एक Organotypic मस्तिष्क टुकड़ा और कार्सिनोमा कोशिकाओं के 3 डी उपगोल साथ coculture प्रणाली

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Summary

कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ organotypic मस्तिष्क टुकड़ा coculture मस्तिष्क के ऊतकों की कार्सिनोमा सेल आक्रमण की प्रक्रिया के दौरान प्रतिदीप्ति के साथ ही उज्ज्वल क्षेत्र (वीडियो) माइक्रोस्कोपी द्वारा morphological परिवर्तन दृश्यमान करने में सक्षम बनाता है. इस मॉडल प्रणाली भी सेल विनिमय और आपूर्ति के दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है और जोड़तोड़ और विश्लेषण की एक विस्तृत विविधता प्रदान करता है.

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Chuang, H. N., Lohaus, R., Hanisch, U. K., Binder, C., Dehghani, F., Pukrop, T. Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (80), e50881, doi:10.3791/50881 (2013).

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Abstract

कार्सिनोमा के मस्तिष्क मेटास्टेसिस के साथ मरीजों को एक गरीब पूर्वानुमान है. हालांकि, metastatic साइट पर प्रक्रिया मुश्किल से विशेष रूप से, निवासी (stromal सेल) की भूमिका की जांच की जा चुकी है. प्राथमिक कार्सिनोमा में अध्ययन भी रोग का निदान 1,2 पर, मेटास्टेसिस पर microenvironment के प्रभाव का प्रदर्शन. विशेष रूप से ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) का समर्थन प्रवास, आक्रमण और प्रसार 3. दिलचस्प है, मेटास्टेसिस का प्रमुख लक्ष्य साइटों ऐसे सीएनएस में जिगर या microglia में Kupffer कोशिकाओं के रूप में ऊतक विशेष मैक्रोफेज, अधिकारी. इसके अलावा, metastatic साइटों को भी astrocytes की तरह अन्य ऊतक विशेष कोशिकाओं, अधिकारी. हाल ही में, astrocytes प्रसार और कैंसर कोशिकाओं 4,5 के हठ को बढ़ावा के लिए प्रदर्शन किया गया. इसलिए, इन ऊतक विशेष प्रकार की कोशिकाओं के कार्यों मस्तिष्क मेटास्टेसिस 6,7 की प्रक्रिया में बहुत महत्वपूर्ण होने लगते हैं.

इन टिप्पणियों के बावजूद,हालांकि, अब तक सीधे उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेष रूप से मस्तिष्क मेटास्टेसिस गठन के दौरान glial प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए उपलब्ध विवो / इन विट्रो मॉडल में कोई उपयुक्त है. कार्सिनोमा कोशिकाओं के vivo रहते इमेजिंग में हाल के उनके मस्तिष्क बसाना व्यवहार 8 का प्रदर्शन किया. हालांकि, इस पद्धति बहुत, श्रमसाध्य महंगा है और तकनीकी रूप से जटिल है. इसके अलावा, पशु प्रयोगों के इन प्रकार के छोटे श्रृंखला के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं और एक बड़ा (ग्लास प्लेट के आरोपण से, ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन, दोहराव संज्ञाहरण और लंबी अवधि के निर्धारण) जानवरों के लिए तनाव के साथ आते हैं. निवासी कोशिकाओं के साथ बातचीत अभी तक सचित्र नहीं किया गया है, जबकि इसके अलावा, vivo इमेजिंग में इस प्रकार अब तक, कार्सिनोमा कोशिकाओं के दृश्य तक सीमित है. अंत में, असुरक्षित जानवरों के भीतर मानव कार्सिनोमा कोशिकाओं की जांच 8 असंभव हैं.

इन कारणों के लिए, हम एक coculture प्रणाली consi स्थापितMatrigel (3 डी सेल क्षेत्र) में एम्बेडेड एक organotypic माउस मस्तिष्क टुकड़ा और उपकला कोशिकाओं के डंक. 3 डी कार्सिनोमा सेल क्षेत्रों पड़ोसी मस्तिष्क के ऊतकों के आक्रमण की जांच के क्रम में सीधे अगले मस्तिष्क टुकड़ा किनारे करने के लिए रखा गया था. इस प्रतिदीप्ति द्वारा और भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा glial कोशिकाओं और कार्सिनोमा कोशिकाओं के बीच morphological परिवर्तन और बातचीत कल्पना करने के लिए हमें सक्षम बनाता है. Coculture प्रयोग के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों या 3 डी सेल spheroids एकत्र किया जा सकता है और आगे आणविक विश्लेषण (जैसे QRT-पीसीआर, आईएचसी, या immunoblot) के साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच के लिए के लिए इस्तेमाल किया. इस विधि मस्तिष्क स्लाइसें के लिए हानिकारक प्रभाव के बिना दिनों के लिए रहने वाले एक मस्तिष्क ऊतक के भीतर की घटनाओं पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है. मॉडल भी चयनात्मक दमन और किसी दिए गए जीनोटाइप के विशिष्ट प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक दाता ऊतक से कोशिकाओं द्वारा निवासी कोशिकाओं के प्रतिस्थापन की अनुमति देता है. अंत में, coculture मॉडल एक साध्य विकल्प हैलक्षित औषधीय जोड़तोड़ जब परीक्षण में विवो के दृष्टिकोण.

Protocol

इस नए मॉडल एक पहले प्रकाशित organotypic हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा दृष्टिकोण 9-12 का रूपांतरण है. संशोधन और परिवर्धन कैंसर सेल मस्तिष्क के ऊतकों बातचीत करने के लिए अनुकूलन और reproducibility गारंटी करने के लिए शुरू किए गए थे. अध्ययन की समीक्षा की और स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. पशु विश्वविद्यालय के मेडिसिन गौटिंगेन में जानवरों की देखभाल के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार ध्यान से इलाज किया गया. organotypic मस्तिष्क टुकड़ा coculture दो चरणों में विभाजित किया जा सकता है. एक कदम organotypic मस्तिष्क टुकड़ा की तैयारी है. दो कदम coculture मॉडल में ट्यूमर कोशिका तैयार करने और बयान शामिल हैं.

1. Organotypic मस्तिष्क टुकड़ा

  1. 0.2 मिमी glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और ग्लूकोज की 4.5 मिलीग्राम / एमएल के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य), से मिलकर विच्छेदन मध्यम तैयार.
  2. प्रसव के बाद दिन के बीच किसी भी माउस तनाव से चूहों सिर काटनाछह और आठ (P6-8).
  3. सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत खोपड़ी से तेजी से मस्तिष्क निकालें और ठंडा विच्छेदन मध्यम को हस्तांतरण.
  4. पूरे मस्तिष्क अनुभाग से ललाट पोल और सेरिबैलम निकालें.
  5. फिक्स और क्रायो गोंद और 5% agarose के साथ एक मंच पर मस्तिष्क को स्थिर.
  6. एक vibratome का उपयोग करके एक 350 माइक्रोन मोटाई को क्षैतिज मस्तिष्क वर्गों स्लाइस.
  7. प्रजातियों और उम्र पर निर्भर करता है, एक माउस मस्तिष्क से 4-6 पूरे मस्तिष्क स्लाइसें लीजिए.
  8. 50% सदस्य से मिलकर संस्कृति के माध्यम तैयार, 25% हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS), 25% सामान्य घोड़े सीरम (एनएचएस), 0.2 मिमी glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (सिग्मा, म्यूनिख, जर्मनी), और 4.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर ग्लूकोज.
  9. कम अच्छी तरह से खेती माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली में एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट transwell झिल्ली डालने पर प्रत्येक organotypic मस्तिष्क टुकड़ा रखो.
  10. एक humidifie में संस्कृति organotypic मस्तिष्क स्लाइस रातोंरात37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ डी वातावरण.

2. स्लाइस coculture मॉडल

  1. GFP ट्रांसफ़ेक्ट ट्यूमर या अन्य कोशिकाओं को 15% RPMI मध्यम और 85% ईसीएम जेल से मिलकर 20 μl मैट्रिक्स जेल में (जैसे MCF 7-GFP कोशिकाओं) का 10 5 शामिल करें.
  2. Organotypic मस्तिष्क टुकड़ा के cortical क्षेत्र के लिए सीधे सटे एक बाँझ धातु स्पेसर (3.8 मिमी व्यास) में MCF 7 मैट्रिक्स जेल मिश्रण रखें और 2 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. स्पेसर निकालें और 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति 24-96 घंटे के लिए organotypic टुकड़ा के साथ coculture के लिए अनुमति देते हैं.
  4. हर दूसरे दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें.

3. Organotypic मस्तिष्क टुकड़ा coculture में astrocytes और microglial की immunofluorescence धुंधला

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के साथ organotypic मस्तिष्क टुकड़ा coculture फिक्स
  2. 5 मिनट के लिए (0.5% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) PBST के साथ टुकड़ा coculture धो लें.
  3. ब्लॉक1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर PBST में सामान्य बकरी सीरम (1:20) के साथ amples.
  4. बकरी विरोधी माउस TRITC (PBST में 1:100) धुंधला द्वारा पीछा 4 डिग्री सेल्सियस पर 36 घंटे के लिए विरोधी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (GFAP, PBST में 1:200) के साथ मस्तिष्क टुकड़ा coculture incubating द्वारा astrocytes दाग कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए.
  5. 5 मिनट के लिए PBST तीन बार के साथ नमूने धो लें.
  6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (PBST में 1:100) ILB 4-एलेक्सा Fluor 647 के साथ microglial कोशिकाओं दाग.
  7. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए DAPI के साथ मस्तिष्क टुकड़ा coculture (1:1,000) counterstain.
  8. माउंट और DAKO फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम के साथ मस्तिष्क टुकड़ा coculture coverslip.
  9. निम्नलिखित स्कोरिंग प्रणाली पर आधारित ट्यूमर आक्रमण के ग्रेड का मूल्यांकन: + + = 1/3 - 2/3;; + <1/3 कोशिकाओं के 0 = कोई आक्रमण कोशिकाओं के + + + ≥ 2/3 (पहले ट्यूमर प्लग और टुकड़ा के बीच संपर्क अनुभाग की लंबाई मापने, तो fractio उपाय) पर हमले की कोशिकाओं द्वारा detectable संपर्क के एन.

4. Glial और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत का लाइव इमेजिंग

  1. एक Leica अंतर्गत प्रयोग 10x बढ़ाई लेंस और एक Leica डीएफसी 350 FX सीसीडी कैमरे में डीएमआई 6000B माइक्रोस्कोप उलटा.

Representative Results

सबसे पहले सभी का इस्तेमाल किया कार्सिनोमा कोशिकाओं (मानव: MCF 7 और murine: 410.4) organotypic माउस मस्तिष्क टुकड़ा पर आक्रमण किया. आक्रमण एक प्रजाति स्वतंत्र ढंग से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला जो इंगित करता है, इसलिए प्रजाति स्वतंत्र (चित्रा 1 ए) था. इसके अतिरिक्त, microglia के साथ ही पहले से vivo में और मरीज ​​के नमूनों 13 में वर्णित के रूप में इंटरफेस में संचित astrocytes. समय की एक विस्तारित अवधि के समय चूक इमेजिंग टुकड़ा की व्यवहार्यता का पता चला, लेकिन यह भी सेलुलर मुलाकातों का निरीक्षण करने के लिए एक अच्छा मंच की पेशकश की ही नहीं. समय चूक प्रयोगों द्वारा, microglial कोशिकाओं बारी में, कैंसर कोशिकाओं को भी मस्तिष्क टुकड़ा (आंकड़े 1B1-B2) पर हमला, 3 डी सेल क्षेत्र है, जबकि प्रवेश करने के लिए दर्ज किए गए. इसके अलावा, हम पहले इस तरह कार्सिनोमा आक्रमण में सहायता करने के लिए अभी भी एक रहस्यपूर्ण तंत्र द्वारा कार्सिनोमा कोशिकाओं के परिवहन के लिए microglia की क्षमता दिखाई है. Immunofluorescence लेबलिंग तकनीक का उपयोग करना, हमआक्रमण की प्रक्रिया के दौरान इन कोशिकाओं के बीच एक तंग बातचीत का सुझाव मस्तिष्क के ऊतकों में और ट्यूमर सेल प्लग (आंकड़े 1 सी डी) में दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के सह localizations (जैसे microglia और astrocytes), का वर्णन किया. विभिन्न प्रजातियों, जीनोटाइप और दबाव से कोशिकाओं के अध्ययन के लिए आवेदनों की विस्तृत श्रृंखला दिखा - माउस मस्तिष्क स्लाइसें मानव (आंकड़े 1C1-C3) या murine (आंकड़े 1D1-D3) कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ या तो cocultured गया जब तुलनीय परिणाम प्राप्त किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. माउस और मानव कार्सिनोमा कोशिकाओं के एक 3 डी अंडाकार आकृति के साथ मस्तिष्क टुकड़ा coculture मॉडल. एक माउस स्तन कैंसर के साथ organotypic पूरे मस्तिष्क टुकड़ा cocultures में कैंसर सेल आक्रमण की) मात्रासेल लाइन 410.4 या एक मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन MCF 7. डाटा n ≥ 38 के साथ प्रत्येक समूह में मस्तिष्क टुकड़ा में सेल आक्रमण की डिग्री के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन दो समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर (Kruskal वालिस परीक्षण). बी) MCF 7-GFP कोशिकाओं और day2 (बी 1 से प्रतिनिधि छवियों के साथ organotypic पूरे मस्तिष्क टुकड़ा cocultures के समय चूक छवियों) और दिन 5 (बी 2) थे वहाँ था पता चला. सीडी) Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों कार्सिनोमा, astrocytes और microglia के साथियों से पता चला है. डबल astrocytes के धुंधला हो जाना (विरोधी GFAP-TRITC, लाल) और microglia 350 माइक्रोन मोटी organotypic मस्तिष्क टुकड़ा और GFP ट्रांसफ़ेक्ट सेल ट्यूमर प्लग (हरा) के साथ पूरे coculture की (ILB4-एलेक्सा Fluor 647, बैंगनी): 3 डी MCF 7-GFP (C1-C3) और 3 डी 410.4-GFP (डी 1 डी 3). व्हाइट डैश मस्तिष्क टुकड़ा और ट्यूमर आक्रमण सामने की बढ़त देखी गई. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. Microglia, astrocytes एकएन डी ट्यूमर colocalizations (सी 1 और डी 1), astrocytes ट्यूमर colocalizations (सी 2 और डी 2) और टुकड़ा coculture में microglia ट्यूमर colocalizations (सी 3 और डी 3). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें

Discussion

मस्तिष्क मेटास्टेसिस का पिछला ऊतकीय जांच विशेष रूप से astrocytes और microglia 13 के निवासी glial कोशिकाओं का तेजी से और कठोर परिवर्तन, प्रदर्शन किया. कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ इन परिवर्तनों और बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इस उपन्यास coculture प्रणाली अच्छी तरह से अनुकूल है. अन्य अनुसंधान क्षेत्रों में पहले से ही organotypic हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क के स्लाइस के साथ लंबे समय से चली आ रही अनुभव है. एक लाभ यह organotypic हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाने, सप्ताह के लिए व्यवहार्य और प्रभावी ढंग से दिन के लिए संरक्षित कर रहे हैं. 1991 में organotypic hippocampal टुकड़ा प्रणाली की Stoppini की शुरूआत के बाद से, यह व्यापक रूप से अपक्षयी रोगों के अनुसंधान में, उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, यह नया coculture प्रणाली ट्यूमर जीव विज्ञान 9,11 में आवेदनों की एक सीमा के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण के लिए एक संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है. संशोधन ट्यूमर आक्रमण वायुसेना के ग्रेड का मूल्यांकन करने के लिए हमें एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल की पेशकश कीइंटरफ़ेस विधि से उगाया terwards और संस्कृतियों आदर्श एक तीन आयामी संरचना की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं. कई तकनीकों अन्य कोशिकाओं के साथ organotypic hippocampal स्लाइस coculture के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं और organotypic मस्तिष्क टुकड़ा 14 के बीच एक अप्रत्यक्ष प्रणाली, और हिप्पोकैम्पस क्षेत्र 15 से दो अलग स्लाइस का एक सीधा coculture शामिल हैं. Glioma समुच्चय भी मस्तिष्क के स्लाइस के साथ 16 cocultured किया गया है. इन मॉडलों मस्तिष्क स्लाइसें में सेलुलर और आणविक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं, microglia और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के बीच सीधी, शारीरिक संपर्क की अनुमति नहीं है. इसके अलावा, इस विधि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न परिधीय monocytes / मैक्रोफेज के प्रदूषण के बिना microglia के अवलोकन की अनुमति देता है. CCR2 और CX3CR1 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग होने के कारण यह monocytes पर हमले से निवासी microglia अंतर करना मुश्किल है कि इस तथ्य को एक महत्वपूर्ण सुधार हैउनके समान गुणों 17,18,19 पर आधारित है. कार्सिनोमा कोशिकाओं के intracerebral इंजेक्शन ट्यूमर प्रगति की जांच की अनुमति देता है, यह घिरे बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह मस्तिष्क निवासी microglia आबादी से या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न परिधीय monocytes / मैक्रोफेज 17 से ही शुरू करने के लिए के रूप में ज्यादा नहीं बता सकता. Kettenmann की टीम एक micromanipulator 20 के साथ मस्तिष्क स्लाइस में glioma कोशिकाओं inoculating है कि इसमें शामिल एक organotypic मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल पेश किया. हालांकि, प्राथमिक घातक gliomas metastatic कार्सिनोमा से कई संबंध में मतभेद है. सबसे पहले, घातक gliomas mesenchymal मूल के हैं, ट्यूमर और मस्तिष्क के ऊतकों के बीच कोई सीमा के साथ के रूप में एकल कोशिकाओं पर आक्रमण / तंत्रिका तंत्र के बाहर metastasize, और विस्थापित नहीं है. इसके विपरीत, infiltrative वृद्धि एक ठेठ रोग विशेषता है, और इस तरह के कार्सिनोमा आमतौर पर विस्थापित / साथियों के रूप में चढ़ाई. कोशिकाओं glial दूसरा, जबकि कार्सिनोमा अक्सर, मस्तिष्क में उपकला संरचनाओं के पुनर्निर्माण की कोशिशएक (छद्म) कैप्सूल से मस्तिष्क के ऊतकों से ट्यूमर को अलग करने का प्रयास करें. जैविक और रूपात्मक सुविधाओं पर विचार, घातक glioma और कार्सिनोमा की मेटास्टेसिस वास्तव में तुलना नहीं कर रहे. इन कारणों के लिए, हम संशोधित और हम मस्तिष्क टुकड़ा से सटे एक कार्सिनोमा सेल प्लग इंजेक्षन लेकिन coculture नहीं है जहां एक coculture प्रणाली विकसित की है. इसके अलावा, हम microglia ट्यूमर प्लग भरिये और आसानी से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा बाद में पुष्टि की कि हो सकता है, जिसका अर्थ है microglial और ट्यूमर प्लग की सीमा पर astrocytic संचय मनाया. कैंसर की कोशिकाओं को विवो स्थिति में असली के लिए और BAUMERT और मस्तिष्क 21 metastases के साथ शव परीक्षण मामलों के 63% में एक घुसपैठ क्षेत्र में पाया गया है जो उनके सहयोगियों द्वारा किए गए एक अवलोकन करने के लिए तुलनीय है जो मस्तिष्क टुकड़ा, में आक्रमण.

क्योंकि लापता रक्त छिड़काव की इस संस्कृति में ही निवासी मैक्रोफेज / microglia कर रहे हैं. इसके अलावा, क्योंकि के मीटरissing टी कोशिकाओं और, इसलिए, अनुपस्थित allo जेट, मानव कार्सिनोमा कोशिकाओं भी असुरक्षित चूहे या चूहों के मस्तिष्क स्लाइसें (NMRI, बी -6, या Wistar) के साथ coculture के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस नग्न माउस मॉडल के लिए एक विकल्प के रूप में काम आ सकते हैं. 4-5 स्लाइस प्रत्येक माउस से प्राप्त किया जा सकता है, जानवरों की काफी कम संख्या मौजूदा इंजेक्शन मॉडलों की तुलना में, आवश्यक हैं. इसके अलावा, पशुओं metastatic रोग की एक लंबी अवधि के लिए पीड़ित नहीं है और वे repetitively 22 ऑपरेटिव प्रक्रियाओं से गुजरना नहीं है.

इस coculture प्रणाली के साथ, हम कैंसर कोशिकाओं द्वारा microglia की सक्रियता और कैंसर सेल आक्रमण को बढ़ावा देने की क्षमता का प्रदर्शन किया है. साथ ही, यह हमारे ज्ञान करने के लिए, microglia सक्रिय रूप कार्सिनोमा कोशिकाओं 23 परिवहन के लिए पाया गया है, पहली बार है.

इन सभी लाभों के बावजूद coculture प्रणाली, वास्तव में, यह भी सीमाएं हैं. यह अभी भी एक में इन विट्रो हैपूर्व उपनिवेश की स्थापना के लिए मेटास्टेसिस के इस कदम लापता मॉडल. क्योंकि छिड़काव की कमी की वजह से, यह परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है. इस प्रकार, परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक रास्ता रक्त मस्तिष्क बाधा 22,24 की नकल करने में विवो इंजेक्शन मॉडल या संशोधित Boyden कक्ष प्रणाली बाह्य मैट्रिक्स के साथ, HUVEC और astrocytes या तो उपयोग करने के लिए है. मस्तिष्क टुकड़ा coculture विधि अभी तक कई फायदे के साथ एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल और ऐसे उपनिवेशवाद का विश्लेषण के रूप में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए एक संभावित है निवासी सेल की भूमिका पर ध्यान देने के साथ विशेष रूप से. (जैसे immunohistochemistry, confocal माइक्रोस्कोपी और समय चूक माइक्रोस्कोपी के रूप में) अन्य स्थापित तकनीकों के साथ संयोजन प्रत्यक्ष सेल करने वाली सेल बातचीत की जांच का समर्थन करता है. यह एक आसान विकल्प और अन्य तकनीकों के पूरक है और metastatic microenvironment द्वारा लगाया रूप cues और प्रभाव की जांच करने के लिए प्रदान करता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखकों ने अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता, confocal और समय चूक माइक्रोस्कोपी के बारे में उनकी तकनीकी सलाह के लिए एंड्रियास Wodarz और स्टीफ़न Heermann के लिए Chalid Ghadban धन्यवाद. लेखकों में से किसी के लिए हितों का कोई विवाद नहीं है. इस काम Dres द्वारा, Forschergruppe 942 की परियोजना 2 (FOR942 द्विपक्षीय 703/3-1) में जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा वित्त पोषित है. बायर-Stiftung (बाडेन Württembergischer Krebspreis, जर्मनी) और मेडिसिन के संकाय, Georg-August-विश्वविद्यालय गौटिंगेन, जर्मनी की रिसर्च प्रोग्राम द्वारा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Darmstadt,Germany 24020
Minimum essential medium (MEM) Gibco, Darmstadt , Germany 32360
RPMI-1640 PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany E15-840
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Pan Biotech, Aidenbach, Germany P04-36500
Normal horse serum (NHS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 16050-122
Fetal calf serum (FCS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 10091148
Glucose B. Braum, Melsungen, Germany
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution Sigma, Steinheim, Germany G1146
Vibratome Leica, Wetzlar, Germany Leica VT1200S
Microtome Leica, Wetzlar, Germany Leica SM 2000R
Polycarbonate membrane BD Falcon, Heidelberg,Germany 353090 transwell membrane insert (0.4 μm pore size)
ECM gel Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany 3432-005-01 Basement membrane extract
Metallic spacer Kig GmbG, Kirkel, Germany DIN 433
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany LSM 510
Time-lapse microscope and camera Leica, Wetzlar, Germany DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera
Anatomy microscope Zeiss, Göttingen, Germany Stemi SV11
Paraformaldehyde Merck, Darmstadt, Germany 1.04005.1000
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody Sigma, Steinheim, Germany G3893
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2- TRITC Santa Cruz, Heidelberg, Germany SC3796
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen, Karlsruhe, Germany 132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) Sigma, Steinheim, Germany D8417
Fluorescent mounting medium DAKO, Glostrup, Denmark S3023

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References

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