Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l'uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

Chemistry
 

Summary

Questo video illustrerà un metodo rapido e efficiente per metacrilato poli (glicole etilenico), consentendo polimerizzazioni a catena e sintesi idrogel. Si dimostrerà come introdurre in modo simile funzionalità metacrilammide in peptidi, dettaglio metodi analitici comuni per valutare l'efficienza funzionalizzazione, fornire suggerimenti per la risoluzione dei problemi e le modifiche avanzate, e dimostrare le tecniche tipiche di caratterizzazione idrogel.

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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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Abstract

Uno dei principali vantaggi di utilizzare poli (etilene glicole) (PEG) macromeri in formazione idrogel è versatilità sintetica. La possibilità di attingere da una grande varietà di pesi molecolari PEG e configurazioni (numero braccio, lunghezza del braccio, e modello di ramificazione) permette ai ricercatori uno stretto controllo sulla conseguente strutture e proprietà, tra cui il modulo di Young e la dimensione delle maglie idrogel. Questo video illustra un metodo rapido, efficace, esente da solventi micro-onde per metacrilato precursori PEG in poli (glicole etilenico) dimetacrilato (PEGDM). Questo metodo sintetico fornisce materiali di partenza tanto necessari per le applicazioni nella somministrazione di farmaci e la medicina rigenerativa. Il metodo illustrato è superiore ai metodi tradizionali methacrylation come è significativamente più veloce e più semplice, oltre che più economico ed ecologico, utilizzando piccole quantità di reagenti e solventi. Ci sarà inoltre dimostrare un adattamento di questa tecnica per methacr on-resinafunzionalizzazione ylamide di peptidi. Questo metodo on-resina permette l'N-terminale dei peptidi da funzionalizzato con gruppi metacrilammide prima deprotezione e clivaggio dalla resina. Questo permette di aggiunta selettiva di gruppi metacrilammide al N-terminale dei peptidi mentre amminoacidi con gruppi reattivi laterali (ad esempio ammine primarie di lisina, alcol primario di serina, alcoli secondari di treonina e tirosina di fenolo) rimangono protetti, impedendo funzionalizzazione in più siti. Questo articolo dettaglio i metodi analitici comuni (spettroscopia protonica Risonanza Magnetica Nucleare (, H-NMR) e Matrix Assisted Laser desorbimento di ionizzazione Time of Flight spettrometria di massa (MALDI-TOF)) per valutare l'efficienza dei funzionalizzazioni. Problemi comuni e suggerito metodi di risoluzione saranno affrontati, come sarà modificazioni della tecnica che può essere utilizzato per ulteriori funzionalità sintonizzare macromero e idrogel risultante fisica e chimicaproprietà. L'uso di prodotti di sintesi per la formazione di idrogeli per la somministrazione di farmaci e studi di interazione cellule-materiale sarà dimostrato, con particolare attenzione a modificare la composizione idrogel ad incidere dimensione di maglia, controllando idrogel rigidità e rilascio del farmaco.

Introduction

Poli (glicole etilenico) (PEG) idrogel sono biomateriali comuni utilizzati nella medicina rigenerativa e drug delivery delle applicazioni 1-3. Questi idrogel offrono vantaggi significativi rispetto ad altri biomateriali. Idrogel PEG sono sintetici, offrendo un elevato grado di controllo sulle proprietà di ingegneria come modulo di elasticità e velocità di degradazione rispetto alle loro controparti biomateriale naturali 1. Come sono sinteticamente derivati, PEG ha significativamente meno variabilità da lotto a lotto contro materiali di derivazione naturale 4. A causa della composizione chimica di PEG, questi idrogel sono altamente idrofili, resistente alla proteina di adsorbimento, e biocompatibile 3. Questa resistenza alla proteina di adsorbimento permette idrogel PEG di agire come una 'tabula rasa', consentendo ai ricercatori di interrogare e studiare specifici fattori biologici o chimici (farmaci, biomolecole, peptidi di adesione cellulare, ecc) e dei ruoli specifici tali factors svolgono nel controllo delle cellule e / o tessuti comportamento.

Figura 1
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Figura 1: Esempi di poli (etilene glicole) (PEG) architetture A) Lineari PEG B) 4-braccio PEG con pentaeritritolo nucleo C) 8-braccio PEG con un nucleo hexaglycerol D) 8-PEG con un braccio.... tripentaerythritol nucleo. n è il numero di PEG ripete su ogni braccio. Ogni ripetizione ha un peso molecolare di 44 g / mol, quindi n può essere calcolato dal peso molecolare globale e la struttura / braccio #.

Precursori PEG sono disponibili con una varietà di architetture e pesi molecolari (Figura 1 ). Variando l'architettura (braccio #) e ripete glicole etilenico (N) di PEG può essere utilizzato per controllare le proprietà di reti idrogel realizzati mediante tali macromeri. Unmodified PEG contiene gruppi ossidrilici terminali che devono essere sostituiti con una funzionalità alternativa per facilitare reticolazione covalente tramite polimerizzazione, la strategia di reticolazione più comunemente impiegati per idrogel PEG, prima della formazione di reti di idrogel. Ci sono una varietà di gruppi chimici che possono essere incorporati in macromeri PEG per facilitare la polimerizzazione e reticolazione rete (acrilato, metacrilato, vinil etere, norbornene, ecc.) Nonostante la varietà di funzionalità di terminale disponibili per facilitare reticolazione, vi sono solo due meccanismi mediante i quali può verificarsi polimerizzazione: passo-e catena-crescita (o una miscela dei due, modalità mista).

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Figura 2:. Teorico. Idrogel rete schema A) Tradizionale catena di crescita per i risultati di polimerizzazione in reti eterogenee contenenti poli denso (metacrilato) reticolazione regioni e l'aumento nonidealities di rete come loop, precursori che non hanno reagito, e coinvolgimenti permanenti B) Fase di crescita per i risultati di polimerizzazione in strutture di rete significativamente più omogenee (non in scala).

Funzionalità che reticolazione tramite polimerizzazione a catena di crescita non richiedono la presenza di un reticolante supplementare. Tuttavia, idrogel catena polimerizzato producono strutture di rete eterogenee contenenti regioni reticolanti dense (Figura 2A) 1. Al contrario, passo la crescita di polimerizzazione requires l'uso di un reticolante o co-monomero che è reattivo con i gruppi funzionali terminali delle macromeri PEG. Mentre i gruppi funzionali terminali del PEG possono reagire solo con il reticolante e il reticolante possono reagire solo con i gruppi funzionali terminali della PEG, questo si traduce in una maggiore omogeneità struttura di rete (Figura 2B) 1. Polimerizzazioni a stadi anche tipicamente portano ad una maggiore conversione di gruppi funzionali, diminuendo la quantità di precursori non reagiti e il potenziale di risposta immunitaria / infiammatoria da solubili, macromeri non registrate 1. Modalità mista metodi di polimerizzazione sono stati sviluppati anche che combinano polimerizzazione passo e catena-crescita attraverso l'uso di macromeri che possono sia auto-reagire (catena-crescita) e reagire con un reticolante (a stadi). Questo produce idrogel con caratteristiche di ogni meccanismo di polimerizzazione, e può essere usato per produrre più complesse, strutture di rete diversi rispetto siastep-o reti catena crescita solo 1.

Mentre ci sono una pletora di gruppi funzionali che possono essere utilizzati per funzionalizzare PEG e facilitare la formazione di idrogel, metacrilati e norborneni sono alcune delle frazioni più comuni di polimerizzazione a catena ed a stadi, rispettivamente. Entrambe queste funzionalità offrono un eccellente controllo spazio-temporale su polimerizzazione rete, e quando viene utilizzato per incapsulare le celle, queste reti di sostegno ad alta capacità di sopravvivenza delle cellule complessivo 5-7. Dimetacrilato funzionalizzati PEG (PEGDM) reticolazione tramite polimerizzazione a catena e permette l'incorporazione di biomolecole o altri fattori attraverso il co-polimerizzazione con acrilato, metacrilato, né parimenti funzionalizzati biomolecole 5,6. Idrogel PEGDM presentano vantaggi significativi rispetto ai sistemi di polimerizzazione a catena di crescita alternativi come acrilato funzionalizzato PEG (PEGDA). Utilizzando i metodi tradizionali, PEGDA può essere sintetizzata più rapidamente di PEGDM; hoWever, utilizzando la sintesi assistita da microonde, sintesi PEGDM è ancora più efficiente. PEGDA è spesso sintetizzato in overnight 8 o 24 hr 9 reazioni, ma può anche essere sintetizzato in quattro ore a temperature elevate 10. PEGDM è anche tradizionalmente sintetizzato facendo reagire overnight 11 o per 24 ore 5, con alcuni metodi estendere il tempo di reazione a 4 giorni 12. Utilizzando il metodo di micro-onde dimostrato qui, PEGDM può essere prodotto in una reazione 5 min. Mentre PEGDM ha cinetica di reazione più lenti rispetto PEGDA 13, la reazione di reticolazione per PEGDM è nondimeno rapida, che si verificano in minuti, e raggiunge una maggiore conversione macromero di PEGDA come l'aumento di idrofobicità del gruppo metacrilato aumenta aggregazione gruppo funzionale in soluzione, aumentando così la probabilità di trasferimento radicale e la conversione in metacrilato 14. Idrogel PEGDM sono anche associati con maggiore vitalità cellulare e la crescitarispetto a idrogel PEGDA, probabilmente a causa delle diminuzioni di velocità di reazione in un dato momento, che riduce la concentrazione radicale e macromeri reagito attuali 14. Polimerizzazioni tiolo-ene come quelli che usano norbornene-funzionalizzato PEG (PEGN) formano idrogel tramite polimerizzazione a stadi, e richiedono l'uso di PEGN e un reticolante che contengono una media di più di due gruppi funzionali. Poiché thiyl radicali reagiscono con i legami norbornene carbonio-carbonio doppio, multi-tiolo contenente reticolanti sono comunemente utilizzati per reticolare idrogel PEGN, consentendo l'incorporazione facile di peptidi con acidi cisteina aminoacidi funzionalità 7. Mentre ci sono numerose altre sostanze chimiche che reagiscono con polimerizzazione a stadi (reazioni di Michael-addizione come tiolo-acrilato 15 e tiolo-vinil solfone 16, "Click" reazioni come alchini-azide 17, ecc), idrogel tiolo-norbornene sono molto comuni, come il ceppo dal'anello norbornene aumenta significativamente la velocità di reazione e riduce la possibilità di norbornene doppia catena legame sottoposti a polimerizzazione 7.

La decisione tra metacrilato, norbornene, o funzionalizzazione alternate ad agevolare la formazione di idrogel è in gran parte basata sul metodo. Ad esempio, la catena di crescita per reti polimerizzato PEGDM sono state dimostrate così adatto per controllare la localizzazione delle cellule nello sviluppo di un tissutale periostio 18,19. A stadi polimerizzato reti PEG sono più adatti per l'incorporazione di sequenze peptidiche per facilitare enzimaticamente-reattivo degradazione idrogel, a causa della facilità di incorporazione di enzimi sequenze substrato utilizzando tiolo (cisteina) contenente peptidi e norbornene macromeri funzionalizzati 20. Se la domanda di ricerca sarà meglio affrontato con l'uso di idrogel a stadi, Fairbanks et al. Fornisce una descrizione dettagliata del norborstrategia di funzionalizzazione nene per PEG 7. Questo dettaglio carta volontà come PEG e sequenze peptidiche possono essere funzionalizzati (con metacrilato per la PEG, e un metacrilammide per i peptidi) per le reazioni di polimerizzazione a catena.

Tradizionalmente, PEGDM è prodotto facendo reagire PEG con cloruro metacriloile e trietilammina in diclorometano. La reazione viene lasciata procedere a temperatura ambiente per una notte per 11 o 24 ore 5, con alcuni metodi estendono tempo di reazione a 4 giorni 12 prima della filtrazione, precipitazione in etere dietilico, e la raccolta. Mentre esistono molte varianti di questo approccio, tutti sono in termini di tempo, richiedono una vasta gamma di apparecchiature sintesi chimica, e non sono ecocompatibili, in quanto implicano l'uso di quantità relativamente elevate di elevata purezza dei reagenti e solventi. Per aggirare queste limitazioni, Lin-Gibson et al. Ha sviluppato un metodo privo di solventi assistita da microonde di funzionalizzare PEG con te gruppi metacrilato rminal (Figura 3A) 12. In questa reazione, i gruppi alcolici terminali del PEG reagiscono con uno degli atomi carbonilici dell'anidride metacrilico per formare un carbossile. Questo genera il prodotto PEGDM, con acido metacrilico come prodotto laterale. Questa sintesi ha molti dei vantaggi caratteristici di sintesi a microonde, compreso il tempo di reazione ridotto e metodi di sintesi senza solventi 21. La sintesi a microonde è preferibile ai metodi precedentemente descritti in quanto è significativamente più veloce, richiede meno vasta apparecchiatura sintesi (ad esempio vetro, piastre di reazione), e utilizza meno reattivo complessiva e quantità di solventi come solventi sono necessarie solo per la purificazione del prodotto / raccolta e non per sintesi, rendendolo più economico ed ecologico.

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Figura 3:. Agli schemi Funzionalizzazione A) poli (etilene glicole) viene fatto reagire con 10x molare anidride metacrilica eccesso per produrre poli (etilene glicole) metacrilato B) Lo stesso metodo può essere utilizzato per funzionalizzare l'N-terminale delle sequenze peptidiche, formando una. metacrilammide peptide funzionalizzati. Eseguendo questa procedura prima scindere il peptide dalla resina, funzionalizzazione selettiva del N-terminale può essere eseguita come gruppi laterali amminoacidiche rimangono protetti. n: numero di PEG ripete nel macromero (n = 45,5, 227 e 455, rispettivamente, per il 2, 10 e 20 kDa lineare PEG utilizzato). R1 a RN: catene laterali di aminoacidi. PG1 a PGN: catena laterale gruppi di protezione. TFA: acido trifluoroacetico. Suggerimenti: triisopropilsilano. DODT: 3,6-dioxa-1 ,8-octaneditHiol. H 2 O: l'acqua.

Il metodo methacrylation assistita da microonde è stato recentemente adattato dal nostro gruppo di funzionalizzare l'N-terminale dei peptidi con gruppi metacrilammide (Figura 3B) per facilitare peptide incorporazione in una varietà di polimeri e reti polimeriche. In questa reazione, l'ammina primaria del N-terminale del peptide reagisce con l'atomo carbonile sul anidride metacrilico per formare un'ammide. Questo genera la metacrilammide peptide funzionalizzati, con acido metacrilico prodotto come un prodotto collaterale. Quando si utilizza questa procedura per funzionalizzare l'N-terminale delle sequenze peptidiche, è importante che gli aminoacidi contenenti catene laterali reattive (ammine primarie (lisina), alcoli (serina, treonina) e fenoli (tirosina)) sono protetti durante funzionalizzazione, e gruppi di protezione sono spaccati solo dopo l'incorporazione metacrilammide.

Questo articolo intende dimostrare entrambi questi microwMetodi di ave-assistita per sintetizzare PEGDM e funzionalizzare sequenze in-resina peptide, evidenziando errori comuni e suggerendo metodi di risoluzione dei problemi. In questo articolo, saranno dettagliati i metodi per eseguire le tecniche analitiche chimiche comunemente utilizzati per valutare funzionalizzazione del prodotto, e saranno dati suggerimenti e risorse per l'esecuzione di modifiche più avanzate. I risultati tipici saranno dimostrate, che includono utilizzando il PEGDM sintetizzata per formare reti di idrogel, sfruttando le idrogel costituite per controllare il rilascio di un modello di droga, ed impiegando peptidi funzionalizzati per facilitare le interazioni cellula-idrogel. Particolare attenzione sarà rivolta alla caratterizzazione idrogel dimensione delle maglie e discutere su come la composizione idrogel può essere sintonizzato per influenzare questa proprietà fisico sottostante, che a sua volta controlla le proprietà dei materiali alla rinfusa quali la rigidità e il profilo di rilascio del farmaco.

Protocol

1. Forno a microonde assistita Sintesi di PEGDM

  1. Per evitare la contaminazione con acqua, pre-dry tutta la vetreria utilizzata in un forno (> 60 ° C) per 1 ora.
    Nota: cristalleria Richiesto comprende: due bicchieri da 100 ml, un bicchiere da 250 ml, 3 spatole, un pallone Büchner da 250 ml, a 7 cm imbuto Büchner, un vetro d'orologio di 10 cm.
  2. Pre-freddo 100-150 ml di etere etilico anidro (74,12 g / mol) per la precipitazione successivamente eseguita a passo 1,6 versando in un bicchiere, coprire il becher con un vetro d'orologio, e mettendo il bicchiere in un piatto di ricristallizzazione pieno di ghiaccio. Spostare microonde e vortex in una cappa.
    Nota: Etere dietilico può anche essere prechilled collocando il becher in un congelatore chimica. La temperatura etere dietilico emissioni realizzato da raffreddamento in un congelatore aumenterà la velocità e l'efficienza di precipitazione.
  3. In una piccola barca pesare, pesare 5 g di poli (glicole etilenico) (PEG), del molecupeso lar di vostra scelta (1,000-100,000 Da).
    1. Se presente, rimuovere il pezzo di plastica dal coperchio della fiala di scintillazione. Tarare la fiala, e dispensare 10 eccesso molare di anidride metacrilica nel flaconcino (MA, 154.16 g / mol) per l'equazione 1 nella cappa. Aggiungi PEG al flaconcino scintillazione.
      Equazione 1 (1)
      dove Equazione 1.1 è la massa di PEG in g, Equazione 1.2 è il peso molecolare di PEG in g / mol, Equazione 1.3 è il numero di gruppi OH terminali sul PEG, e Equazione 1.4 è il molecupeso lar di MA in g / mol.
  4. Liberamente ruotare il tappo sul flaconcino scintillazione. Impostare il forno a microonde per 5 min a potenza massima. Indossare guanti resistenti al calore, togliere il flacone dal forno a microonde ogni 30 sec.
    1. Serrare completamente il tappo e vortex per 30 sec. Ripetere l'operazione fino a quando la soluzione è stata scaldati per la piena 5 min. Il tappo può essere necessario sostituire durante la procedura dovuta alla fessurazione.
  5. Con il tappo allentato, lasciare che il PEGDM raffreddare a temperatura ambiente. Sciogliere il PEGDM in una piccola quantità (10-15 ml) di diclorometano (DCM, 84.93 g / mol).
    Nota: Si raccomanda che il PEGDM lasciare raffreddare significativamente (~ 5 min) prima DCM Inoltre, per prevenire ebollizione del DCM (cancerogeno sospetto) dovuto al calore residuo. Il PEGDM può essere suddivisa in piccoli pezzi utilizzando una spatola e in agitazione per favorire la dissoluzione.
  6. Precipitare il PEGDM in eccesso 10x ghiacciata dietil etere per 20 min.
    Nota: Può essere necessario scratch lato becher con una spatola per avviare la formazione di cristalli di precipitare PEG di peso molecolare inferiore (2.500 Da), tuttavia, PEG con un peso molecolare inferiore a 1000 Da non precipiterà nonostante graffi.
  7. Su Buchner e pallone, raccogliere il PEGDM mediante filtrazione sotto vuoto. Non filtrare a completo essiccamento, in quanto ciò promuoverà assorbimento di acqua al PEGDM.
    Nota: Se necessario per il sistema di aspirazione specifico in uso, una trappola vuoto può essere collocato tra il setup filtrazione e la sorgente di vuoto per proteggere la pompa da vuoto da danni da vapori di solvente.
  8. Trasferire il PEGDM filtrato in una provetta da 50 ml con un grosso ago calibro trafitto il tappo per la ventilazione. Conservare tutta la notte in una camera a vuoto ad asciugare.
  9. Riprendere PEGDM in DCM e reprecipitate (come nei passaggi 1,5-1,7) come ultimo passo per rimuovere MA che non ha reagito. Essiccare nuovamente come al punto 1.8.

2. Caratterizzazione di PEGDM funzionalizzazione

  1. Uso cloroformio deuterato (120.38 g / mol) come solvente, preparare i campioni per 1 H-NMR. Collocare un piccolo campione di PEGDM (≈ 10 mg) in una fiala di scintillazione con una piccola quantità di solvente (≈ 1,0 ml). La concentrazione target è 10 mg / ml.
    1. Una volta che il campione viene sciolto, trasferirlo in un tubo NMR pulito. Il campione deve riempire il fondo 4-5 cm del tubo NMR.
  2. Raccogliere gli spettri NMR del protone. I nostri dati vengono raccolti utilizzando uno spettrometro a 400 MHz. Eseguire i campioni a temperatura ambiente per almeno 64 scansioni per ottenere la risoluzione di dati sufficienti.
  3. Se NMR (Figura 4) indica PEGDM funzionalizzazione è inferiore al 90%, la procedura methacrylation deve essere ripetuto. Regolare la massa di MA utilizzato per spiegare la ridotta quantità di unfunctionalized PEG.

Nota: La percentuale di PEG funzionalizzato in PEGDM può essere calcolata dalla osservato: rapporto teorico di methacr terminaleprotoni ylate (a, b, c) centrali PEG protoni (d) (Figura 4). Per PEG lineare, il numero teorico di centrali protoni PEG viene calcolata dall'equazione 2:

Equazione 2 (2)
dove Equazione 2.1 è il peso molecolare del PEG in g / mol e Equazione 2.2 è il peso molecolare di una singola ripetizione PEG (44 g / mol). Per non lineare PEG, questa equazione deve essere modificato per riflettere la struttura ramificazione specifico (Figura 1). La percentuale di funzionalizzazione può essere calcolato utilizzando l'equazione 3:
Equazione 3 (3)
dove Equazione 3.1 è l'area osservata sotto i picchi metacrilato protoni (a, δ = 1,94 ppm, b, c, δ = 5.57 e 6.12 ppm), e Equazione 3.3 è il numero teorico di protoni metacrilato (a = 3 * Equazione 1.3 , B = 1 * Equazione 1.3 e c = 1 * Equazione 1.3 - 6, 2 e 2 rispettivamente per PEG lineare). Il calcolo funzionalizzazione cento deve essere eseguito usando picchi A, B e C separatamente, e poi averagEd avere una funzionalizzazione cento complessivo.

Nota: PEGDM sufficientemente funzionalizzato può essere dializzata (in acqua, contro l'acqua), e raccolte da liofilizzazione per rimuovere i residui di anidride metacrilico e acido metacrilico. Il prodotto finale deve essere miscelato con una piccola quantità (0,01% in peso) di inibitore, come acido citrico o vitamina C e conservato con essiccante a -20 ° C fino all'utilizzo. Il prodotto PEGDM finale può essere usato per produrre idrogel, come descritto nell'articolo JoVE da Khetan e Burdick 22.

3. Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di Peptidi On-resina

Nota: I nostri peptidi sono sintetizzati utilizzando resina Fmoc-Gly-Wang, utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatico con controllo UV, e soluzioni 0,2 M di aminoacidi N-metil pirrolidone (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazina (86,1 g / mol) in dimetilformammide (DMF, 73,1 g / mol) è utilizzato per deprotezione, 0,5 M O-Benzotriazole-N, N, N ', N'-tetrametil-uronium-hexafluoro-fosfato (HBTU, 379,3 g / mol) in DMF viene utilizzato come attivatore, e 2 M diisopropiletilammina (DIEA, 129,3 g / mol) in NMP è usato come base attivatore. Peptidi possono anche essere ottenute da un fornitore commerciale peptide. Quando si utilizzano fonti commerciali è fondamentale che i peptidi siano effettuate-resina con la catena laterale amminoacidica gruppi protettori intatti piuttosto che completamente spaccati, come è standard.

Nota: È importante che qualsiasi amminoacidi con catene laterali reattive sono protetti per garantire che metacrilammide funzionalizzazione avviene solo al ammina primaria del N-terminale della sequenza. Vedere la Tabella 1 di amminoacidi con gruppi laterali reattivi e gruppi tipici protezione. Amminoacidi con gruppi protettivi sono incorporati nella sequenza durante la sintesi peptidica nello stesso modo come aminoacidi non protetti, e sono spesso disponibili dagli stessi fornitori aminoacidi.

Amino Acid Gruppo reattivo Gruppo di protezione
Lisina Amine primaria terz-butilossicarbonile (Boc)
Serina Alcool primario terz-butile (tBu)
Treonina Alcol Secondario tBu
Tirosina Fenolo tBu

Tabella 1: amminoacidi reattivi e gruppi tipici protezione.

  1. Sintetizzare peptidi usando standard di sintesi peptidica in fase solida, e memorizzare su resina a 4 ° C in DMF fino al momento dell'uso.
  2. Su Buchner 7 centimetri con carta da filtro e matraccio da 250 ml, raccogliere il peptide dalla resina DMF mediante filtrazione.
  3. Se presente rimuovere il pezzo di plastica dal coperchio della fiala di scintillazione. Trasferire la resina nella fiala di scintillazione. Usando una pipetta monouso, aggiungere sufficiente MA a coprire la resina nella fiala di scintillazione.
  4. Liberamente posizionare il tappo sul flaconcino scintillazione. Impostare il forno a microonde per 3 minuti a massima potenza. Indossare guanti resistenti al calore, togliere il flacone dal forno a microonde ogni 15-20 sec.
    1. Serrare completamente il tappo e vortex per 15 sec. Ripetere l'operazione fino a quando la soluzione è stata scaldati per il full 3 min.
  5. Con il tappo allentato, lasciare che la soluzione peptide raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzando una piccola quantità di DMF e su Buchner con carta da filtro e pallone, raccogliere la resina peptide dalla fiala.
  6. Trasferire la resina peptide ad una fiala di scintillazione fresco e fendere e deproteggere il peptide.
    1. Per 0,25 mmol di resina, usiamo un 2 ore di reazione a temperatura ambiente con rotazione, utilizzando un cocktail clivaggio di 18,5 ml di acido trifluoroacetico (TFA, 114.02 g / mol) con 0,5 ml ciascuna di triisopropilsilano (TIPS, 158.36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (DODT, 182,30 g / mol) e deionizzata-acqua (18.02 g / mol).
      Nota: Questo cocktail è sufficiente per la maggior parte dei peptidi, ma non deproteggere 2,2,4,6,7-pentametil-diidrobenzofuranico-5-sulfonyl aminoacidi (Pbf)-protette (comunemente usati per proteggere le catene laterali di arginina). Se la sequenza contiene gruppi Pbf-protetti, 0,5 ml di TFA devono essere sostituite con 0,5 ml tioanisolo (124.20 g / mol) e scissione di tempo è aumentato di 4 ore.
      Nota: Se un nuvoloso, forme sostanza cristallina del cocktail scissione, il peptide è probabile infrangono dalla soluzione e il volume del cocktail scissione dovrebbe essere raddoppiato.
  7. Chill-400 ml di etere etilico anidro sul ghiaccio in un bicchiere coperto con vetro d'orologio.
  8. Precipitare il peptide in 10x eccesso di etere etilico e dividere la soluzione omogenea tra quattro provette coniche da 50 ml. Centrifugare a 3.200 xg per 10 minuti per raccogliere il peptide.
    1. Decantare l'etere, e risospendere il peptide in 100 ml di etere etilico fresco diviso tra due tubi 50 m coniche. Ripetere il processo di centrifugazione, risospendere in 50 ml di etere fresco due volte per un totale di 4 lavaggi etere.
      Nota: Questo elimina le sostanze chimiche utilizzate nel cocktail scissione e scissa gruppi di protezione dal peptide solido.
  9. Dopo l'ultima fase di centrifugazione, decantare il et rifiutilei e asciugare il peptide notte sotto vuoto.

4. Caratterizzazione di Peptide funzionalizzazione

  1. Utilizzare 50:50 H 2 O: acetonitrile (41.05 g / mol) + 0,1% TFA come solvente per l'analisi MALDI-ToF di campioni peptidici. Collocare un piccolo campione (1 - 2 mg) del peptide in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e sciogliere il campione in 1 ml di solvente MALDI.
  2. Preparare la soluzione di matrice. Acido Una matrice comunemente impiegato è α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA, 189,2 g / mol) come matrice. Sciogliere 10 matrice mg / ml in MALDI solvente, formando una soluzione madre matrice.
    Nota: La soluzione madre matrice può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana per ulteriori analisi.
  3. Unire il peptide e la soluzione di matrice in un rapporto di 1:1. Spot questa soluzione combinata su tre posizioni distinte sul piatto del campione MALDI, aggiungendo 1 ml / spot.
    1. Asciugare le macchie, sia per asciugatura ad aria o utilizzando una pistola termica. Respot e asciugare ognicampione.
      Nota: Respotting produce un campione di peptide / matrice più uniforme, e aiuta ad ottenere un segnale chiaro. Una miscela peptide standard dovrebbe anche essere combinato con la soluzione di matrice in un rapporto 1:1 e macchiato (una sola volta) sulla piastra MALDI.
  4. Raccogliere i dati MALDI-TOF. A causa della aggiunta del gruppo metacrilammide al N-terminale del peptide, ci dovrebbe essere un aumento 68 g / mol in peso molecolare sopra quella del peso molecolare peptide da solo.
    Nota: A differenza della sintesi PEGDM, peptidi non possono essere refunctionalized, as clivaggio i gruppi protettivi su amminoacidi con catene laterali reattive vengono rimossi, e la funzionalizzazione selettiva della N-terminali non possono più essere garantita.
    1. Se l'analisi MALDI (Figura 5) indica il peptide è stato funzionalizzato correttamente e tutti i gruppi di protezione opportunamente tagliato, il peptide può essere dializzata (in acqua, contro acqua) e raccolte mediante liofilizzazione per rimuovendoe contaminanti residui (clivaggio cocktail, etere, spaccati gruppi protettivi ecc). Il peptide solida deve essere trasferito in un piccolo tubo Eppendorf e conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.

Representative Results

Proton risonanza magnetica nucleare è una delle tecniche analitiche più comuni per valutare l'efficienza di una reazione chimica, come l'area sotto ciascun picco spettri è proporzionale ai livelli relativi di protoni che nel campione, permettendo la determinazione dei rapporti tra il prodotto e reagente nel campione. Per questa reazione, 1 H-NMR (Figura 4) può essere usato per calcolare la funzionalizzazione% dal osservato: rapporto teorico di protoni metacrilato terminali (A, B e C) per centrali protoni PEG (d). Il PEGDM mostrato in Figura 4 era 2.000 Da prima della funzionalizzazione, quindi n = 2.000 Da / (44 Da / PEG ripetizione) = 45,5, così d = 4 * (n-1) = 178, rendendo il protone: rapporto unità NMR 178 / 102,16 = 1,74. In questo caso, un picco non possono essere utilizzati per valutare% funzionalizzazione, come la presenza di acqua nel campione aumenta artificialmente l'area sotto il picco. Utilizzando picco b, la funzionalizzazione% è 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using picco c, la funzionalizzazione% è 1.08 * 1.74 / 2 * 100% = 94,1%. Pertanto, la funzionalizzazione% complessivo è del 91% e questo PEGDM è adeguatamente funzionalizzata per l'uso in sintesi idrogel. In genere, circa il 90% funzionalizzazione viene raggiunta dopo un solo giro di methacrylation.

A causa del gran numero di picchi di protoni che sorgono in analisi 1 H-NMR di peptidi, peptide funzionalizzazione è più facilmente studiata utilizzando la spettrometria di massa MALDI-ToF. Questo è dimostrato in figura 5, dove il GKRGDSG peptide è stato sintetizzato e sottoposto a metacrilammide funzionalizzazione. Una piccola frazione del peptide è stato segmentato per prefunctionalization valutazione peso molecolare (Figura 5A), che ha mostrato il picco osservato peso molecolare che si verificano a 676 g / mol, il peso molecolare atteso del peptide, indicando corretta sintesi della sequenza peptidica. Il resto del peptide subito metacrilammide funzionalezione prima della scissione. Dato che questo peptide contiene Pbf protetto aminoacidi R, scissione è stata eseguita in un cocktail contenente tioanisolo per 4 ore. Dopo metacrilammide funzionalizzazione, il picco osservato peso molecolare avviene a 744 g / mol (Figura 5B), il peso previsto del metacrilammide funzionalizzato peptide (676 +68 g / mol) e non al peso molecolare atteso del peptide unfunctionalized, indicando corretta funzionalizzazione.

Per dimostrare la funzionalità sia del PEG e la metacrilammide funzionalizzato peptide, idrogel PEGDM stati prodotti con e senza 0,5 mM metacrilammide funzionalizzato GKRGDSG (Figura 6). Gli idrogel sono stati prodotti con il 10% in peso lineare 10 kDa PEGDM in PBS, con il 0,05% in peso di litio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), come fotoiniziatore. La soluzione precursore idrogel è stata iniettata tra due lastre di vetro separate da un distanziatore vetrino e tenute insieme con clip legante. Soluzione di precursore è stato poi esposto a luce UV 365 nm a 2 mW / cm 2 per 10 min per indurre reticolazione, dopo che gelifica 8 mm di diametro sono stati raccolti usando un punzone cilindrico. I gel sono stati sciacquati in PBS e lasciate gonfiare per 2 giorni al fine di garantire condizioni di equilibrio gonfiore sono stati raggiunti 16,20. MSC umane (passaggio 3) sono state coltivate a 80% di confluenza e seminate su idrogel a 15.000 cellule / cm 2. Le cellule sono state lasciate aderire per 48 ore prima di essere trasferito a mezzi freschi contenenti 0,5 microlitri / ml calceina AM e 2 microlitri / ml di etidio omodimero (LIVE / kit Viabilità DEAD da Invitrogen) e ripreso in contrasto di fase e fluorescenza a 10X di ingrandimento con un Nikon Eclipse Ti 2000. MSC erano in grado di aderire alle idrogel PEG unfunctionalized (Figura 6A), ma al momento l'inserimento di adesione cellulare peptide RGD sono stati in grado di aderire e diffondere sulla superficie di idrogel (Figura 6B). Le immagini LIVE / DEADpresentate non rappresentano la vitalità della popolazione seminato MSC, come MSC sono cellule di adesione-dipendente che si staccano dalla superficie del gel dopo la morte e saranno rimossi durante il processo di trasferimento dei media, con conseguente inflazione artificiale di vitalità cellulare seminato. Piuttosto, le immagini fluorescenti sono destinati a delimitare tra cellule aderenti e piccole variazioni nella topologia idrogel, che può risultare difficile, in contrasto di fase solo. È interessante notare che le cellule nonspread seminate sui PEG-esclusivamente gel macchia positivo sia calceina AM e etidio omodimero, indicando che le cellule morivano al momento di imaging.

Uno dei molti vantaggi di idrogel PEG è la loro natura altamente sintonizzabile. Modificando la composizione specifica della idrogel PEG offre ricercatori un elevato grado di controllo sulle proprietà come modulo di elasticità. Come illustrato nella Figura 7, sia il peso molecolare PEG (Figura 7A) e la percentuale in peso ( (Figura 8). Tutti gli idrogel sono stati prodotti con il 10% in peso PEGDM lineare in PBS, con 0,05% in peso LAP come fotoiniziatore. 40 ml di soluzione di idrogel precursore sia in 1 ml siringhe con le punte tagliate, ed esposti a luce 365 nm UV a 2 mW / cm 2 per 10 minuti per formare idrogeli, producendo geometrie cilindriche di circa 5 mm di diametro e 2 mm di altezza . I gel sono stati autorizzati a gonfiarsi in PBS per 2 giorni prima di prove meccaniche. Idrogel modulo è stato determinato utilizzando un MTS QT / 5 con una cella di carico da 5 N comprimendo tra il 5 e il 10% di altezza iniziale idrogel ad una velocità di 0.1 mm / sec. Dopo la prova meccanica è stata completata, dimensione di maglia è stata determinata misurando idrogel mass pre-(M s) e post-(M D) 24 ore di liofilizzazione tramite l'equazione di Flory-Rehner come descritto nella sezione di discussione, con i calcoli effettuati in MATLAB. Come ipotizzato, aumentando il peso molecolare del PEG macromero ha provocato un aumento della dimensione delle maglie idrogel (Figura 8A) e una diminuzione della rigidità idrogel (Figura 8B). Idrogel dimensione di maglia e il gel rigidità risultante possono essere controllati modificando percentuale peso PEG. Gli idrogel sono stati prodotti con vari wt% di lineare 10 kDa PEGDM, e idrogel rigidità e dimensioni delle maglie sono stati determinati come descritto in precedenza (Figura 9). Come è stato illustrato in Figura 7B, aumentando wt% PEG provoca una significativa riduzione delle dimensioni delle maglie (Figura 9A) e aumento della rigidità idrogel (Figura 9B).

Idrogel che contengono incapsulato albumina sierica bovina (BSA) si sono formati utilizzando diversi molecular PEG peso (2, 10, e 20 kDa). Tutti gli idrogel sono stati prodotti con il 10% in peso PEGDM in PBS contenente 50 mg / ml BSA, come descritto per la figura 6. I gel sono stati incubati in 1 ml di PBS a 37 ° C e trasferiti alla PBS fresco ad ogni tempo. BSA rilasciato è stato quantificato utilizzando il Bradford saggio da parte di Thermo Scientific. Idrogel dimensione delle maglie è stata determinata come descritto in Figura 8. Come illustrato in Figura 7A, rilascio BSA avviene più rapidamente da idrogel formati usando superiore PEGDM peso molecolare, come risultato delle grosse dimensioni delle maglie ai idrogel (Figura 10).

Figura 4
Figura 4. Rappresentativa 1 H-NMR di 2 kDa lineare PEGDM funzionalizzato con il metodo di micro-onde. Percent funzionalizzazione può essere calculated basato sulla osservato:. rapporto teorico di protoni metacrilato terminali (a, b, c) centrali PEG protoni (D) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5
Figura 5. Rappresentativa MALDI-TOF di peptide GKRGDSG (A) prima e (B) dopo funzionalizzazione con il metodo di micro-onde. Noti che il picco di peso molecolare osservata dopo funzionalizzazione avviene a 744 g / mol, il peso previsto del metacrilammide funzionalizzato peptide (676 +68 g / mol) e non al peso molecolare atteso del peptide non-funzionalizzato (676 g / mol). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .


Figura 6. Contrasto di fase Rappresentante (a sinistra) e LIVE / DEAD (verde / rosso) immagini fluorescenti (a destra) di MSC coltivate su gel A) PEG solo e B) gel PEG contenente 0,5 mM metacrilammide GKRGDSG funzionalizzato. MSC sono in grado di aderire e distribuite su il gel PEGDA solo, ma al momento della costituzione della adesione cellulare peptide RGD, sono in grado di aderire e diffondere sulla superficie idrogel. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 7
Figura 7. A) peso molecolare PEG e B) percentuale in peso PEG utilizzato per formare reti di idrogel colpisce idrogel dimensione delle maglie (_8 ;) e conseguente idrogel rigidità e rilasciare tasso di farmaci incapsulati. A) aumento di peso molecolare PEG (da sinistra a destra) in percentuale peso costante aumenta la dimensione delle maglie idrogel, diminuendo idrogel rigidità e aumentare la velocità di rilascio del farmaco. B) Diminuzione del peso percentuale di PEG (da sinistra a destra) utilizzato per formare idrogeli aumenta la dimensione delle maglie idrogel, analogamente diminuendo idrogel rigidità e aumentare la velocità di rilascio del farmaco (non in scala). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 8
Figura 8. A) aumenta di maglia e B) idrogel rigidezza diminuisce con l'aumentare del peso molecolare del macromero PEG. N = 10, barre di errore = SEM, *** p &# 60; 0.001 in one-way ANOVA con HSD test post-hoc di Tukey. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Prism 5. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 9
Figura 9. A) Mesh diminuisce size e B) idrogel rigidezza aumenta con l'aumentare% in peso PEG. N = 9-10, barre di errore = SEM, ** p <0.01, *** p <0.001 per one-way ANOVA con HSD di Tukey post- prova hoc. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 10
Figura 10. Rilascio di ENCAmodello psulated farmaco sieroalbumina bovina (BSA) da idrogel formati usando 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa peso molecolare PEG. rilascio BSA avviene più rapidamente da idrogel formati usando elevato peso molecolare PEGDM, a causa della dimensione delle maglie superiore ai idrogel . n = 6, barre di errore = SEM. La BSA% rilasciata è significativamente diverso (p <0.0001) tra tutti e tre i gruppi in ogni punto di tempo, tranne t = 1 e 2,5 ore quando la liberazione dalle 2 e 10 gel kDa sono equivalenti, per due vie di ripetizione-misure ANOVA con Bonferroni post-hoc test. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

I metodi precedentemente illustrati sono preziosi per la sintesi di PEGDM e metacrilammide funzionalizzazione di peptidi o altri composti contenenti ammina. Questi materiali possono essere usati per la medicina rigenerativa e applicazioni di drug delivery. A causa della natura idrofila di PEG, idrogel formati da macromeri PEG hanno un elevato contenuto di acqua simile a molti tessuti del corpo 2. Questa qualità rende PEG molto resistente alla proteina di adsorbimento e quindi inerte nel corpo 3. Tuttavia, la natura igroscopica del PEG può risultare fastidioso durante la funzionalizzazione. Se l'acqua è presente nel campione PEG durante la procedura methacrylation, l'anidride metacrilica reagisce preferenzialmente con acqua per produrre acido metacrilico, e scarsa funzionalizzazione di PEG risulterà.

Pertanto, uno dei passi più importanti che possono essere adottate per garantire il successo methacrylation del PEG o peptide è mantenere anhydcondizioni di reazione rosi. Il passo consigliato di asciugatura tutta la vetreria prima con lo scopo di prevenire la contaminazione dell'acqua. La presenza di acqua nel campione può essere visto in analisi NMR, come un ampio picco a 1,7 ppm (Figura 4). Se povera methacrylation si osserva anche dopo essiccazione vetreria, prodotti chimici possono essere essiccati su solfato di sodio o altri agenti essiccanti (setacci molecolari ecc) prima dell'uso. La distillazione può essere utilizzato anche per rimuovere l'acqua e purificare anidride metacrilica prima dell'uso, e distillazione azeotropica può essere utilizzato per asciugare PEG 23. In casi estremi, la sintesi può essere condotta in un vano portaoggetti per garantire ulteriormente le condizioni anidre adeguatamente. Una seconda serie di methacrylation, seguendo la stessa procedura, può essere effettuata anche per aumentare la funzionalizzazione. Perché c'è sempre la possibilità che saranno necessari turni supplementari di funzionalizzazione, occorre prestare attenzione nella fase 1.7 e 1.9 per raccogliere rapidamente PEGDM filtrazione sotto vuoto. Filtrazione sotto vuoto per più di aumenti è assolutamente necessaria l'esposizione del PEG per l'aria, aumentando la possibilità di assorbimento dell'acqua.

Anche se la percentuale eccesso di anidride metacrilato di gruppi funzionali idrossilici rimane invariato, aumentando la funzionalizzazione PEG (es. braccio #) sul precursore PEG è generalmente associata ad una diminuzione della percentuale di funzionalizzazione raggiunti (risultati non pubblicati, Benoit laboratorio). Per affrontare preventivamente questa riduzione di efficienza funzionalizzazione, o se particolari difficoltà si incontrano raggiungimento sufficientemente elevata funzionalizzazione, la durata della reazione microonde può essere aumentata, a condizione che l'intervallo microonde è mantenuta a 30 sec. Mentre 10 eccesso molare è tipicamente sufficiente, la quantità di anidride metacrilica usato nella reazione può anche essere aumentata per aumentare la funzionalizzazione cento raggiunto 12.

È importante che l'fase di precipitazione supplementare (1.9) viene eseguita per ottenere buoni segnali NMR. Mentre si è tentati di eseguire la seconda precipitazione lo stesso giorno di sintesi, essiccazione del campione durante la notte prima reprecipitating è stato trovato per aiutare la rimozione dell'eccesso di anidride metacrilico e acido metacrilico. La preparazione del campione è importante anche per il raggiungimento di spettri NMR pulita, e quindi i campioni devono essere preparati utilizzando le condizioni indicate. Figura 4 dimostra rappresentativi risultati 1 H-NMR per funzionalizzato correttamente PEGDM. Analizzando il rapporto tra protoni metacrilato terminali di centrali protoni PEG, il PEGDM era determinato a essere adeguatamente funzionalizzata. Preparazione del campione MALDI è altrettanto importante per il raggiungimento di una lettura chiara. MALDI è particolarmente sensibile alla presenza di sali e alte concentrazioni di campione. Se una lettura chiara MALDI (una intensità superiore a 50 unità arbitrarie (UA) con un elevato segnale: rumore) non può essere ottenuto, il campione soluzione deve essere diluito 1:100 in MALDI solvente prima di essere combinato con la soluzione di matrice e rianalizzati. Figura 5 mostra rappresentativi risultati MALDI-TOF dopo corretta funzionalizzazione peptide, scissione, e la preparazione del campione. Scissione di un piccolo campione di resina prima della funzionalizzazione (figura 5A) mostra corretta sintesi del peptide GKRGDSG, con corretta funzionalizzazione metacrilammide del peptide mostrato in Figura 5B.

Mentre funzionalizzazione di peptidi su resina è una procedura relativamente robusta, le condizioni di scissione richieste per ogni sequenza spesso richiede sintonizzazione. Per le lunghe sequenze dove molti aminoacidi sono protette catene laterali (> 30 amminoacidi lunghe, o> 15 amminoacidi con gruppi di protezione), la durata della scissione dovrebbe essere aumentato di un'ora. Tuttavia, se il tempo scissione è esteso troppo, legame peptidico scissione può provocare a causa di esposizione acida a lungo termine. MALDI ana lisi può essere molto utile nel rivelare eventuali errori che si sono verificati nella sintesi peptidica o scissione. Una diminuzione osservata sotto pesi molecolari attesi può indicare che amminoacido (s) non ha correttamente coppia, o che peptide frazionamento verificato (vedi Tabella 2 per fonti di variazioni comunemente osservate nei peso molecolare). Se il peso molecolare osservata è superiore al previsto dal peso di un gruppo di protezione utilizzato, è probabile che la scissione e la deprotezione era insufficiente e il peptide dovrebbe essere recleaved di tempi aggiuntivi.

x; "cambiamento> MW (g / mol) <style td = "width: 64px;"> +24 dth: 64px; "> -113 03px; "> Pro 20 "style =" height: 20px; width: 103px; "> Tyr
Amino Acid Cancellazione Cambiamento MW (g / mol) Gruppi di Protezione uncleaved Ioni comunemente presenti Cambiamento MW (g / mol)
Ala -71 Acetil +42 Cl - +35
Arg -158 Allyl +40 K + +39
Asn -114 Alloc +85 Mg 2 +
Aspide -115 Boc +100 Na + +23
Cys -103 Fmoc 223
Gln -128 OtBu +56
Glu -129 PBF 252
Gly -57 tBu +56
La sua -137 Trt 242
Ile -113
Leu
Lys -128
Met -131
Phe -147
-97
Ser -87
Thr -101
Trp -186
-147
Val -99

Tabella 2. Comunemente osservati cambiamenti di peso molecolare di peptidi.

Macromeri ottenuti con i metodi methacrylation assistita da microonde possono essere utilizzati in una serie di medicina rigenerativa o applicazioni di drug delivery. I peptidi funzionalizzati e PEGDM sintetizzati qui possono anche essere incorporati in polimeri utilizzando Nitroxide-Mediated polimerizzazione (NMP), Atom Transfer Radical polimerizzazione (ATRP) o reversibile Addizione-frammentazione Transfer (RAFT) metodi 24. Reti idrogel possono essere prodotti anche in presenza di cellule, come precedentemente dimostrato nell'articolo JoVE da Khetan e Burdick 22. Questo richiede spesso l'incorporazione di peptidi di adesione cellulare come RGD o molecole della matrice extracellulare, come sola PEG non fornisce interazioni cellula-materiale critici per la sopravvivenza e la funzione di alcuni tipi di cellule 25. Peptidi, per esempio, possono essere sintetizzati tramite la tradizionale sintesi peptidica in fase solida e funzionalizzati come descritto qui di consentire incorporazione in reti idrogel. Come si vede nella Figura 6, l'inclusione di adesione cellulare peptide metacrilammide-funzionalizzato GK RGDS G in idrogel (0,5 mM) facilita l'adesione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) per superfici idrogel PEG, aumentando il numero di cellule divisoria e diffusione (Figura 6B ), rispetto al PEG idrogel senza il peptide adesione cellulare ( 26. Per incorporare questo spacer PEG ed evitare interazioni non specifiche, peptidi possono essere coniugati a monofunctionalized PEG via N-hydroxysuccinimidyl attivati ​​esteri, come descritto da Hern e Hubbell 26.

Applicazioni di reti idrogel richiedono uno stretto controllo sulle proprietà dei materiali. Un vantaggio significativo di idrogel PEG è un alto grado di controllo su queste proprietà. Ad esempio, il peso molecolare, numero braccio, e la% in peso di PEG utilizzato nella formazione di reti di idrogel può essere modificato per mettere a tune proprietà per applicazioni specifiche. Questo permette un controllo stretto su idrogel dimensioni delle maglie (ξ), che controlla idrogel gonfiore rapporto (Q) e rigidità (modulo elastico, E). Questo è illustrato in Figura 7A e quantificati nella Figura 8, dove l'aumento PEG macromero risultati peso molecolare in un aumento delle dimensioni delle maglie idrogel (Figura 8A) e una diminuzione della rigidità idrogel (Figura 8B).

La caratteristica fisica di base che controlla il comportamento di massa in queste reti idrogel, dimensione di maglia, è calcolato utilizzando l'equazione di Flory-Rehner 16. Per effettuare questo calcolo, il rapporto volumetrico gonfiore (Q) viene dapprima calcolata utilizzando la formula 4:
Equazione 4 (4)

dove ρ s è la densità dell'acqua (1 g / ml), ρ p è la densità di PEG (1.12 g / ml), M s è massa gonfia dell'idrogel e D M è la massa secca della idrogel (spesso misurata dopo il congelamento e liofilizzazione di idrogel). Il peso molecolare tra legami crociati (M c, in g / mol) viene quindi calcolata dall'equazione 5:
Equazione 5 (5)

dove M N è il numero medio MW di PEG (in g / mol), Equazione 5.05 è il volume specifico del polimero Equazione 5.1 , V 1 è il volume molare di acqua (18 ml / mol), V 2 è la frazione di volume polimero equilibrio dell'idrogel
( Equazione 5.2 ), E X 1 16. Il numero di legami incrociati tra (n) viene quindi calcolata dall'equazione 6:
Equazione 6 (6)

dove N b è il numero di legami nella ripetizione PEG (3) e M r è il MW della ripetizione PEG (44 g / mol) 27. Questo permette la distanza radice quadrata media end-to-end della catena polimerica Equazione 6.1 (In nm) deve essere calcolata dall'equazione 7:
Equazione 7 (7)

dove L è la lunghezza media legame (0,146 nm, calcolato sulla base CC e CO legame lunghezze) e C n è il rapporto caratteristico del polimero (4.0 per PEG) 28. Finalmente, dimensione delle maglie della idrogel può essere calcolato dall'equazione 8:
Equazione 8 (8)

Proprietà idrogel possono similmente essere sintonizzate regolando la quantità di PEG utilizzati nella formazione di idrogeli. Diminuendo la percentuale in peso di macromero PEG risultati in un aumento delle dimensioni delle maglie idrogel, che riduce successivamente idrogel rigidità. Figura 7B illustra e Figura 9 quantifica la percentuale in peso di PEG utilizzato nella formazione di idrogel può essere utilizzato per controllare le dimensioni delle maglie (Figura 9A) e la conseguente rigidità idrogel (Figura 9B). Come substrato rigidità ha mostrato di influenzare i comportamenti delle cellule quali la differenziazione delle cellule staminali 29, la capacità di controllare strettamente rigidità è una caratteristica importante in idrogel fabbricazione.

Idrogel possono essere utilizzati anche per contrconsegna della droga olo. Come illustrato in Figura 7A e dimostrato nella Figura 10, l'aumento del peso molecolare di PEG macromeri aumenta dimensione delle maglie della rete idrogel, successivamente aumentando il rilascio di farmaco incapsulato modello, sieroalbumina bovina (BSA). Mentre i campioni di idrogel in questo studio sono stati distrutti in t = 195 ore per consentire la misurazione di idrogel masse umido e secco per i calcoli di dimensioni di maglia, è la nostra esperienza che continuava rilascio BSA si sarebbe verificato erano i campioni state incubate per periodi di tempo più lunghi. Il rilascio incompleto di BSA osservato nella Figura 10 non è inaspettato, come altri gruppi hanno anche riferito che BSA è resistente alla diffusione all'interno delle reti idrogel PEG 30. Versione incompleta di proteine ​​incapsulate possono verificarsi a causa di legami idrogeno tra proteine ​​e macromeri PEG, o vincolante tra il gruppo metacrilato sul PEG e gruppi amminici primari sui residui di lisina nel BSA 31 covalente (Figura 2A), è anche possibile che una frazione della BSA incapsulato è contenuto in regioni della idrogel aventi maglie notevolmente inferiori dimensioni rispetto alla media complessiva all'interno del gel, impedendo il suo rilascio. Mentre incomplete, rilascio nonFickian (dati non mostrati) di BSA incapsulato è stata osservata in questo caso, il rilascio controllato di Fickiano numerosi altri farmaci modello, compresa l'insulina e ovalbumina, è stata dimostrata utilizzando PEGDM simile idrogel 30. Inoltre, Watkins e Anseth hanno usato microscopio confocale a scansione laser per dimostrare che il rilascio di molecole fluorescenti da idrogeli simili è modellato gradito, con la diffusione Fickiano methods 32.

Mentre gli idrogel formati in questo studio sono nondegradable, degradazione rete è un altro parametro che può essere incorporato e sintonizzata su queste reti. Prevedere degradazione idrogel controllato può causare alterazioni nel comportamento cellulare 33, promozione della crescita del tessuto o crescita interna del tessuto ospite, o l'eliminazione della necessità di espianto 34. Idrogel degradabili PEG sono comunemente sintetizzati apertura di anello d idroliticamente degradabile, l-lattide, glicolide, o gruppi ε-caprolattone su gruppi ossidrile all'interno PEG prima di methacrylation 35. Questi tre gruppi degradano dall'idrolisi di funzionalità estere, con gli esteri glicolide la parte maggiore suscettibilità alla degradazione, seguita da lattide e caprolattone estere, a causa della loro idrofobicità variabile. Dopo incorporazione di gruppi idroliticamente degradabili, PEG può essere ulteriormente funzionalizzato utilizzando la procedura detaile methacrylationd in questo articolo, consentendo la formazione di reti di idrogel con conseguente radicale avviato polimerizzazione a catena 36,37. La velocità di degradazione delle reti di idrogel può essere controllata variando l'identità del gruppo idroliticamente degradabile (glicolide, lattide, ecc) e variando il numero di ripetizioni degradabili incorporati nella struttura del 35,38.

Teoricamente, i metodi dimostrati qui possono essere usati per acrylation di PEG e peptidi sostituendo l'anidride metacrilico con anidride acrilico in fasi 1.3 e 3.3, rispettivamente. Tuttavia, acrilico anidride è più di 20 volte il costo di anidride metacrilico 39,40, rendendo micro-onde acrylation significativamente meno attraente di micro-onde methacrylation.

Abbiamo dimostrato un metodo semplice e rapido per funzionalizzare PEG e peptidi, come valutare l'efficacia di questa procedura, e dato risorse per ucantano i materiali sintetizzati per formare reti di idrogel. Questi strumenti sintetici sono altamente versatili nelle loro applicazioni, e dovrebbe rivelarsi un fiocco in qualsiasi numero di laboratori di ricerca di consegna e dei materiali della droga.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato in parte da una borsa di studio di Howard Hughes Med-in-Grad (AVH), dai fondi di start-up forniti al Dr. Danielle Benoit presso l'Università di Rochester e la Ricerca e Formazione Fondazione Ortopedica / Trapianto muscoloscheletrico Foundation (OREF / MTF). Gli autori desiderano ringraziare il Dott. James L. McGrath per l'uso del suo equipaggiamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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