Coculture System med en Organotypic Brain Slice og 3D Spheroid av karcinomceller

1Department of Hematology and Oncology, University of Göttingen, 2Institute of Neuropathology, University of Göttingen, 3Institute of Anatomy and Cellbiology, University of Halle
* These authors contributed equally
Published 10/09/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

Den organotypic hjernen skive coculture med karcinomceller muliggjør visualisere morfologiske endringer ved fluorescens samt lyse felt (video) mikros under prosessen med carcinoma celle invasjon av hjernevev. Denne modellen systemet gir også mulighet for celle utveksling og påfyll tilnærminger, og tilbyr et bredt utvalg av manipulasjoner og analyser.

Cite this Article

Copy Citation

Chuang, H. N., Lohaus, R., Hanisch, U. K., Binder, C., Dehghani, F., Pukrop, T. Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (80), e50881, doi:10.3791/50881 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pasienter med cerebral metastasering av Kreftsvulster har en dårlig prognose. Imidlertid har prosessen ved metastatisk nettstedet knapt blitt undersøkt, særlig rollen som bosatt (stromal) celler. Studier i primær karsinomer viser innflytelsen av mikromiljøet på metastasering, selv om prognose 1,2. Spesielt tumorassosierte makrofager (TAM) støtte migrasjon, invasjon og spredning tre. Interessant nok har de store målområder av metastase har vevs-spesifikke makrofager, som Kupffer-celler i leveren eller mikroglia i sentralnervesystemet. Videre er de metastaser besitter også andre vevs-spesifikke celler, slik som astrocytter. Nylig, astrocytter ble demonstrert for å fremme spredning og persistens av kreftceller 4,5. Derfor er funksjoner av disse vev-spesifikke celletyper synes å være meget viktig i prosessen med hjernemetastaser 6,7.

Til tross for disse observasjonene,Men til nå er det ikke egnet in vivo / in vitro-modell er tilgjengelig for direkte visual glial reaksjoner under cerebral metastasedannelsen, spesielt ved sterkt felt mikroskopi. Nyere in vivo direkte avbildning av karcinomceller vist sin cerebral kolonisering atferd åtte. Imidlertid er denne metoden meget arbeidskrevende, kostbart og teknisk komplisert. I tillegg er slike dyreforsøk begrenset til små serier, og er utstyrt med en betydelig stress for dyrene (ved implantering av glassplaten, injeksjon av tumorceller, repeterende anestesi og langvarig fiksering). Videre er in vivo avbildning hittil begrenset til visualiseringen av karcinomceller, mens interaksjoner med hørende celler ikke har blitt vist på figuren. Til slutt, undersøkelser av menneskelige karcinomceller innenfor immunkompetente dyr er umulig åtte.

For disse grunner, etablerte vi en coculture system consisvi av en organotypic mus hjernen skive og epitelceller innebygd i matrigel (3D celle sfære). 3D-karsinom celle sfærer ble plassert rett ved siden av hjernen skive kanten for å undersøke invasjonen av nabo hjernevev. Dette gjør oss i stand til å visualisere morfologiske endringer og interaksjoner mellom gliacellene og karcinomceller av fluorescens og selv med lyse felt mikroskopi. Etter coculture forsøket, kan i hjernevevet eller 3D-celle sfæroider samles og brukes for videre molekylære analyser (f.eks QRT-PCR, IHC, eller Immunoblotanalyse), så vel som for undersøkelser av konfokal mikroskopi. Denne metoden kan anvendes til å overvåke hendelser innen et levende hjernevev for dager uten skadelige effekter på hjernen skiver. Modellen gjør det også mulig selektiv undertrykkelse og utskifting av hørende celler av celler fra en donor-vev for å bestemme den distinkte virkningen av en bestemt genotype. Endelig er coculture modellen et praktisk alternativtil in vivo tilnærminger når testing målrettede farmakologiske manipulasjoner.

Protocol

Denne nye modellen er en tilpasning av en tidligere utgitt organotypic hippocampus hjernen skive tilnærming 9-12. Modifikasjoner og tillegg ble innført for å optimalisere kreftcelle-hjernevev interaksjoner og å garantere reproduserbarhet. Studien ble gjennomgått og godkjent av den lokale etikkutvalg. Dyrene ble behandlet nøye i henhold til retningslinjene for dyr omsorg ved Universitetet Medicine Göttingen. Den organotypic hjernen skive coculture kan deles inn i to trinn. Trinn en er utarbeidelsen av organotypic hjernen skive. Trinn to omfatter tumorcelleblandingen og deponering i coculture modellen.

En. Organotypic Brain Slice

  1. Klargjør disseksjon medium bestående av minimum essensielt medium (MEM), supplert med 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, og 4,5 mg / ml glukose.
  2. Halshogge musene fra alle mus belastning mellom postnatal dagseks og åtte (P6-8).
  3. Fjern hjernen raskt fra skallen under aseptiske forhold, og overføre den til iskald disseksjon medium.
  4. Fjern frontal pol og lillehjernen fra hele hjernen delen.
  5. Fest og stabilisere hjernen på en scene med cryo lim og 5% agarose.
  6. Skjær hjerne seksjonene horisontalt til en 350 mikrometer tykkelse ved hjelp av en vibratome.
  7. Samle 4-6 hele hjernen skiver fra en enkelt mus hjernen, avhengig av art og alder.
  8. Klargjør kulturmedium som består av 50% MEM, 25% Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS), 25% normalt hesteserum (NHS), 0,2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin (Sigma, Munchen, Tyskland), og 4,5 mg / ml glukose.
  9. Sett hver organotypic hjernen skive på en 0,4 mikrometer polykarbonat Transwell membran innsats i en seks-brønns plate med en ml av dyrking medium i nedre godt.
  10. Kultur organotypic hjernen skiver overnatter i en humidified atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C inkubator.

2. The Slice coculture Model

  1. Legge 10 5 av GFP-transfektert tumor eller andre celler (f.eks MCF-7-GFP-celler) i 20 pl gel-matrise, som består av 15% RPMI medium og 85% ECM gel.
  2. Plasser MCF-7-gelmatrise blanding i en steril metallisk avstandsstykke (3,8 mm diameter) i direkte tilknytning til det kortikale region av organotypic hjernen skive og inkuber i 2 timer.
  3. Fjern avstandsstykket og la 3D svulst spheroid å coculture med organotypic skive for 24-96 hr.
  4. Endre kulturen medium annenhver dag.

Tre. Immunfluorescens Farging av astrocytes og microglial i Organotypic Brain Slice coculture

  1. Fest organotypic hjernen skive coculture med 4% paraformaldehyde for åtte timer ved 4 ° C.
  2. Vask skiven coculture med PBST (PBS med 0,5% Triton X-100) i 5 min.
  3. Blokker spler med normal geiteserum i PBST (1:20) ved værelsestemperatur i 1 time.
  4. Beise astrocytter ved inkubering av hjernen skive coculture med anti-glial fibrillary surt protein monoklonalt antistoff (GFAP, 1:200 i PBST) i 36 timer ved 4 ° C, etterfulgt av geit-anti-mus-TRITC (1:100 i PBST) farging i 1 time ved romtemperatur.
  5. Vask prøvene med PBST tre ganger i 5 min.
  6. Beise mikrogliale celler med ILB 4-Fluor Alexa 647 (1:100 i PBST) i 1 time ved romtemperatur.
  7. Counterstain hjernen skive coculture med DAPI (1:1.000) i 3 min ved romtemperatur.
  8. Mount og dekk hjernen skive coculture med DAKO fluorescerende monteringsmedium.
  9. Vurdere grad av tumor invasjon basert på følgende poengsystem: 0 = ingen av cellene; + <1/3; + + = 1/3 - 2/3, + + + ≥ 2/3 av de invaderte celler (første måle lengden av kontaktpartiet mellom tumor pluggen og skive, og deretter måle fraction kontakt påvises ved de invaderende celler).

4. Levende Imaging av samspillet mellom Glial og kreftceller

  1. Utfør eksperimentet under en Leica invertert DMI 6000B mikroskop på 10X forstørrelse linse og en Leica DFC 350 FX CCD-kamera.

Representative Results

Først, alle brukte karcinomceller (human: MCF-7 og murine: 410,4) invaderte organotypic mus hjernen skive. Invasjonen var derfor arts uavhengige (figur 1A), noe som indikerer et bredt spekter av applikasjoner i en art-uavhengig måte. I tillegg microglia samt astrocytter akkumulert i grenseflaten som tidligere beskrevet in vivo og i pasientprøver 13. Time-lapse bildebehandling over en lengre periode ikke bare avdekket levedyktighet av stykket, men også tilbudt en god plattform for å observere de cellulære interaksjoner. Ved time-lapse forsøkene ble mikrogliale celler registreres for å angi 3D celle sfære mens, i sin tur, har kreftceller også invaderte hjernen skive (figurene 1B1-B2). Videre har vi tidligere har vist evne til å transportere microglia karsinom celler ved en fortsatt enigmamekanisme for derved å hjelpe til med carcinoma invasjon. Ved hjelp av immunfluorescens merking teknikker, vibeskrevne ko-lokaliseringer av tumorceller og stromale celler (f.eks microglia og astrocytes), både i hjernevev og i det tumorcelleplugg (figurene 1C-D), noe som tyder på en tett samvirke mellom disse celler i løpet av invasjonsprosessen. Sammenlignbare resultater ble oppnådd når muse hjernen skiver ble cocultured enten med menneskelig (Tall 1C1-C3) eller murine (Tall 1D1-D3) karcinomceller - viser det brede spekter av applikasjoner for å studere celler fra forskjellige arter, genotyper og belastninger.

Figur 1
Figur 1. Brain skive coculture modell med en 3D spheroid av mus og humane carcinoma celler. A) Kvantifisering av kreft celle invasjon i organotypic hele hjernen slice cocultures med en mus brystkreftcellelinje 410,4, eller et human brystkreft-cellelinje MCF-7. Data representerer prosentandelen av grad av celle invasjonen i hjernen skive i hver gruppe med n ≥ 38. Det var ingen signifikant forskjell mellom disse to gruppene (Kruskal-Wallis test). B) Tid-lapse bilder av organotypic hele hjernen slice cocultures med MCF-7-GFP celler og representative bilder fra Dag2 (B1) og dag 5 (B2) var vist. CD) Konfokalmikroskopi bilder viste årskull av karsinom, astrocytter og microglia. Dobbel farging av astrocytter (anti-GFAP-TRITC, rød) og microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, fiolett) av hele coculture med 350 mikrometer tykt organotypic hjernen skive og GFP-transfektert svulst celle plugg (grønn): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) og 3D-410.4-GFP (D1-D3). Hvite streker viste kanten av hjernen skive og tumor invasjonsfronten. Scale barer representerer 50 mikrometer. Microglia, astrocytter ennd svulster colocalizations (C1 og D1), astrocytes-svulster colocalizations (C2 og D2) og microglia-tumor colocalizations (C3 og D3) i stykket coculture. Klikk her for å se større bilde

Discussion

Tidligere histologiske undersøkelser av cerebral metastase demonstrert raske og drastiske endringer av de fastboende gliacellene, spesielt av astrocytter og microglia 13. Å studere disse endringene og interaksjoner med karcinomceller, er denne romanen coculture systemet velegnet. Andre forskningsfelt som allerede har lang erfaring med organotypic hippocampus hjernen skiver. En fordel er at de organotypic hippocampus hjernen skive kulturer er levedyktig og effektivt bevart i dager til uker, noe som gjør den egnet for langvarige forsøk. Siden Stoppini innføring av den organotypic hippocampal skive system i 1991, har det vært mye brukt, for eksempel i forskning av degenerative sykdommer. Dermed representerer dette innovere coculture systemet en modifikasjon av et veletablert tilnærming med en rekke applikasjoner i tumorbiologi 9,11. Modifikasjonen tilbød oss ​​en reproduserbar modell for å vurdere karakteren av tumor invasjon afterwards og kulturer dyrket ved skjæringsmetoden er ideelt egnet for eksperimenter som krever en tre-dimensjonal struktur. Flere teknikker har blitt brukt til å coculture organotypic hippocampus skiver med andre celler. Disse omfatter et indirekte system mellom makrofager og organotypic hjernen skive 14, og en direkte coculture av to forskjellige stykker fra den hippocampal regionen 15.. Glioma aggregater har også blitt cocultured med hjernen skiver 16. Disse modellene kan brukes til å analysere cellulære og molekylære hendelser hjerneskiver, men tillater ikke direkte, fysiologisk kontakt mellom tumorceller, mikroglia og hjernen parenchyma. Videre gir denne metoden observasjon av microglia uten forurensning av benmarg-avledet perifere monocytter / makrofager. Bruken av CCR2 og CX3CR1 transgen musemodell er en kritisk forbedring på grunn av det faktum at det er vanskelig å skille beboeren microglia fra invaderende monocytterbasert på sine tilsvarende egenskaper 17,18,19. Selv intra injeksjon av karcinomceller tillater etterforsker tumor progresjon, kan det ikke fortelle mye om hvorvidt de omgitt makrofag-lignende celler stammer fra hjernen-resident mikroglia befolkning eller fra benmarg-avledet perifere monocytter / makrofager 17. Teamet av Kettenmann innført en organotypic hjernen skive modell som er involvert inoculating gliomceller i hjernen skiver med en micromanipulator 20. Men primære maligne gliomer skiller seg på mange hilsen fra metastatisk karsinom. Først, ondartet gliom er av mesenchymal opprinnelse, ikke metastasere utenfor nervesystemet, og migrere / invadere som enkle celler uten noen kant mellom tumor-og hjernevev. Som kontrast er infiltrerende vekst en typisk patologisk karakteristisk, og slike karsinomer vanligvis migrere / invadere som kohorter. For det andre karsinomer ofte forsøker å gjenoppbygge epiteliale strukturer i hjernen, samtidig som gliacellerforsøker å skille svulsten fra hjernevevet med et (pseudo) kapsel. Vurderer biologiske og morfologiske egenskaper, malignt gliom og metastasering av karsinomer er egentlig ikke sammenlignbare. For disse grunner, vi endret og utviklet en coculture system hvor vi ikke injisere men coculture en carcinoma cell plugg ved siden av hjernen skive. Videre observerte vi microglial og astrocytic opphopning på grensen av svulsten plugg, noe som betyr at microglia inn svulsten pluggen og kan lett oppdages ved å lyse felt mikroskopi og bekreftet etterpå av konfokalmikroskopi. De kreftceller invadere inn i hjernen skive, noe som er sammenlignbart med den virkelige in vivo situasjon og til en observasjon gjort av Baumert og kolleger, som fant et infiltrasjonssone i 63% av obduksjons tilfeller med hjernemetastaser 21.

På grunn av den manglende blod perfusjon, er det bare hørende makrofager / mikroglia i denne kulturen. Videre, på grunn av de mIssing T-celler, og derfor fraværende allo-reaktivitet, menneskelige karcinomceller kunne brukes til coculture selv med hjernen skiver av immunkompetente mus eller rotter (NMRI, B6, eller Wistar). Dette kan tjene som et alternativ til den naken mus-modellen. Etter 4-5 skiver kan fås fra hver mus, blir betydelig redusert antall dyr er nødvendig, sammenlignet med de eksisterende innsprøytningsmodeller. I tillegg trenger dyrene ikke lide for en lang periode med metastatisk sykdom, og de ​​ikke gjennomgår operative prosedyrer gjentagelser 22.

Med dette coculture system har vi vist at aktivering av mikroglia av kreftceller, og kapasiteten til å fremme kreftcelle invasjon. I tillegg er dette den første gangen, så vidt vi vet, ble mikroglia funnet å aktivt transportere karcinomceller 23.

Til tross for alle disse fordelene, har coculture system, ja, også begrensninger. Det er fortsatt et in vitromodellere mangler trinnene av metastasering før kolonisering. På grunn av den manglende perfusjon, er det ikke mulig å studere ekstravasasjon. Således er den alternative måte å studere ekstravasasjonen å bruke enten in vivo injeksjon modellen eller den modifiserte Boyden kammer system med ekstracellulær matrise, HUVEC og astrocytter å etterligne den blod-hjernebarriere 22,24. Hjernen skive coculture metoden er ennå en pålitelig og reproduserbar modell med mange fordeler og et potensial for en rekke programmer, som for eksempel analyse av kolonisering, særlig med fokus på rollen til de fastboende celler. Kombinasjonen med andre etablerte teknikker (for eksempel immunhistokjemi, konfokalmikroskopi og time-lapse mikroskopi) støtter etterforskningen av direkte celle-til-celle interaksjoner. Det er et enkelt alternativ og complementation av andre teknikker, og tilbyr tilgang til etterforskningen av de signaler og effekter som følger av metastatisk mikromiljøet.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne takker Chalid Ghadban for hans utmerkede teknisk assistanse, Andreas Wodarz og Stephan Heermann for deres tekniske råd om confocal og time-lapse mikroskopi. Det er ingen interessekonflikt for noen av forfatterne. Dette arbeidet er finansiert av den tyske Research Council (DFG) i Project 2 av Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), av Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Tyskland) og ved Research Program for Det medisinske fakultet, Georg-August-universitetet Göttingen, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Darmstadt,Germany 24020
Minimum essential medium (MEM) Gibco, Darmstadt , Germany 32360
RPMI-1640 PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany E15-840
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Pan Biotech, Aidenbach, Germany P04-36500
Normal horse serum (NHS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 16050-122
Fetal calf serum (FCS) Invitrogen, Karlsruhe, Germany 10091148
Glucose B. Braum, Melsungen, Germany
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution Sigma, Steinheim, Germany G1146
Vibratome Leica, Wetzlar, Germany Leica VT1200S
Microtome Leica, Wetzlar, Germany Leica SM 2000R
Polycarbonate membrane BD Falcon, Heidelberg,Germany 353090 transwell membrane insert (0.4 μm pore size)
ECM gel Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany 3432-005-01 Basement membrane extract
Metallic spacer Kig GmbG, Kirkel, Germany DIN 433
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany LSM 510
Time-lapse microscope and camera Leica, Wetzlar, Germany DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera
Anatomy microscope Zeiss, Göttingen, Germany Stemi SV11
Paraformaldehyde Merck, Darmstadt, Germany 1.04005.1000
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody Sigma, Steinheim, Germany G3893
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2- TRITC Santa Cruz, Heidelberg, Germany SC3796
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen, Karlsruhe, Germany 132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) Sigma, Steinheim, Germany D8417
Fluorescent mounting medium DAKO, Glostrup, Denmark S3023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langley, R. R., Fidler, I. J. The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs. Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454, 436-444 (2008).
  4. Fidler, I. J. The role of the organ microenvironment in brain metastasis. Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).
  5. Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells. PloS one. 8, e54752 (2013).
  6. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12, 895-904 (2006).
  7. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).
  8. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
  9. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  10. Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures. Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).
  11. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  12. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).
  13. Lorger, M., Felding-Habermann, B. Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis. Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).
  14. Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage. J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).
  15. Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices. Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).
  16. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).
  17. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. (2011).
  18. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J. Immunol. 188, 29-36 (2012).
  19. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).
  20. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).
  21. Baumert, B. G., et al. A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).
  22. Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. The biology of metastasis to a sanctuary site. Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).
  23. Pukrop, T., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58, 1477-1489 (2010).
  24. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats