रोटोकॉल 6 देखें). सफेद शोर और footshock जनरेटर स्वतः ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं; प्रारंभ समय और सफेद शोर और footshock की अवधि के लिए वीडियो में दिखाया गया है एक नमूना पाठ फ़ाइल 'सरल cond' देख (एक पाठ फ़ाइल में लिखा होना चाहिए आवेदन में पढ़ा जाता है जो पैरामीटर फ़ाइल में लिखा रहे हैं पर विवरण),.
  4. प्रत्येक परीक्षा, एक्रिलिक दीवारों शुरू होने से पहलेऔर फर्श सुपर hypochlorous पानी (पीएच 6-7) में लथपथ एक तौलिया के साथ साफ कर रहे हैं, और ग्रिड घ्राण cues पर आधारित एक पूर्वाग्रह को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ साफ कर रहे हैं. ग्रिड ग्रिड की वजह से जंग करने के लिए अपने विद्युत चालकता कम नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए इथेनॉल के बजाय सुपर hypochlorous पानी से साफ कर रहे हैं.

2. पशु तैयारी

  1. आम तौर पर दो से चार चूहों एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र (जैसे 07:00 पर पर रोशनी) के साथ एक तापमान नियंत्रित होल्डिंग रूम (23 ± 2 डिग्री सेल्सियस) में पिंजरे प्रति रखे जाते हैं.
  2. इस प्रोटोकॉल में, व्यवहार पर पिंजरे परिवहन के संभावित प्रभावों को कम करने के लिए और प्रयोगात्मक पर्यावरण के लिए चूहों अनुकूलित करने के लिए, चूहों युक्त पिंजरों एक soundproof परीक्षण के कमरे में कम से कम 30 मिनट से सटे एक soundproof प्रतीक्षालय में पशु होल्डिंग के कमरे से स्थानांतरित कर रहे हैं प्रत्येक परीक्षा शुरू होने से पहले.
  3. प्रयोगों (2A चित्रा) के सभी के दौरान प्रदर्शन किया जाना चाहिएअलग अलग समय 23,24 पर परीक्षण द्वारा उत्पादित व्यवहार विविधताओं को कम करने के लिए रोशनी या अंधेरे चरण में एएमई समय अवधि के प्रत्येक दिन है. इस प्रोटोकॉल में, प्रयोगों के सभी (प्रकाश चरण में 8:00-06:00) अंधेरे चरण के शुरू होने से पहले प्रकाश चरण और 1 घंटे के शुरू होने के बाद 1 घंटा के बीच आयोजित की जाती हैं. केवल एक उपकरण उपलब्ध है, तो प्रत्येक जीनोटाइप के चूहों प्रयोगात्मक समय और व्यवहार प्रदर्शन पर विषयों के परीक्षण के आदेश के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए एक counterbalanced क्रम में परीक्षण किया जाना चाहिए. ImageFZ 4 apparatuses के एक अधिकतम नियंत्रित कर सकते हैं. एक counterbalanced क्रम में 4 apparatuses का उपयोग करके एक साथ 4 चूहों का परीक्षण शोधकर्ता समय बचाने के लिए अनुमति देता है और माउस व्यवहार पर प्रयोगात्मक मापदंडों के संभावित प्रभाव को कम करता है.

3. अनुकूलन

  1. चूहे कंडीशनिंग कक्ष में रखा जाता है, और चूहों आम तौर पर स्वतंत्र रूप से 120 सेकंड के लिए कक्ष का पता लगाने के लिए अनुमति दी जाती है. इसके बाद, Auइस तरह के एक सफेद शोर, स्वर, और श्रवण क्लिकर के रूप में ditory क्यू, 30 सेकंड के लिए एक सीएस के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और एक 0.1-0.8 मा footshock ध्वनि के पिछले 2 सेकंड के दौरान एक अमेरिकी के रूप में चूहों को दिया जाता है. सीएस अमेरिका कतरन की प्रस्तुति संघ को मजबूत करने के लिए दोहराया है. चूहों आगे चैंबर के संदर्भ और प्रतिकूल अनुभव के बीच सहयोग स्थापित करने की अंतिम प्रस्तुति के बाद समय की लंबाई के लिए चैम्बर में छोड़ दिया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, नि: शुल्क अन्वेषण के 120 सेकंड के बाद, एक श्रवण क्यू (सफेद शोर, 55 डीबी) 30 सेकंड के लिए प्रस्तुत किया जाता है, और एक 0.3 मा footshock सफेद शोर के पिछले 2 सेकंड के दौरान लगातार वितरित किया जाता है. 90 सेकंड के बाद, footshock साथ श्रवण क्यू की जोड़ी फिर से विषयों को दिया जाता है. सीएस और अमेरिका की प्रस्तुति (चित्रा 2 बी) (कंडीशनिंग की शुरुआत के बाद 120, 240, और 360 सेकंड) तीन प्रति सत्र बार दोहराता है. अंतिम footshock के बाद चूहों में 90 सेकंड के लिए कक्षों में undisturbed छोड़ दिया जाता है.
  2. कंडीशनिंग सत्र शुरू होने से पहले, प्लग में मेनू 'FZ कंडीशनिंग और FZ ऑनलाइन (4 कक्ष)' का चयन करें, ImageFZ अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम चलाते हैं, और कदम दर कदम के रूप में निम्न पैरामीटर मान सेट.
    1. चरण 1: परियोजना आईडी. आप अपने डेटा फ़ाइलों को स्टोर करना चाहते हैं, जहां एक फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें.
    2. चरण 2: सत्र नाम. 'सत्र' बॉक्स में, प्रयोगात्मक तारीख जैसे, किसी भी शब्द लिखें, और शुरू करने का समय और सफेद शोर और footshock की अवधि 'संदर्भ' बॉक्स में, लिखा जाता है, जिसमें एक संदर्भ पाठ फ़ाइल का चयन करें. एक नमूना पाठ फ़ाइल वीडियो में दिखाया गया है.
    3. चरण 3: पैरामीटर सेटिंग. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक बॉक्स में पैरामीटर मान दर्ज करें.
      1. दर (फ्रेम / सेक): छवि अधिग्रहण के फ्रेम दर, जैसे 1 फ्रेम / सेक.
      2. अवधि (एसईसी): कंडीशनिंग के मामले में, कुल अवधि 480 सेकंड है.
      3. बिन अवधि (एसईसी): जैसे 60 सेकंड; डेटा प्रत्येक ब्लॉक में विश्लेषण कर रहे हैं60 सेकंड की.
      4. विषय आकार - मिनट (पिक्सेल): ImageFZ प्रत्येक छवि में एक सफेद पृष्ठभूमि में काले कण (पिक्सल के कुछ मास) के रूप में एक माउस और शोर का पता लगाता है. काले कण (पिक्सल) का क्षेत्र 'विषय आकार - मिनट (पिक्सेल)' से कम नहीं है जब मूल्य (उदाहरण के लिए 100 पिक्सल), कणों शोर के रूप में माना जाता है और छवि विश्लेषण से बाहर रखा गया है.
      5. अधिकतम (पिक्सेल) - विषय का आकार: काले कणों के आकार 'विषय आकार - अधिकतम (पिक्सेल)' के आकार से अधिक कर रहे हैं जब मूल्य, कणों के विश्लेषण से बाहर रखा गया है.
      6. फ्रेम आकार - चौड़ाई / ऊंचाई (सेमी): चैंबर आयाम, यानी 33 सेमी चौड़ा और 25 सेमी उच्च.
      7. मानदंड (पिक्सल) बर्फ़ीली: 30 पिक्सल जैसे, प्रोटोकॉल 6 में विवरण देखें.
      8. अवधि बर्फ़ीली - मिनट (एसईसी): जैसे 2 सेकंड, कोई माउस आंदोलन केवल कम से कम 2 सेकंड के लिए पता चला है, उसके व्यवहार 'ठंड' के रूप में नहीं गिना जाता है;.
      9. शॉक दर (फ्रेम / सेक): प्रोटोकॉल 6 में विवरण देखें.
    4. चरण 4: विषय आईडी. विषय पहचान दर्ज करें.
    5. चरण 5: कैमरा सेटिंग्स. चमक और कब्जा कर लिया छवि के विपरीत नियंत्रण.
    6. चरण 6: दहलीज सेटिंग्स. प्रत्येक छवि में एक सफेद पृष्ठभूमि में काले पिक्सल के रूप में एक काला माउस का पता लगाने के लिए सीमा मान को समायोजित और (प्रोटोकॉल 6 में विवरण देखें) 'ठंड' या 'गैर ठंड' के रूप में माउस व्यवहार न्यायाधीश करने के लिए. एक सूरजमुखी मनुष्य माउस का विश्लेषण करने के लिए, चेकबॉक्स 'पलटना मोड' पर क्लिक करें और उचित सीमा मान को समायोजित.
    7. चरण 7: सेट केज फील्ड. तुम पर कब्जा करना चाहते हैं कि प्रत्येक कक्ष के क्षेत्र निर्दिष्ट करें. उपकरण बॉक्स में आयत बटन क्लिक करने के बाद, लाइव छवि खिड़की पर चैंबर के फर्श के चारों ओर एक आयत आकर्षित. अगला, कक्ष संख्या चुनें और 'सेट' बटन पर क्लिक करें. अंत में, 'पूरा' बटन पर क्लिक करें.
  3. <पैरामीटर सेटिंग्स सेट कर रहे हैं ली> के बाद, एक प्रारंभिक परीक्षण छवि विश्लेषण प्रणाली और सफेद शोर / सदमे जनरेटर समस्याओं के बिना काम लिए तय है कि दिन के पहले टेस्ट मैच के पहले अभ्यास चूहों (विषयों के रूप में उपयोग नहीं किया चूहों) का उपयोग कर दिया जाना चाहिए.
  4. आसन्न प्रतीक्षालय से soundproof कमरा परीक्षण करने के लिए अभ्यास चूहों युक्त एक घर पिंजरे में ले जाएँ, और कंडीशनिंग कक्ष में प्रत्येक माउस जगह. तुरंत कक्ष में चूहों रखने के बाद, ImageFZ के प्रारंभ बटन पर क्लिक करें. अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर आप एक संदर्भ फाइल में निर्दिष्ट है कि आदेश में चूहों को श्रवण cues और / या बिजली footshocks पेश करेंगे.
  5. 480 सेकंड बीत जाने पर, उनके घर पिंजरे में चूहों लौटने और होल्डिंग कमरे में शेल्फ को पिंजरे वापसी.
  6. सावधानी कक्षों से साफ करें. फिर, 'अगला विश्लेषण' बटन पर क्लिक करें और परीक्षण चूहों के लिए कदम 3.2.4-3.6 दोहराएँ.
  7. ImageFZ भंडार रहते हैं और झगड़ा प्रारूप में छवियों का पता लगा. कार्यक्रम की अनुमति देता हैहमें संशोधित पैरामीटर मान का उपयोग कर छवियों reanalyze के लिए एक ऑफ़लाइन विश्लेषण करने के लिए. आप एक ऑफ़लाइन विश्लेषण का संचालन करते हैं, तो मेनू प्लग में 'डर कंडीशनिंग और FZ ऑफलाइन' का चयन करें और आप reanalyze जाने वाले डेटा फ़ोल्डर का चयन करें. इसके बाद, इनपुट पैरामीटर मान फिर से, और 'पूरा' बटन पर क्लिक करें.

4. प्रसंग टेस्ट

  1. कंडीशनिंग सत्र समाप्त होने के बाद, चूहों ही कंडीशनिंग कक्ष में लौटे और प्रासंगिक रूप से वातानुकूलित डर (संदर्भ परीक्षण) को मापने के लिए व्यवहार ठंड के लिए रन बनाए हैं. कंडीशनिंग और संदर्भ परीक्षण के बीच एक देरी अंतराल आम तौर पर 24 घंटे में निर्धारित किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, हाल की स्मृति और 25 (क्रमशः टेस्ट 1 दिन और अधिक से अधिक 28 दिनों कंडीशनिंग के बाद, द्वारा मापा) दूरस्थ स्मृति का आकलन करने के लिए, चूहों संदर्भ परीक्षण कंडीशनिंग सत्र के बाद लगभग 24 घंटे और 30 दिनों के अधीन हैं. चूहों cond में रखा जाता हैचैम्बर itioning और स्वतंत्र रूप से सीएस और अमेरिका प्रस्तुतियों (चित्रा -2) के बिना 300 सेकंड के लिए कक्ष का पता लगाने के लिए अनुमति दी जाती है.
  2. ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम को चलाने और कंडीशनिंग में (धारा 3.2.3 देखें) के रूप में एक ही तरीके से आवेदन सॉफ्टवेयर के पैरामीटर मूल्यों को निर्धारित है, लेकिन, 300 सेकंड तक इस परीक्षण की अवधि के समय को संशोधित करने और संदर्भ परीक्षण के लिए एक संदर्भ पाठ फ़ाइल का चयन . सेटिंग बदलने के बाद, एक प्रारंभिक परीक्षण ImageFZ सिस्टम की जांच करने के लिए अभ्यास चूहों का उपयोग कर दिया जाना चाहिए.
  3. कंडीशनिंग के चेंबर में प्रत्येक माउस रखें और प्रारंभ बटन पर क्लिक करें. 300 सेकंड बीत जाने पर, उनके घर पिंजरे में चूहों लौटने, और cued परीक्षण शुरू होता है जब तक अबाधित पिंजरे में छोड़ दें.
  4. कक्षों साफ करें. फिर, 'अगला विश्लेषण' बटन पर क्लिक करें और फिर से परीक्षण चूहों में 4.3-4.4 कदम.

5. Cued टेस्ट

  1. Cued परीक्षण प्रसंग परीक्षण के एक ही दिन या अगले दिन पर आयोजित किया जाता है.इस परीक्षण में, चूहों 3 मिनट के लिए कंडीशनिंग चैम्बर से संबंधित नहीं है कि एक नया संदर्भ प्रदान करने, बहुत अलग गुणों के साथ एक और परीक्षण कक्ष में रखा जाता है. पहले 3 मिनट के अंत में, कंडीशनिंग के समय में प्रस्तुत किया जाता है कि श्रवण क्यू उपन्यास संदर्भ वातावरण में 3 मिनट के लिए चूहों को दिया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, cued परीक्षण के कुछ ही घंटों संदर्भ परीक्षण के बाद किया जाता है. चूहे 360 सेकंड के लिए त्रिकोणीय कक्ष का पता लगाने के लिए अनुमति दी जाती है. पहले 3 मिनट में एक सीएस और न ही अमेरिका न तो प्रस्तुत किया जाता है, और उसके बाद, एक सीएस (एक 55 डीबी सफेद शोर) पिछले 3 मिनट के लिए प्रस्तुत किया है.
  2. ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम चलाने के लिए और 360 सेकंड के लिए परीक्षण की अवधि के समय को संशोधित करने और cued परीक्षण के लिए एक संदर्भ पाठ फ़ाइल का चयन करें, सिवाय कंडीशनिंग में उसी तरह के रूप में पैरामीटर मान सेट. सेटिंग समायोजन करने के बाद, एक प्रारंभिक परीक्षण ImageFZ सिस्टम की जांच करने के लिए अभ्यास चूहों का उपयोग कर दिया जाना चाहिए.
  3. त्रिकोणीय चेंबर में प्रत्येक माउस रखें और प्रारंभ क्लिक करेंबटन. 360 सेकंड बीत जाने पर, उनके घर पिंजरे में चूहों लौटने और होल्डिंग कमरे के शेल्फ को पिंजरे वापसी.
  4. कक्षों साफ करें. फिर, 'अगला विश्लेषण' बटन पर क्लिक करें और फिर से परीक्षण चूहों में 5.3-5.4 कदम.
  5. इसके अलावा, दूरस्थ स्मृति परीक्षण में 4-5 के बारे में 30 दिनों कंडीशनिंग सत्र (2A चित्रा) के बाद प्रोटोकॉल दोहराने के लिए.

6. छवि विश्लेषण

  1. स्वतः ImageFZ का उपयोग डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण करते हैं. इस अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम Tsuyoshi Miyakawa द्वारा संशोधित (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और http://rsb.info.nih.gov/ij/ पर उपलब्ध वेन Rasband द्वारा विकसित) सार्वजनिक डोमेन ImageJ कार्यक्रम, (ImageFZ अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर पर आधारित है मुफ्त डाउनलोड के लिए उपलब्ध,) सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें.
  2. सभी प्रयोगों के लिए, एक सहित, एक यूएसबी वीडियो पर कब्जा डिवाइस का उपयोग ImageFZ साथ एक भी फ्रेम दर (उदाहरण के लिए 1 एफपीएस) पर कब्जा छवियोंवीडियो कैमरा. , लगातार छवियों से यात्रा की दूरी को मापने के लिए एक काले कण (एक माउस) और एक सफेद पृष्ठभूमि में खंड छवियों पर सेट है, जो कार्यक्रम (जैसे 80 पिक्सल), के 'दहलीज मिनट' मूल्य समायोजित करने के लिए. यात्रा की दूरी XY के प्रत्येक सेट के बीच की दूरी लगातार छवियों में कण के गुरुत्वाकर्षण के केंद्र के लिए निर्देशांक से गणना की है.
  3. फिर 'दहलीज मिनट (XOR)', लगातार छवियों से ठंड व्यवहार को मापने समायोजित करने के लिए एक काले कण (माउस) और पृष्ठभूमि में खंड छवियों पर सेट है, जो कार्यक्रम (जैसे 160 पिक्सल), के मूल्य, और गणना लगातार छवियों के प्रत्येक जोड़ी के कणों के बीच nonoverlapping क्षेत्रों की क्षेत्र (पिक्सेल) की राशि. प्रत्येक छवि में काले कण पूंछ को छोड़कर माउस के पूरे शरीर के आकार से मेल खाता है जब तक सीमा उपकरण के स्लाइडर का उपयोग मूल्य समायोजित करें. यदि nonoverla का क्षेत्रक्षेत्र pping 'ठंड कसौटी' मूल्य (उदाहरण के लिए 30 पिक्सल) नीचे है, व्यवहार आम तौर पर श्वसन और दिल की धड़कन के अलावा किसी भी आंदोलन का पूर्ण अभाव के रूप में परिभाषित किया गया है जो (चित्रा 3), 'ठंड' माना जाता है. क्षेत्र में इस मूल्य से अधिक है, व्यवहार 'गैर ठंड' (चित्रा 3) माना जाता है. न्याय ठंड की परिभाषा के आधार पर किया जाना चाहिए. चूहे कभी कभी एक सूक्ष्म आंदोलन और भय को दर्शाता है कि एक ठंड व्यवहार के रूप में नहीं माना जा सकता है जो एक क्षणिक गतिहीनता, दिखा रहे हैं. डर की अभिव्यक्ति से अलग होने की संभावना है जो एक कम समय (उदाहरण के लिए कम से कम 2 सेकंड), के लिए रहता है कि गतिहीनता, ठंड की समय सीमा निर्धारित करके विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है. मूल्य (उदाहरण के लिए 2 सेकंड) - समय सीमा, इनपुट 'मिनट (एसईसी) अवधि बर्फ़ीली' सेट करने के लिए.
  4. स्वतः calcul ImageFZ कार्यक्रमAtes दूरी (सेमी) और ठंड का प्रतिशत कूच. परिणाम पाठ फ़ाइलों में बचाया, और रहते हैं और छवियों को एक झगड़ा प्रारूप में जमा हो जाती है पता लगा रहे हैं. दूरी बिजली footshock संवेदनशीलता के एक सूचकांक के रूप में (सेमी) कूच मापने के लिए, ImageFZ कार्यक्रम भी 2 तक एक 2 सेकंड footshock की डिलीवरी से पहले 2 सेकंड से मापा 6 सेकंड के लिए एक उच्च फ्रेम दर (उदाहरण के लिए 4 एफपीएस), पर छवियों का अधिग्रहण सेकंड ऑनलाइन विश्लेषण के दौरान footshock के बाद. पहले के दौरान छवि को पकड़ने के लिए फ्रेम दर निर्धारित, और करने के लिए footshock, में इनपुट एक मूल्य 'शॉक दर (फ्रेम / सेक)' बॉक्स के बाद. ऑनलाइन विश्लेषण के बाद, यात्रा की दूरी के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए एक मेनू प्लग में 'FZ शॉक ऑफलाइन' का चयन करके ऑफ़लाइन विश्लेषण करते हैं.
  5. ImageFZ कार्यक्रम के पैरामीटर मान प्रारंभिक परीक्षण में मानव पर्यवेक्षकों द्वारा प्राप्त उन लोगों के लिए इसी तरह के परिणाम उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. पुस्तिका स्कोरिंग के लिए, ठंड व्यवहार लगातार एक stopwatc का उपयोग कर मापा जाता हैघंटे और एक घटना रिकॉर्डिंग कार्यक्रम या ImageFZ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण के दौरान एक तात्कालिक समय नमूने प्रक्रिया हर 3-10 सेकंड,. दो पर्यवेक्षकों आम तौर पर व्यवहार अवलोकन आचरण. , छवि विश्लेषण के परिणामों मानव पर्यवेक्षकों के उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए ImageFZ कार्यक्रम के पैरामीटर मूल्यों को समायोजित ImageFZ कार्यक्रम के एक ऑफ़लाइन विश्लेषण करते हैं, 'दहलीज मिनट (XOR)' को संशोधित करने और 'ठंड कसौटी' मूल्यों के लिए . ऑफ़लाइन विश्लेषण करने के लिए, प्लग में मेनू 'FZ ऑफ़लाइन' और इनपुट किसी भी पैरामीटर मान का चयन करें.

7. समस्या निवारण

  1. कैसे ImageFZ कार्यक्रम प्राप्त और स्थापित किया जा सकता है?
    ImageFZ कार्यक्रम (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें) हमारी वेबसाइट से मुफ्त डाउनलोड के लिए उपलब्ध है, और एक विंडोज कंप्यूटर पर चलाता है. ImageFZ के लिए ज़िप फ़ोल्डर डाउनलोड करने और अपने कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर स्थापित करें. INSTALLATI के लिए 'Readme.txt' फ़ाइल देखेंविवरण पर और कदम दर कदम निर्देश का पालन करें.
  2. क्यों त्रुटि संदेश 'त्रुटि सेटिंग कब्जा डिवाइस' प्रदर्शित की जाती है?
    कैमरा केबल के कनेक्शन और यूएसबी छवि पर कब्जा डिवाइस के लिए अपने ड्राइवर स्थापना की जाँच करें. सेटिंग्स के साथ कोई समस्या नहीं है, तो ImageFZ सॉफ्टवेयर अपनी छवि पर कब्जा डिवाइस के साथ काम नहीं कर सकता. ImageFZ सॉफ्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए उचित डिवाइस के विषय में 'Readme.txt' फ़ाइल देखें.
  3. ImageFZ एक कण के रूप में माउस के पूरे शरीर का पता नहीं लगा सकते हैं.
    'दहलीज मिनट' और / या 'दहलीज मिनट (XOR)' वर्तमान मूल्य से कम के मूल्य निर्धारित करें. ImageFZ जैसे एक परीक्षा कक्ष के कोने में एक विशिष्ट स्थान में, माउस का पता नहीं लगा सकते हैं, तो इस तरह के एक समान रूप से प्रबुद्ध फर्श या माउस और पृष्ठभूमि के बीच एक थोड़ा विषम अंतर के रूप में अपर्याप्त परीक्षण की स्थिति, मौजूद हो सकता है. इस समस्या को हल करने के लिए, पैरामीटर मान (समायोजित उदा
  4. एक उच्च फ्रेम दर पर छवि पर कब्जा ऑनलाइन विश्लेषण के दौरान कंप्यूटर धीमा.
    वर्तमान दर से कम एक मूल्य के लिए फ्रेम दर निर्धारित, और ऑनलाइन विश्लेषण करते हैं. प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है ImageFZ विश्लेषण, 1 एफपीएस पर छवि अधिग्रहण के माध्यम से, सही ठंड को मापने के लिए पर्याप्त है.
  5. ImageFZ विश्लेषण के परिणामों मानव स्कोरिंग के लोगों के साथ सहमत नहीं हूँ.
    संग्रहीत छवि और फैसले परिणाम फ़ाइलों की जाँच करें. ImageFZ ठंड overestimates, तो वर्तमान मूल्य से कम एक मूल्य के लिए 'ठंड कसौटी' सेट, और ऑफ़लाइन विश्लेषण करते हैं. ImageFZ ठंड underestimates, तो वर्तमान मूल्य से अधिक एक मूल्य के लिए 'ठंड कसौटी' की स्थापना की.
  6. Optogenetical में और vivo electrophysiological ई मेंxperiments, माउस के सिर से जुड़ी फाइबर केबल ठंड के निर्णय के साथ हस्तक्षेप.
    कोट एक काला माउस के लिए सफेद में केबल्स, और केबल का पता नहीं कर रहे हैं जब तक कैमरे की स्थिति और कोण बदल जाते हैं.
  7. क्या ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए आवश्यक है?
    ImageFZ कार्यक्रम के रूट निर्देशिका में 'Image_FZ' नाम का एक फ़ोल्डर बनाएँ. इस फ़ोल्डर में सबफ़ोल्डर 'छवियाँ' और 'सत्र' बना. 'छवियाँ' फ़ोल्डर में एक 8 बिट ग्रे पैमाने पर छवि ले जाएँ, और छवि फ़ाइल नाम 'सत्र' फ़ोल्डर में लिखा है, जिसमें एक पाठ फ़ाइल बनाएँ. इसके बाद, ImageFZ ऑफ़लाइन विश्लेषण चलाने के लिए, और कार्यक्रम के निर्देशों का पालन करें.

Representative Results

डर कंडीशनिंग परीक्षण में, मानव प्रयोगकर्ताओं श्रम प्रधान प्रत्यक्ष अवलोकन 26-29 के माध्यम से ठंड व्यवहार यों इस्तेमाल किया है, लेकिन हाल ही में photobeam आधारित कंप्यूटर माप (जैसे 'फ्रीज मॉनिटर' सिस्टम) और छवि विश्लेषण सिस्टम स्वचालित रूप से करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ठंड व्यवहार 26,30-32 उपाय. ImageFZ नीचे वर्णित के रूप में, मानव अवलोकन के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के लिए तुलनीय परिणाम पैदा करता है जो एक स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणाली, है. यहाँ, हम अलग मापदंडों के तहत ImageFZ विश्लेषण के लोगों के साथ मानव अवलोकन के परिणामों की तुलना में: 'दर (फ्रेम / सेक)' और '(पिक्सेल) कसौटी बर्फ़ीली.' इस प्रयोग में, पांच पुरुष C57BL/6J चूहों (एसडी (जी ± शरीर के वजन मतलब है), 31.4 ± 3.55, एसडी (पिक्सल), 351.6 ± 62.2 ± शरीर के आकार) मतलब उम्र के 15-27 सप्ताह में इस्तेमाल किया गया. मानव अवलोकन एक घटना रिकॉर्डिंग कार्यक्रम (एक Macintosh OS9 सॉफ्टवेयर प्रोग्राम) का उपयोग किया गया था, कि जारी रखने के लिए एक कुंजी दबाने घटनाएक माउस कोई आंदोलन का डटकर प्रदर्शित जब 2 सेकंड या उससे अधिक के लिए डी 'ठंड' माना जाता था. ठंड का प्रतिशत प्रत्येक परीक्षा में हर 60 सेकंड की गणना और सहसंबंध विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. 2 पर्यवेक्षकों द्वारा रन ठंड का प्रतिशत (कंडीशनिंग, आर = 0.879 के लिए interobserver विश्वसनीयता,; संदर्भ परीक्षण, अनुसंधान = 0.957 के लिए; cued परीक्षण के लिए, आर = 0.866, = 0.888 सभी मामलों के लिए, आर) एक मानव को उत्पन्न करने के लिए औसत रहा था स्कोर. ठंड प्रत्येक फ्रेम दर (यानी 1, 2, और 4 एफपीएस) के साथ ImageFZ के माध्यम से मापा प्रतिशत और मानव टिप्पणियों के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के बीच सहसंबंध जांच की गई. 4 चित्र में सचित्र, ImageFZ (1, 2, और 4 एफपीएस) के माध्यम से गणना की ठंड प्रतिशत अत्यधिक 2 पर्यवेक्षकों की माप से प्राप्त औसत मूल्य के साथ सहसंबद्ध थे. विशेष रूप से, एक उच्च फ्रेम दर पर छवियों पर कब्जा हमेशा सर्वश्रेष्ठ सह - संबंध का उत्पादन नहीं करता. ई में मानव पर्यवेक्षकों से प्राप्त उन लोगों के लिए इसी तरह 1 एफपीएस उत्पन्न परिणामों पर छवि विश्लेषणACH परीक्षण. मानव टिप्पणियों के माध्यम से मापा और 'बर्फ़ीली कसौटी (पिक्सेल)' की हर शर्त के तहत ImageFZ का उपयोग ठंड प्रतिशत (यानी 20, 30, और 40 पिक्सल) के बीच सहसंबंध जांच की गई. 20 के 'बर्फ़ीली कसौटी (पिक्सेल)', 30, और 40 पिक्सल पर ImageFZ उपयोग कर की गणना ठंड प्रतिशत, सभी मामलों में, अत्यधिक (चित्रा 5) मानव टिप्पणियों के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के साथ सहसंबद्ध थे. ठंड कसौटी मानव पर्यवेक्षकों द्वारा 'ठंड' माना जाता है एक कम मूल्य, एक माउस की सूक्ष्म आंदोलन के लिए निर्धारित है जब चित्रा 5D, में दिखाया गया है, 'गैर ठंड' ImageFZ का उपयोग पर विचार किया जाएगा. कसौटी एक उच्च मूल्य पर सेट है, इसके विपरीत, यदि एक माउस के आंदोलन, मानव पर्यवेक्षकों द्वारा 'गैर ठंड' के रूप में रन बनाए, पर विचार किया जाएगा 'ठंड' ImageFZ (आंकड़े 5C, 5F, और 5I) का उपयोग कर. इस प्रकार, सबसे अधिक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, ImageFZ कार्यक्रम के प्रत्येक पैरामीटर हमें calibrated किया जाना चाहिएप्रत्येक परीक्षण के वातावरण में मानव टिप्पणियों के माध्यम से रन बनाए डेटा आईएनजी.

इसके अलावा, हम ImageFZ का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए एक photobeam आधारित कंप्यूटर माप प्रणाली (फ्रीज मॉनिटर प्रणाली), (6 चित्र देखें) का उपयोग करते हुए, एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा उत्पन्न परिणामों की तुलना में. मानव पर्यवेक्षक इलाज समूह और ImageFZ स्कोरिंग के परिणामों को अंधा हो गया था. रुक मॉनिटर प्रणाली के पैरामीटर सेटिंग्स के लिए, हम एक पहले से मान्य सिस्टम 30 से ठंड का प्रतिशत 3 उपायों का इस्तेमाल किया. संक्षेप में, 10 सेकंड अंतराल की संख्या में जो जानवरों प्रत्येक 5 सेकंड के अंतराल की शुरुआत के बीच (क्रमशः 1sec 10sec और 2sec 10sec,) अंतराल और विलंबता के पहले नई किरण पार करने के लिए अधिक से अधिक 1 या 2 सेकंड की आवश्यकता है और इस अंतराल (Latency3) के भीतर तीसरे नई किरण रुकावट मापा गया. माउस ठंड थी, जिसके दौरान अंतराल के प्रतिशत या समय आर की कुल राशि का प्रतिशततीसरे photobeam गणना की गई तोड़ने के लिए equired.

प्रत्येक प्रणाली में मापा ठंड के प्रतिशत में 6 चित्र में सचित्र हैं. समूहों टी परीक्षण द्वारा पीछा दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा (1 टेबल देखें) का उपयोग की तुलना में थे. ImageFZ (चित्रा 6B) का उपयोग करके मापा ठंड प्रतिशत एक photobeam आधारित प्रणाली (आंकड़े 6C ई) का उपयोग कर प्राप्त आंकड़ों की तुलना में मानव प्रेक्षण (चित्रा 6A) के माध्यम से बने उन के समान थे. , ठंड प्रतिशत के बीच सहसंबंध मापा जबकि प्रत्येक परीक्षा में ImageFZ प्रोग्राम का उपयोग करके मापा ठंड प्रतिशत अत्यधिक (; संदर्भ परीक्षण, = 0.970 आर cued परीक्षण, अनुसंधान = 0.934 कंडीशनिंग, आर = 0.947) मानव अवलोकन के माध्यम से बने उन लोगों के साथ सहसंबद्ध थे photobeam आधारित कंप्यूटर माप प्रणाली (1sec 10sec, 2sec 10sec, या Latency3) का उपयोग और मानव पर्यवेक्षक कंडीशनिंग, आर = 0.503, 0.593, और 0.761 (कम थे; संदर्भ Tस्था, ImageFZ और मानव प्रेक्षण (आंकड़े 7A और 7B) का उपयोग करके मापा ठंड प्रतिशत के बीच सहसंबंध की तुलना में आर = 0.772, 0.819, और .912). इसके अलावा, चित्रा 7 मानव अवलोकन के माध्यम से प्राप्त की है और प्रत्येक माउस में ImageFZ का उपयोग ठंड प्रतिशत के बीच मतभेदों के सबसे छोटे मतभेद थे कि पता चलता है. इन परिणामों से ठंड की मात्रा को मापने जब ImageFZ का उपयोग करके मापा ठंड प्रतिशत बेहद सटीक है मानव अवलोकन और उस ImageFZ के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के लिए समान थे कि संकेत दिया.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रासंगिक के लिए apparatuses और भय कंडीशनिंग परीक्षण cued. कंडीशनिंग और संदर्भ परीक्षण के लिए (एक) एक ऐक्रेलिक वर्ग कक्ष, ( (सी) एक सफेद शोर / टोन जनरेटर और एक सदमे जनरेटर, (डी) एक soundproof कमरे, और (ई) cued परीक्षण के लिए एक फ्लैट फर्श के साथ एक ऐक्रेलिक त्रिकोणीय चैंबर. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) प्रासंगिक के अवलोकन और भय कंडीशनिंग परीक्षण cued, (बी) कंडीशनिंग, (सी) सीontext परीक्षण, और (डी) परीक्षण cued. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा छवि विश्लेषण. लगातार छवियों के प्रत्येक जोड़ी के लिए, माउस ले जाया गया, जिसके माध्यम से क्षेत्र (पिक्सेल) की राशि ImageFZ से गणना की है. इस क्षेत्र में एक निश्चित सीमा (जैसे 30 पिक्सल) कम होता है तो व्यवहार 'ठंड' मुलजिम है. क्षेत्र की मात्रा के बराबर या सीमा से अधिक है, व्यवहार 'गैर ठंड' माना जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. मानव अवलोकन के माध्यम से मापा उन लोगों के साथ ImageFZ का उपयोग विभिन्न फ्रेम दर पर छवियों से गणना की ठंड प्रतिशत की तुलना. डर कंडीशनिंग परीक्षण पुरुष C57BL/6J चूहों (एन = 5) का उपयोग किया गया. परीक्षण के दौरान दोनों पर्यवेक्षकों ठंड व्यवहार रन बनाए. इसके साथ ही, जीना छवियों ImageFZ प्रोग्राम का उपयोग 4 एफपीएस पर कब्जा कर लिया गया. 4 एफपीएस पर कब्जा कर लिया फ़ाइलें 1 एफपीएस या 2 एफपीएस पर कब्जा कर लिया छवियों के अनुरूप करने के तख्ते निकालने के बाद का आकार छोटा कर रहे थे. 'दर (फ्रेम / सेक)' के पैरामीटर मान 1, 2, या 4 एफपीएस के लिए स्थापित किए गए थे, और प्रत्येक 60 सेकंड बिन में ठंड प्रतिशत ImageFZ ऑफ़लाइन विश्लेषण का उपयोग कर छवि फ़ाइलों से गणना की गई. प्रत्येक डॉट प्रत्येक 60 सेकंड बिन की ठंड प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. मानव अवलोकन और ImageFZ विश्लेषण से प्राप्त आंकड़ों के बीच पियर्सन की सहसंबंध गुणांक गणना की गई.बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. ImageFZ और मानव टिप्पणियों के माध्यम से मापा उन का उपयोग विभिन्न ठंड कसौटी मूल्यों पर छवियों से गणना की ठंड प्रतिशत डर कंडीशनिंग परीक्षण पुरुष C57BL/6J चूहों (एन = 5) का उपयोग किया गया. तुलना की गई. परीक्षण के दौरान दोनों पर्यवेक्षकों ठंड व्यवहार दर्ज की गई, और जीना छवियों ImageFZ कार्यक्रम का उपयोग कर लिया गया. प्रत्येक 60 सेकंड बिन में ठंड प्रतिशत 20, 30, या 40 पिक्सल 'बर्फ़ीली कसौटी (पिक्सेल)' के पैरामीटर मूल्यों की स्थापना, ImageFZ ऑफ़लाइन विश्लेषण के माध्यम से छवियों (1 फ्रेम / सेक) से गणना की गई. प्रत्येक डॉट प्रत्येक 60 सेकंड बिन की ठंड प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. पियर्सन की सहसंबंध सहमानव अवलोकन और ImageFZ विश्लेषण से प्राप्त आंकड़ों के बीच efficients प्रत्येक परीक्षा में गणना की गई. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. ठंड के प्रतिशत पुरुष C57BL/6J चूहों के असुविधाजनक और वातानुकूलित समूह (एन = 5, प्रत्येक समूह) में स्वचालित प्रणाली और मानव अवलोकन उपयोग करके मापा गया. (ए) मानव प्रेक्षण, (बी) ImageFZ, (सी) की निगरानी प्रणाली 1 (1sec 10sec), (डी) मॉनिटर प्रणाली 2 (2sec 10sec) फ्रीज, और (ई) की निगरानी प्रणाली 3 (Latency3) रुक रुक. समूह की तुलना टी परीक्षण (द्वारा पीछा दो तरह से दोहराया उपायों एनोवा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया अनोखाnditioned समूह बनाम वातानुकूलित समूह, *, पी 0.05 <; †, पी <0.01). ImageFZ मानव अवलोकन के माध्यम से बने उन लोगों के लिए समान थे उपयोग कर प्राप्त डेटा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
चित्रा 7. सहसंबंध और ठंड प्रतिशत स्वचालित प्रणाली और मानव अवलोकन के माध्यम से रन बनाए बीच स्वचालित प्रणाली और मानव अवलोकन का उपयोग करके मापा ठंड प्रतिशत,. (एबी) स्कैटर भूखंडों और पियर्सन की सहसंबंध गुणांक के बीच मतभेद की आवृत्ति वितरण दिखाया गया है. ImageFZ उपयोग कर की गणना ठंड प्रतिशत, अत्यधिक मानव अवलोकन के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के साथ सहसंबद्ध थे. एक 10% अलग से भी कम की (सीएफ) संयोगडेटा ImageFZ मानव अवलोकन के माध्यम से विश्लेषण किया उन लोगों के साथ तुलना की गई विश्लेषण का उपयोग कर जब सम्मेलन स्वचालित प्रणाली बनाम मानव अवलोकन से प्राप्त ठंड प्रतिशत के बीच उच्चतम थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ANOVAs
शर्त समय हालत एक्स समय
दिन 1 (कंडीशनिंग)
मानव एफ (1,8) = 28.53, पी = 0.0007 एफ (7,56) = 20.79, पी <0.0001 एफ (7,56) = 16.58, पी <0.0001
ImageFZ एफ (1,8) = 13.97, पी = 0.0057 एफ (7,56) = 21.40, पी <0.0001 एफ (7,56) = 11.69, पी <0.0001
रुक मॉनिटर (1sec10sec) एफ (1,8) = 5.16, पी = 0.0528 एफ (7,56) = 2.39, पी = 0.0329 एफ (7,56) = 0.72, पी = 0.6572
रुक मॉनिटर (2sec10sec) एफ (1,8) = 4.07, पी = 0.0782 एफ (7,56) = 3.44, पी = 0.0039 एफ (7,56) = 1.52, पी = 0.1803
रुक मॉनिटर (Latency3) एफ (1,8) = 4.44, पी = 0.0682 एफ (7,56) = 9.94, पी <0.0001 एफ (7,56) = 4.33, पी = 0.0007
दिन 2 (संदर्भ)
मानव एफ (1,8) = 42.94, पी = 0.0002 एफ (4,32) = 1.91, पी = 0.1336 एफ (4,32) = 1.48, पी = 0.2302
ImageFZ एफ (1,8) = 49.61, पी = 0.0001 एफ (4,32) = 2.06, पी = 0.1087 एफ (4,32) = 0.83, पी = 0.5174
रुक मॉनिटर (1sec10sec) एफ (1,8) = 20.28, पी = 0.002 एफ (4,32) = 1.63, पी = 0.1918 एफ (4,32) = 0.55, पी = 0.6997
रुक मॉनिटर (2sec10sec) एफ (1,8) = 40.20, पी = 0.0002 एफ (4,32) = 2.66, पी = 0.0504 एफ (4,32) = 1.20, पी = 0.3306
रुक मॉनिटर (Latency3) एफ (1,8) = 35.30, पी = 0.0003 एफ (4,32) = 2.49, पी = 0.0626 एफ (4,32) = 1.09, पी = 0.3793

तालिका 1. आँकड़ों की तुलना.

Discussion

प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग परीक्षण सीखने और स्मृति का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मानदंड में से एक है. यह परीक्षण एक संघ एक संदर्भ और / या एक वातानुकूलित उत्तेजना (श्रवण क्यू) और एक aversive उत्तेजना (बिजली footshock) के बीच किया जाता है, जिसमें Pavlovian कंडीशनिंग का एक रूप है. संदर्भ या क्यू के साथ या तो सामना करना पड़ा जब संदर्भ / श्रवण क्यू और footshock का एक भी बाँधना के बाद, चूहों लंबे समय से स्थायी ठंड दिखा रहे हैं. इस परीक्षण में, ठंड व्यवहार डर स्मृति के एक सूचकांक के रूप में प्रयोग किया जाता है. औषधीय और घाव पढ़ाई स्मृति गठन, समेकन, और पुनर्प्राप्ति ऐसे प्रमस्तिष्कखंड, हिप्पोकैम्पस, और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स 3,33-35 के रूप में कई मस्तिष्क क्षेत्रों, द्वारा विनियमित रहे हैं कि पता चला है. इसके अलावा, आणविक आनुवंशिकी के अध्ययन के विशिष्ट जीन और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों 36 का उपयोग करते हुए इन क्षेत्रों के मस्तिष्क में सीखने और स्मृति में शामिल अणुओं की भूमिका का प्रदर्शन किया है. इसलिए, इस परीक्षण simpl हैई और neurobiological आधार अंतर्निहित डर सीखने और स्मृति की खोज के लिए उपयोगी. इस फिल्म के एक लेख में, हम समझते हैं और आसानी से परीक्षण करने के लिए विस्तृत जानकारी के साथ प्रयोगकर्ताओं प्रदान करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की शुरुआत की.

बर्फ़ीली व्यवहार मानव प्रयोगकर्ताओं द्वारा प्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया गया था. एक अच्छी तरह प्रशिक्षित प्रयोगकर्ता टिप्पणियों भर में विश्वसनीय, स्थिर परिणामों का उत्पादन होने की उम्मीद है. हालांकि, इस पद्धति ऐसी अवलोकन पद्धति में मतभेद, पर्यवेक्षक पूर्वाग्रहों, और सरल मात्रा का ठहराव गलतियों के रूप में संभावित समस्याओं, यह मुश्किल सीधे स्वतंत्र प्रयोगकर्ताओं और विभिन्न प्रयोगशालाओं से परिणामों की तुलना करने के लिए बनाने शामिल है. एक स्वचालित photobeam आधारित कंप्यूटर सिस्टम माप भी 26,30-32 इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस प्रणाली को भी ठंड व्यवहार को मापने में संभावित समस्याओं को प्रस्तुत. क्योंकि सेंसर व्यवस्था की, इस प्रणाली typica होगा कि छोटे सिर आंदोलनों का पता लगाने में असमर्थ हो सकता हैlly मानव अवलोकन के माध्यम से 'सक्रिय' के रूप में बने रहना. इसके अलावा, ठंड के दौरान कांप एक पशु जमा देता है, photobeam में रुक - रुक कर रुकावट कांप का एक परिणाम के रूप में मनाया जाता है क्योंकि जब nonfreezing के रूप में माना जा सकता है. एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, स्वचालित छवि और वीडियो का विश्लेषण प्रणालियों 17-20,37,38 विकसित किया गया है. Anagnostaras एट अल. 37 अच्छा वैधता है और अच्छी तरह से 17,20,37-38 ठंड स्कोर कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ कुछ प्रणालियों का वर्णन किया. हालांकि, इन प्रणालियों और विश्लेषण कार्यक्रमों की सबसे वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा करने के लिए है और आमतौर पर महंगी हैं. हम ठंड व्यवहार के विश्लेषण के लिए ImageFZ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित की है, और इस कार्यक्रम के लिए एक मुफ्त सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के रूप में वितरित किया जाता है. ImageFZ पिक्सल के एक शरीर (एक कण) के रूप में माउस का पता लगाता है और राशि के आधार पर 'ठंड' या 'गैर ठंड' के रूप में सूक्ष्म माउस आंदोलन भेदभावलगातार छवियों के प्रत्येक जोड़ी के कणों के बीच nonoverlapping क्षेत्रों के क्षेत्र. प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, ImageFZ प्रोग्राम का उपयोग माप के साथ संगत या अन्य तरीकों का उपयोग कर प्राप्त की तुलना में ज्यादा सटीक हैं. इस प्रकार, ImageFZ प्रोग्राम स्वचालित रूप से मानव पर्यवेक्षकों परिभाषित मापदंड का उपयोग ठंड के रूप में न्यायाधीश कि व्यवहार के उपाय. इसके अलावा, ImageFZ कार्यक्रम दूरी पहले के दौरान (सेमी) की यात्रा की, और footshock प्रदर्शन के बाद, ठंड व्यवहार का झटका संवेदनशीलता और विश्लेषण के एक आकलन की सुविधा की गणना करता है.

Methodological मतभेद प्रयोगशालाओं के बीच मौजूद हैं. इन मतभेदों प्रयोगशालाओं के बीच डेटा की तुलना में कठिनाई में और विभिन्न प्रयोगशालाओं में परिणाम नकल करने में हो सकता है. अधिक स्थिर और तुलनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, यह परीक्षण प्रोटोकॉल जितना संभव मानकीकृत करने के लिए आवश्यक है. ImageFZ साथ विश्लेषण प्रणाली में योगदान कर सकते हैं, जो परीक्षण प्रक्रियाओं के स्वचालन की ओर जाता हैप्रोटोकॉल के मानकीकरण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया.

ठंड व्यवहार का विश्लेषण करते समय कई व्यवहार प्रतिक्रियाओं पर विचार किया जाना चाहिए. जानवरों के एक भयभीत स्थिति का सामना सबसे पहले, जब वे बजाय 39 ठंड का पलायन हो सकता है. भागने डर प्रतिक्रियाओं में से एक है, और इसकी घटना डर ​​स्मृति underestimating को बढ़ावा मिलेगा. दूसरा, ठंड एक सामान्य गतिविधि के स्तर पर निर्भर हो सकता है, और प्रयोगात्मक और नियंत्रण चूहों में गतिविधि के स्तर की जांच की जाने की जरूरत है. एम 1 मुस्कारिनिक acetylcholine रिसेप्टर कमी चूहों जंगली प्रकार चूहों की तुलना में ठंड के कम स्तर से पता चला हालांकि उदाहरण के लिए, विभिन्न व्यवहार परीक्षण के परिणाम के बजाय उनकी स्मृति हानि 18 की उनकी सक्रियता phenotype के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि संकेत दिया. ImageFZ विषयों द्वारा तय की गई दूरी (सेमी) की गणना करता है. डेटा मतभेद विषयों के बीच सामान्य गतिविधि के स्तर में मौजूद है या नहीं, जांच करने के लिए उपलब्ध हैं. में एक समूह फर्क हैदूरी समस्या का एक संभावित दृष्टिकोण दूरी आधारभूत गतिविधि के रूप में प्रशिक्षण के पहले 2 मिनट के दौरान कूच पर विचार करने के लिए और के दौरान आधारभूत + गतिविधि के दौरान / (गतिविधि (दमन अनुपात = (गतिविधि परीक्षण के दौरान) एक दमन अनुपात का उपयोग करने के लिए है, कूच डर 17,40 के एक माध्यमिक सूचकांक के रूप में परीक्षण)). अंत में, एक बिजली footshock के लिए जेट में परिवर्तन उत्प्रेरण दर्द संवेदनशीलता में एक फर्क है, यदि कोई हो, ठंड व्यवहार में बदलाव हो सकता है. ImageFZ भी दूरी footshock संवेदनशीलता के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (6 सेकंड के लिए) अपने प्रदर्शन के बाद 2 सेकंड के लिए एक 2 सेकंड footshock के एक जोखिम, पहले 2 सेकंड से विस्तार में (सेमी) कूच गणना करता है.

वीडियो विश्लेषण प्रणाली, काले agouti सूरजमुखी मनुष्य, की ठंड व्यवहार को मापने, और भूरे रंग के चूहों को कमजोर करने के लिए विकसित किया गया है. ImageFZ (चित्रा 1 बी देखें) सफेद चूहों की जांच के लिए एक काले रंग की मंजिल ट्रे और काला ग्रिड का उपयोग करता है. काला ग्रिड तकनीक और नवीनता के बने होते हैं सहयोगी लेपित काले रंग के साथ धातुओं संसाधित और आमतौर पर काले चूहों के लिए उपयोग किया जाता है जो noncoated धातु ग्रिड के समान एक विद्युत चालकता है. ImageFZ भी कार्यक्रम मापदंडों का समायोजन के माध्यम से चूहों और अन्य कृन्तकों में ठंड व्यवहार का विश्लेषण करती है. ImageFZ के वर्तमान संस्करण में, विषय के व्यवहार ठंड का विश्लेषण करने के लिए शीर्ष दीवार से एक वीडियो कैमरे का उपयोग कर दर्ज की गई है. ImageFZ छवियों चैम्बर की ओर से कब्जा कर रहे हैं, जहां एक सेट अप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, ImageFZ 4 apparatuses के एक अधिकतम नियंत्रित करता है. इस सुविधा के समय की बचत और प्रत्येक विषय के निष्पादन के समय और व्यवहार पर परीक्षण के क्रम में मतभेद से संभावित प्रभावों को कम करने, शोधकर्ता एक साथ 4 चूहों की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, ImageFZ परीक्षण प्रक्रिया और ठंड व्यवहार का विश्लेषण सरल करता है, और इस कार्यक्रम कम परिश्रम के साथ और व्यवहार प्रयोगों के लिए किसी भी प्रशिक्षण के बिना परीक्षण की सुविधा.

Miyakawa प्रयोगशाला में e_content ">, हम सीखने और स्मृति पर किसी जीन के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए वीडियो विश्लेषण प्रणाली का उपयोग प्रासंगिक और cued डर कंडीशनिंग परीक्षण में अनुवांशिक इंजीनियर चूहों और जंगली प्रकार चूहों पर नियंत्रण के 110 से अधिक उपभेदों का आकलन किया है 41-42 हम 5000 से अधिक चूहों के लिए कच्चे डेटा का एक बड़ा सेट प्राप्त की है प्रकाशित शोध लेख 4-16 के लिए इस्तेमाल किया गया था कि कच्चे डेटा एक सार्वजनिक डेटाबेस (यूआरएल के रूप में 'माउस Phenotype डाटाबेस' में शामिल किए गए हैं.:. HTTP: / / www.mouse-phenotype.org/). वर्तमान फिल्म लेख हमारे प्रयोगात्मक प्रक्रिया के विवरण के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है और परीक्षण की स्थिति की समझ को बढ़ावा देता है.

Disclosures

हम इस प्रकाशन के साथ जुड़े हित का कोई ज्ञात संघर्ष कर रहे हैं और इसके परिणाम प्रभावित हो सकता है कि इस काम के लिए कोई महत्वपूर्ण वित्तीय सहायता की गई है कि इस बात की पुष्टि.

Acknowledgements

यहाँ दिखाए गए डेटा के कुछ मानसिक स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थान में डा. जैकलिन एन करावली की प्रयोगशाला में प्राप्त किया गया है और हम हमारे अखबार में डेटा दिखाने के लिए अनुमति देने के लिए उसे धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी व्यवहार विश्लेषण के लिए ImageFZ कार्यक्रम विकसित करने में उनकी मदद के लिए काज़ुओ नाकानिशी धन्यवाद. इस शोध द्वारा समर्थित किया गया अनुदान सहायता साइंटिफिक रिसर्च (बी) के लिए (21300121), अनुदान सहायता वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नए क्षेत्रों शिक्षा मंत्रालय से (व्यापक मस्तिष्क विज्ञान नेटवर्क), विज्ञान, खेल और संस्कृति जापान के पर , Neuroinformatics जापान केंद्र (NIJC), और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) के शिखर से अनुदान से अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageFZ program Developed by Tsuyoshi Miyakawa This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. 
Conditioning chamber O’Hara & Co., Japan CL-3002L For mouse.
Cued test chamber O’Hara & Co., Japan CLT-3002L For mouse.
Interface O’Hara & Co., Japan CL-1040 The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator O’Hara & Co., Japan SGA-2040 The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter) O’Hara & Co., Japan SG-T
USB video capture device XLR8 USB2IVOSX
Quad image splitter Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan 400AS
Soundproof room O’Hara & Co., Japan CL-4210
Freeze Monitor San Diego Instruments, Inc., CA, USA 16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)

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References

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Comments

2 Comments

  1. Thanks for the article.
    I installed the FZ program for offline analysis but it does not seem to work. I wonder what format of images does the program recognize. Can it analyse a .WMV file or do I have to create a sequence of 8bit images from the .WMV for the program to recognize?
    Varda Lev-Ram

    Reply
    Posted by: Varda L.
    March 10, 2014 - 7:38 PM
  2. Thanks for your comment.
    ImageFZ can not analyze a WMV file but a sequence of 8-bit grayscale images (a multi TIFF). If you want to use the WMV file, you will have to convert it to an uncompressed AVI file (no audio) to import into ImageJ(FZ) and to change to 8-bit grayscale images. The 8-bit images should be "8 (inverting grayscale LUT)" (check the file infomation, Image > Show Info...). If not, select Image > Lookup Tables > Invert LUT, and click Edit > Invert. Finally, add a background image with no mouse to the last images, and save it as a multi TIFF.

    Reply
    Posted by: Hirotaka S.
    March 11, 2014 - 6:58 AM

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