バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

Bioengineering

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Summary

ブレンドは、プロパティと組み合わせた幅広い機能を持つ生体材料を生成するための効率的なアプローチである。異なる天然絹タンパク質との間の分子相互作用を予測することによって、調整可能な機械的弾力性、電気的応答、光学的透明性、化学的加工性、生分解性、または熱安定性を有する新規の絹の絹タンパク質合金プラットフォームを設計することができる。

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Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

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Abstract

繊維状タンパク質は、バイオセンサー、ナノ医療、組織再生、および薬物送達のような生物医学分野でのさまざまな用途に使用されている別の配列および構造を示す。これらのタンパク質間の分子スケールの相互作用に基づいて材料を設計する調整可能な特性を有する新規多機能タンパク質合金の生体材料を生成するのに役立ちます。このような合金材料系はまた、体内の物質の生分解性、生体適合性、および維持可能性を従来の合成ポリマーと比較して利点を提供する。この記事では、タンパク質合金を生産する方法、計算方法によって、タンパク質-タンパク質相互作用を予測する方法など、これらのトピックについての有用なプロトコルを提供するための一例として、野生のタッサーシルク( 柞蚕 )と国内桑絹( カイコ )のタンパク質ブレンドを使用ソリューションは、どのように熱分析の合金系を検証する方法、および可変合金材料を製造するために回折格子を有する光学材料、回路コーティングを有する電気材料、及び薬物放出および送達のための医薬材料を含む。これらの方法は、異なるタンパク質合金に基づく次世代の多機能生体材料を設計するための重要な情報を提供することができる。

Introduction

自然は構造タンパク質の限られた数を使用して調整可能な多機能生物学的マトリックスを生成するための戦略を作成しました。例えば、エラスチン及びコラーゲンは、常に特定の組織1,2に必要な調整可能な強さと機能を提供するためにインビボで一緒に使用される。この戦略の鍵は、ブレンドです。混合は特定の比率で混合するタンパク質を含み、調整可能な多様性質3-5とシンプルな材料系を生成するための技術的なアプローチである。また、材料の均一性及び操作8-16の容易さのために材料を処理する能力を向上させることができるブレンド、合成操作戦略6,7と比較した。従って、多機能性、生体適合性タンパク質合金材料を設計する医学研究の新たな分野である。この技術はまた、VITの両方 、細胞および組織の機能上の天然タンパク質マトリックスの影響を体系的知識を提供するROおよびin vivo 10,17 。異なるタンパク質間の分子のインターフェースを最適化することによって、タンパク質ベースの合金材料は異なる温度で角膜組織再生3多様な組織、変数器官における電気的感度、及び光学的特性をサポートするための弾性を、熱安定性などの物理的な機能の範囲を包含することができる18-27。これらの研究の成果は、調整可能な組織の修復および疾患の治療およびその新たな治療および診断機能は3を想定することができる生分解性のインプラント装置をさらにリードに直接関係して生物医学科学の分野での新たなタンパク質材料のプラットフォームを提供します。

多くの天然構造タンパク質は、生体材料マトリクスの候補として活用することができる重要な物理的および生物活性特性を有する。別のワームの種からのシルク、異なる組織から毛やウール、エラスチンとコラーゲンからケラチン、およびさまざまな植物タンパク質( 1)18-27可変タンパク質ベースの材料を設計するために使用される最も一般的な構造タンパク質の一部である。一般に、これらのタンパク質は、それらの固有の反復的な一次アミノ酸配列に3,28-35の異なる分子の二次構造( 例えば 、ベータシルク用シート、またはケラチンためのコイルドコイル)を形成することができる。これらの機能は、生体高分子材料の秘蔵資源としての有用性を促す生物学的界面でのユニークな機能を備えた自己組織化巨視的構造の形成を促進する。ここでは、構造タンパク質の二種類は、さまざまなタンパク質合金生体材料を製造する一般的なプロトコルを示すために(一例として家畜化クワ絹からの野生柞蚕絹およびタンパク質B由来のタンパク質A)を用いた。タンパク質相互作用の予測やシミュレーション、パート2:プロテイン合金ソリューションの生産、及びその3:タンパク質合金の製造実証プロトコルは、パート1を含むシステムや、光学的、電気的、および医薬用途のために。

図1
図は、一般に、タンパク質ベースの材料設計異なるワーム種からの絹を含むために研究室で使用される各種の構造タンパク質の1原材料、毛およびウール、異なる組織からエラスチン、および各種植物タンパク質からケラチン。

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Protocol

タンパク質相互作用の1。予測

  1. タンパク質分子のバイオインフォマティックス解析
    1. バイオテクノロジー情報のウェブサイトのための国立センター(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)へ、そして合金研究のために使用されるタンパク質名を検索します。注:この例では、二つのタンパク質を使用した:野生柞蚕絹フィブロインであるプロテインA、および国内の桑シルクフィブロインであるタンパク質Bを、。プロテインAは、アミノ酸配列が記載されています"[柞蚕] GenBankのフィブロイン:AAC32606.1」( 柞蚕は (オーク)柞蚕蛾中国人である)。と「フィブロイン軽鎖前駆体[カイコ]のNCBI参照配列:NP_001037488.1「一緒に( カイコ :タンパク質B、アミノ酸配列」NP_001106733.1フィブロイン重鎖前駆体[カイコ] NCBI参照配列」に記載されています桑の木の家蚕です。
    2. 選択し、SAデータベースからのタンパク質Aおよびタンパク質Bのアミノ酸配列VEの。
    3. ExPASyウェブサイト(SIBバイオインフォマティクスリソースポータル)へ(www.expasy.org)またはを含むがこれらに限定されますが、ではないそれらの配列に基づいてタンパク質の基本的なバイオインフォマティクスデータを算出するために、他の商用ソフトウェアを使用して、分子当たり全電荷の疎水性指数この情報分子を、異なるpH値での分子の滴定曲線は、タンパク質相互作用の計算機シミュレーションのための基本要素として使用され、これらの2つのタンパク質が強力な相互作用を有するかどうかを理解するのに役立ちます。 [注:このステップは、正確に小ペプチドまたは機能性タンパク質科学において使用されるもののようなタンパク質相互作用のすべての詳細を予測するためのものではありません。このセクションの目的は「合金」材料と呼ぶことができない明らかなマクロ相分離したタンパク質混合物を生産避けることだけである。そのため、見積もりは概算しかし番目の可能性電子タンパク質合金系は、正確な熱分析]を用いて、ステップ3.1に記載した実験方法によって確認することができる。
  2. プロテイン合金系の数値シミュレーション
    以下のタンパク質合金系をシミュレートする手順について説明する。シミュレーションプログラムは、単一またはマルチプロセッサコンピュータシステム上で使用することができるCプログラミング言語で書かれている。格子ばね質量(LSM)モデルは合金タンパク質36-39をシミュレートするために使用した。春に取り付けられており、一つは各質量のための運動を理解する力方程式を解くことができたときに、LSMモデルがマス上の正味の力の簡単な説明が表示されます。次のようにLSMモデルを使用してこのタンパク質合金系をモデル化するための単純なプログラムアルゴリズムが与えられる。
    1. Mの質量を有する粗粒の粒子として単一のタンパク質を表す。
    2. ボンド38,39を表現するためにHookeanまたはネオHookean春を使用してください。スプリングを有する粒子の有限数を鎖交することにより、ある缶メートル合金タンパク質の安定なビルディングブロックを表し、サブ合金ドメインAKE。イントラ連動して債券の異なるタイプを表すために、異なるばね定数/剛性を使用しています。
    3. 鈍い架橋サブ合金から成る原料としてタンパク質合金系をモデル化する。ここでも異なる剛性は、サブ合金の間の結合の間に異なる結合を表すために使用された。
    4. 弱い結合を再形成することが許可されるときに通過するベルモデル40,41によって結合破壊と改質プロセスをモデル化するが、それらが壊れている、一度強い結合が再形成することはできません。システムが十分に(イントラsuballoyとインターsuballoy国債の両方)を強調すると、結合が壊れて改質することができます。
    5. 彼らが強調しているとき合金タンパク質上の変形の影響を研究するために、システムに外力を加える。力方程式(ニュートンの法則)を解くときに、各粒子に均等にこれらの力を配布します。
    6. 相互作用をモデル化する(例えば、水分子など)の溶液とタンパク質との間で、それぞれの粒子に対するさらなる抵抗力または摩擦力を加える。
    7. 各力(結合、外力、摩擦力のばね力)のアクションを持つ各粒子のための力の方程式を解く。
    8. 時間の関数としてタンパク質粒子の位置を計算し、抽出する。
    9. 粒子の位置から合金タンパク質を特徴づける物理量を計算します。
    10. 異なるタンパク質間の相互作用を理解するために、プログラムで結合剛性を変更します。 (平均結合剛性はタンパク質材料のヤング率から計算される。異なる繊維状タンパク質材料のヤング率は、ユニバーサル引張試験18によって、または直接以前の文献2-4,18のいずれかから得ることができる)。

プロテイン合金ソリューション2。生産

野生柞蚕シルク(プロテインA)と国内桑絹(タンパク質B)は、タンパク質の合金系の一例として、ここで選択される。このプロトコルは、最初に野生のタッサーシルク(プロテインA)ソリューションを取得する方法を提示します。

  1. 生の野生のタッサーシルクの繭又は繊維は3グラムの重さでカット。
  2. ナトリウムジカーボネートまたは炭酸ナトリウム3gを測定する(注:炭酸ナトリウムを使用して、タンパク質鎖の分子量が沸騰プロセス42の間に減少する場合)。
  3. 蒸留水(H 2 O)を2Lのガラスビーカーを埋める。その後、沸騰にアルミニウム箔および熱でそれをカバー、ホ​​ットステージ上でガラスビーカーを置く。
  4. アルミ箔のカバーを取り外し、沸騰したお湯にゆっくりと測定されたナトリウムカルボネートを追加し、それが完全に溶解することができます。 (注:ナトリウムカルボネートの役割は、野生の絹繊維の表面に付着した水溶性のセリシンタンパク質および他の不純物をきれいにする「石鹸」ですOTHを使用している場合。えー自然タンパク質繊維、)は文献に基づいて対応する化学物質を選択してください。
  5. 沸騰したお湯に生のタンパク質繊維(野生絹繊維)を追加し、注意してください(2〜3時間沸騰することができます:。沸騰時間は、タンパク質鎖26,43の分子量に重大な影響を与えている一つは応じて適切な時間を選択する必要があります文献にまたは対照実験26,43を実行することによって。沸騰温度もタンパク質鎖26,43,44)の分子量に影響を与えるように調整することができる。
  6. 煮沸後、慎重に溶液からスパチュラでタンパク質繊維を除去し、過剰の水を除去するためにそれらを絞る。 (注意:繊維が高温になっています!)
  7. 次に、冷蒸留水で2リットルのビーカー中の繊維を浸漬し、完全に繊維表面から不純な残留物を除去するために30分間、それぞれ2回繊維を洗浄する。少なくとも12時間、ヒュームフード内の繊維を乾燥させる。
  8. カルシウムNITの45.784グラムを溶かし野生絹タンパク質繊維を溶解するために65°Cで液体を形成するためのレート(のCa(NO 3)2)ガラスビーカー中。 (注:他の天然タンパク質繊維を使用している場合は、タンパク質を溶解するために、対応する溶媒を選択ここでは、また、9.3 M LiSCNまたはLiBrの溶液、または別の絹繊維を溶解するための85%のリン酸水溶液を使用することができます。)
  9. 溶剤10ミリリットル中に1グラム繊維の割合で繊維や溶剤を組み合わせる。繊維は5から12時間、95℃で溶解させる。 (注:溶解時間は、タンパク質26,43-45の分子量に依存します)
  10. 注射器を使用して、(カットオフサイズとして最大100万kW)12ミリリットル透析カセットにワイルドシルク液や密封された透析チューブ(カットオフサイズとして最大100万kW)を注入し、蒸留水2Lに対して透析。 (注:35°Cで溶液を維持した場合、注射は、より効率的であり、そうでなければ、タンパク質溶液の粘度は劇的に室温で増加する)。 (NO 3)溶液中の2溶媒(3日間30分後、2時間、6時間、その後、12時間ごとに。合計で約8水換えがあるでしょう)のCaを除去するために頻繁に蒸留水を変更します。
  11. 3日後、透析カセットまたは管からのタンパク質溶液を収集し、13000 rpmで、定格のチューブに配置します。
  12. 堆積物を除去する4℃の3倍で3,500 rpmで1時間のためのソリューションを遠心します。各遠心分離の実行後は、すぐに新しいチューブに上清を引っ張る。 4℃の冷蔵庫で、最終的な解決策を保管してください。
  13. (これは通常は12時間以上かかる)ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板などの平らな疎水性基材上にタンパク質溶液5mlを注ぎ、それが完全に乾燥させます。残った固体タンパク質フィルムを計量し、(溶液に)重量(容量%/ w)の割合=(mg単位)測定された重量÷10÷5によって最終溶液濃度を算出。
  14. このCASに(別の選択された天然タンパク質繊維を収集電子、飼いならさクワ絹)をタンパク質Bとして使用し、測定された濃度を有する最終的なタンパク質水溶液が得られるまで、適切な「石鹸」と溶剤溶解で上記プロセスを繰り返す。 [注:タンパク質材料が粉末形態である場合、「ソーピング」プロセス中にサンプルを保持するために適切な多孔性のチューブまたは膜を使用する。タンパク質は、既に精製されている場合には、直接粉末を溶解するために2.8に進む。タンパク質は、既に精製され、水溶性であるれている場合は、最初に、次にブレンドタンパク質溶液を作るために、次の2.15に進み、所望の濃度との水溶液を作る。]
  15. ゆっくりと1.0重量%タンパク質水溶液を形成するために4℃の蒸留水にプロテインA溶液(ここでは野生シルク溶液)を希釈する。タンパク質B(ここでは家畜化絹)のために同じプロセスを実行します。
  16. ゆっくりと4でプロテインB溶液と1重量%のタンパク質溶液を混合 °Cは、pを避けるために、ピペットを用いて混合中に凝集をrotein。 (注1:一部のタンパク質( 例えば 、絹)は、振動46,47の間にヒドロゲルを形成するので、タンパク質を混合するためにボルテックス機器を使用しないでください注2:可能な場合は、混合速度および混合サイズ意思を制御するために追加のデバイスを使用する凝集を避けるために、可能な限り遅くに混合するようにしてください。すぐに、混合の間に溶液をピペッティングしないでください)​​。
  17. 最終ブレンドのソリューションは、指定された質量比またはプロテインAとのモル比を有するべきである:タンパク質B.典型的には、取得し、90:10の質量比が、75:25、50:50、25:75と10:90それらをミックス合金溶液の広域スペクトル。コントロールとして、純粋なタンパク質Aおよびタンパク質Bのソリューションを使用してください。プロテインB = R:(100-R)プロテインAのモル比を有する混合溶液である。ボリュームA:ボリュームB = R·(AのMW):(100-R)·(BのMW)によって(同じ1重量%溶液に基づく)の混合体積比を計算する。
  18. 直ちにフィルムまたは他の指​​名打者を形成するためにPDMS基板に最終溶液を上にキャストgned材料。 (注:長時間にわたって高濃度のタンパク質合金ソリューションを保管しないでくださいさらに凝集体は水中でのタンパク質 - タンパク質相互作用に後で形成していてもよい。)。必要に応じて、イオンを含まない蒸留水でブレンド溶液を希釈し、溶液中での付加的なタンパク質凝集を回避するために、4℃の冷蔵庫に保管してください。

可変タンパク質合金材料の3。製作

  1. 熱分析による合金の予測を確認3,9,31-35
    1. PDMS基板を準備し、蒸留水に浸漬することによって、それらをきれいに。
    2. PDMS基板上に異なる混合比のタンパク質ブレンド溶液をキャストします。
    3. 膜が形成されるまで空気の流れとの化学フード内で少なくとも12時間ソリューションを乾燥(注:フィルムの厚さは、固定することができるように、異なる解決策を同じ体積を使用)。
    4. PDMS基板からのタンパク質合金膜を取り外し、きれいな皿に置きます。
    5. DSC研究のための多くの示差走査熱量測定(DSC)アルミニウムパンと蓋を秤量する。 (蓋のパンを加えた重量の重量が一定重量に等しい)に等しい総重量を持っている鍋と蓋のペアを一致させます。例えば、ここで蓋の全重量及び22.50 mgのパンを使用し、この総重量を有する蓋とパンの組み合わせの8セットを調製した。
    6. アルミニウムDSCパンには6mgの乾燥タンパク質混合物の各タイプをカプセル化し、プロセス3.1.5での一致したふたでそれらを封印。それ自体は、熱分析の際に記録されるサンプルの唯一の熱容量ように注意してください(参考として、サンプルで使用する空パンと蓋のペアをシール:DSCは、その対の基準パン+蓋の熱容量を比較するサンプル+パン+蓋。等重量のためにと、パンと蓋から背景熱容量は、パン中のサンプルの唯一の熱容量)を残し会計処理される。
    7. で、DSC装置に密封された参考文献およびサンプル皿を置く50ml /分の乾燥窒素ガス流をパージし、冷蔵冷却システムを装備した。サンプル測定の前に、DSC装置は、まず、それぞれの熱流量と温度、サファイアおよびインジウムで較正する必要があります。
    8. 150°Cに2 K /分の加熱速度でDSCを予め実行し、サンプル(全重量の典型的には約3〜10%)の残りの水分子を除去するために15分間この温度で​​保持する。すぐに25℃まで(10K /分)をクールダウン。
    9. 300 2 K /分の加熱速度で再びDSCを実行する °C、またはタンパク質ブレンドの分解ピークが34を表示されるまで。このプロセスの間に、異なる温度でのタンパク質試料の熱容量を記録します。 DSCをクールダウンし、異なる混合比の新しいサンプルを古いサンプルに変更します。
    10. DSCソフトウェア31〜35を用いて、各タンパク質ブレンド試料の温度曲線対の熱容量を計算し、プロットする。
    11. mは裁判官以下の方法によるタンパク質混合物のiscibility(熱および図5図4参照)と二つのタンパク質が完全に混和性である場合、それらは「タンパク質合金」と呼ばれることもある。それ以外の場合は「タンパク質複合体は、「ポリマー記述的理論48,49)に応じて適切な名前を次のようになります。
      1. 個別のタンパク質A及びBは、個別の単一のガラス転移温度、T gの(A)およびT gの(B)( 図5の緑及び青の曲線を参照)3,48を有しているべきである;
      2. この単一のガラス転移温度は、二つの個別のタンパク質成分、T gの(A)およびT gを (B)との間の通常の中間体である3,48( 図5参照)。
      3. 不混和性相分離がT gの(A)およびT gの(B)の両方が元の位置( 図5)に現れ、それぞれのT gステップであれば得られたブレンド物に比例して高さは、2つのタンパク質は3,48完全に非混和性である。
      4. (T gを (A)およびT gの(B)、1つの非常に広範なガラス転移を有し、または依然として2つのガラス転移を有することができるが、それぞれの純粋なタンパク質成分に対して互いに接近移動した半混和性複合ブレンドタイプ図5)を参照してください。この場合、2つのタンパク質成分の間に形成されたミクロ不均一相構造が存在する可能性があり、組成物が場所によって変化してもよい。
    12. (3.1.11.1)DSCに示す場合であり、それはタンパク質ABは、合金系であることが確認できれば、タンパク質合金材料を製造するために移動する。
  2. プロテイン合金による光学材料の作製
    1. (製造ラボで)プロデュースやキャスト用に設計された地形面を購入してください。この特定の例では、4つの回折パターンを有するガラスを使用した( 図4オプティカル)。
    2. 皿に回折パターンを有するガラスを置き、パターン化された面を上に向けていることを確認します。
    3. ガラス表面上に均一にPDMS溶液を広げ、完全に(PDMS溶液を9にポッティングし、触媒溶液により行われるユーザ指示23,44に従って混合比1)表面パターンを覆う。
    4. 平らな面に、少なくとも2時間のしばらくの間、65℃のオーブンに鋳造皿を置きます。 PDMS溶液は、このプロセスの間に、固体基板に乾燥する必要があります。
    5. ガラスからPDMS基板を取り外します。回折パターンは、現在のPDMS表面に転写されるべきである。
    6. 適切なパンチを用いた回折パターンとPDMSモールドをパンチアウト。
    7. 回折パターンを有するPDMS表面上のタンパク質合金溶液をドロップし、回折パターンを有するフィルムを得るために、少なくとも12時間乾かし。
    8. 不溶性タンパク質合金材料を得るためには、ドクターのセット全体を置くチャンバーの底の水皿で60℃の真空オーブン(25キロパスカル)に、PDMS鋳型を含むyのフィルム。オーブン内の空気を汲み出し、そして少なくとも2時間、水蒸気アニールサンプルう。 (このプロセスは、温度制御された水蒸気アニール45と呼ばれている。広く使用されているメタノール法と比較すると、シルク素材45における類似のβシート含量を生成することができる)。真空を解除し、鉗子を用いてPDMS基板から水不溶性フィルムをはがす。この例では、野生シルク家畜化シルク合金が使用されている。
    9. ガラス上の原稿のパターンと比較することにより、フィルム上の回折パターンの品質をテスト(;一般的なパターン品質をレーザー回折パターンを収集し、例えば 、マイクロスケールの詳細については、SEM画像を収集する)。
  3. プロテイン合金材料に関する電気回路の作製
    1. ガラス基板上に電気回路パターンを作製するために、最初のクレアいくつかの脱脂を使用してNAのガラススライドは、メタノール中で5分間、続いてアセトン中で5分間、続いて5分間の超音波洗浄器、内Alconoxなどの溶媒。それはよりゆっくりとアセトンを、基板ではなく、乾燥および残す残留物を吹き飛ばすことができるよりも蒸発するので、メタノールは、最後に使用されます。
    2. 180 L液体窒素デュワーからボイルオフによって生成された乾燥窒素ガスを用いてガラススライドの乾燥を吹く。
    3. 堆積チャンバ内に基板材料を導入する。チャンバは、ロードロックを用いて設計されている場合(これらのガイドラインは、スパッタリングシステムのためであるが、他の堆積技術を使用することができる。)、蒸着チャンバー内の真空度が著しく影響を受けない。 30ミリトールの圧力にロードロックから立ち退く。
    4. ロードロックとメイン堆積室との間のゲートバルブを開き、チャンバー内に基板を導入する。
    5. Arガスと圧力調整器の電源を入れ、希望depositioに圧力を制御n個の圧力。より高い圧力はより低い圧力がより速い堆積フィルムを接着収率ながら低いエネルギーは、金属原子、より均一な膜をスパッタさ与える。圧力の範囲は、20トルがうまく働いて、3ミリトール〜60ミリトールの間である。
    6. 金属は、その後、同調回路は、金属ターゲットにRF電力を導くために必要とされる100 WのRF電力を用いてコーティングから基板を保護するシャッターに投影される。 DC電力は、金属ターゲットの代わりにRFを使用することができる。ターゲットから酸化物層および汚染物質を除去するために、数分間プレスパッタ。
    7. シャッターを開けて、基板上に金属をスパッタリング。上記構成のための堆積速度は、毎分約10nmである。この速度は、マグネトロンカソードの作動距離、圧力、磁石の強さ、目標厚さとスパッタされた金属に依存するであろう。所望の厚さを達成するために、堆積時間を調整する。
    8. からコーティングされたガラススライドを削除するチャンバー。
    9. スピンナーを用いて、フィルムの表面にフォトレジストをスピンコート。多くのレジストを使用することができる。このケースでは、ポジ​​型フォトレジストを使用した。
    10. レジストを乾燥させるために5分間90℃で膜、ソフトベーク上にスピンコートした後、レジスト。
    11. レジストのにぴったりとそろえ装置の画像をコンタクトマスクを配置します。 UV光源は、フォトレジストを露光するために使用される。露出は10秒ですが、光源の強さに応じて変化し、使用されるレジスト。
    12. 投影された画像が表示されるまで、フォトレジスト現像液にフィルムを配置します。現像液を洗い流すことは、ポリマー結合の破壊を引き起こすUV光に露光したレジスト画像が表示された直後に、未露光のフォトレジストで作業から開発者を停止するためにDI水にフィルムを浸す。
    13. 乾燥窒素ガスを用いたドライフィルムブロー。
    14. 写真「ハードベーク」を15分間120℃のオーブンにフィルムを置き抵抗する。
    15. フィルムを冷却した後、フォトレジストで保護されていない金属がリフトオフするまで、エッチング溶液に配置します。水中でのディップは、エッチングを停止します。
    16. 硬化したフォトレジストを除去するためにアセトンですすいでください。
    17. メタノールですすぎ、乾燥窒素でブロー乾燥。
    18. コー​​ティングされたガラスは、準備ができたら、ガラス表面上に異なるタンパク質合金溶液を落とし、眼鏡上のタンパク質合金膜を得るために、少なくとも12時間乾かし。 (これは、最初の厚さのタンパク質合金膜を得るために5重量%の合金溶液を濃縮することが示唆されている。)
    19. による疎水性-親水性相互作用、金属薄膜が付着したタンパク質合金膜をガラス表面から転送される51面 。鉗子を用いてガラス基板から薄い金属パターンを有するタンパク質合金膜をはがし。
    20. 不溶性タンパク質合金材料を得るためには、awの60°Cの真空オーブン(25 kPa)の中にドライフィルムを配置チャンバーの底部に試合開始ディッシュ。オーブン内の空気を汲み出し、そして少なくとも2時間、水蒸気アニールサンプルう。真空を解除し、鉗子を用いて基板から水不溶性フィルムをはがす。
    21. そのような電気抵抗のようなタンパク質合金膜上に金属パターンの電気的性質をテストし、ガラス上の元のパターンと比較します。
  4. プロテイン合金による医薬品原料の作製
    1. 、医薬化合物とのタンパク質合金膜を製造する工程3.2に記載のように第一のPDMS基板を作製した。蒸留水によって形成されたPDMS基板を清掃してください。
    2. 溶解または水溶液中に医薬化合物を分散させる。均一に水と医薬化合物を混合するために超音波または渦を使用してください。化合物が水溶性でない場合、イオンを含まない蒸留水に均一な分布を有する粉末を分散させる。
    3. 所望の質量比を計算する化合物溶液の化合物溶液のx重量パーセントの量:化合物溶液のタンパク質合金溶液のx重量パーセントの量(ここでは1重量%の合金溶液を用いた)によるタンパク質合金に対する化合物。タンパク質合金膜中の所望の化合物濃度を有するフィルムを得るために、比率を選択する。
    4. ゆっくりとセクション2のプロセス2.16で同じ指示に従ってタンパク質合金溶液と化合物溶液を混合する。 (注:ゲル化を回避するために、混合中に解決策をultrasonicateかボルテックスしないでください)​​。
    5. PDMS基板上に混合物の計算された体積を注ぎ、医薬化合物の設計された比率を含む得るタンパク質合金膜を化学フード中に少なくとも12時間乾燥する。
    6. 物理的には3.2節のプロセス3.2.8で同じ命令の次のフィルムを架橋する。低密度(LD)または高(HD)濃度の不溶性のモデル薬物との合金膜の一例を図4に見ることができる

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Representative Results

(タンパク質Aおよびタンパク質Bとの間、例えば 、)は、典型的なタンパク質-タンパク質相互作用は、電荷-電荷(静電気)アトラクション、水素結合の形成、疎水性-親水性相互作用、ならびに特定の間の双極子、溶媒、対イオン、及びエントロピー効果を含めることができ2つのタンパク質のドメイン( 2)3。したがって、基本的に、私たちは、計算シミュレーションにより、これらの相互作用の効果を予測することができる。

図2
図タンパク質Aおよびタンパク質Bとの間の2相互作用は典型的には、これらの相互作用は、電荷-電荷(静電気)アトラクション、水素結合の形成、またはこれら2つのタンパク質の特定のドメインの間の疎水性-親水性相互作用に基づくことができる。

タンパク質合金システムは、これらのサブ合金のそれぞれが安定であると仮定される架橋タンパク質サブドメイン合金からなる材料としてモデル化することができる。タンパク質(AとB)との間の相互作用は異なる剛性を有する結合として考えることができる(この研究のためには、 図3の弱いまたは強い結合の2種類のみを考慮する)。弱い結合は、水素結合し、 図2に記載された他の結合を表すことができる。全体としてのタンパク質-合金は両方強いと弱い結合を介して一緒に囲まれた多数のサブ合金との間に二重のクロス結合を介して形成されている。サブ合金は、強い結合を用いて形成されるサブ合金内に私たちは、より弱い結合の形成を可能にする。全体としてタンパク質合金は、さまざまな強弱の結合を介して一緒に結合された多数のサブ合金との間の二重交差結合を介して形成されている。システムが十分に強調されている場合には、強弱両方の結合が破断されている。適切な条件の下では、弱い結合がに許可されてい再び結合を改革する。しかし、より強い結合が不可逆的に破裂されます。弱い結合の存在が外部応力36-41の下でその構造的完全性を維持する合金タンパク質を可能にします。この数値シミュレーションでは、格子ばねモデル36-41を通して、有限要素法に基づくボトムアップ·アプローチを通じて開発数学的モデルを使用しています。

図3
図3計算シミュレーション延伸シミュレーション中。延伸中のタンパク質合金系の機械的な利点を実証するために 、タンパク質(青色)の一つのタイプは、材料に超弾性を提供するスプリングのような弾性ネットワークを形成することができる別のタイプの一方タンパク質(緑色)は、材料のネットワークを安定化させるための強力な物理的な架橋剤を提供することができます。ダイナミックSTRUctural遷移( 例えば 、水素結合の形成及び変形が)を格納し、エネルギーを放出するか、延伸時に追加の機械的支持を提供するための別のドメインに誘導することができる。

図3は、延伸時(タンパク質BとしてのプロテインAおよび家畜桑絹のよう野生タッサーシルク付き)タンパク質合金系の機械的特性の典型的な計算機シミュレーションを示しています。タンパク質(緑色)の別のタイプの材料のネットワークのための強力な物理的な架橋剤を有する粒子としての役割を果たすことができる一方、延伸シミュレーション中に、タンパク質(青色)の一つのタイプは、材料に超弾性を提供するスプリング弾性ネットワークを形成することができる。動的構造転移( 例えば 、水素結合形成及び変形)を格納し、エネルギーを放出するか、延伸中に追加の機械的支持を提供するための別のドメインに誘導することができる。シミュレーション研究は​​、与えタンパク質の有用な対は、そのような異常な機械的弾性として、強く相互作用し、特定の特性を有するタンパク質合金材料を生成するためにピックアップすることができること、異なる構造タンパク質分子間の相互作用を理解するためのsa一般的な理論的な絵。

プロテインAおよびB(ここで、それらが野生絹および家畜絹である)が選択されると、一般的に、タンパク質合金溶液は、いくつかのステップ( 図4)で生成することができる。まず、天然繊維または粉末のようなタンパク質源は、クリーニングまたは精製されるべきである。例えば、脱ガムプロセスは、ほとんどの絹フィブロイン繊維20上に塗布されたタンパク質は、可溶性絹セリシンを除去するために使用することができる。第二に、適切な溶媒は、溶液中に不溶性のタンパク質源を溶解することが見出される必要がある。例えば、高濃度のLiBr溶液は異なる絹にβシート二次構造を切断​​し、溶液中に繊維を溶解する良溶媒である。第三に、透析法は、水溶液中のタンパク質分子を溶解する溶媒を除去し、回収するために使用することができる。追加の遠心分離は、溶液中の不純物および未溶解凝集物を除去することがしばしば必要である。最後に、異なるタンパク質水溶液は、さまざまな比率で穏やかに一緒に混合することができる。二つのタンパク質溶液がマクロ相分離していない場合、したがって、それらは強力な相互作用と一緒にブレンドし、別の生物医学的用途のための新たなタンパク質合金系が形成される。体内の不溶性タンパク質合金材料を作るために、異なる物理的または化学的架橋の治療は、適合させることができる。例えば、高温高圧水蒸気アニールは非常に異なる絹またはエラスチン材料6,52を架橋することが分かっている。異なるケラチン材料は、タンパク質側鎖53にそれらの天然のジスルフィド結合によって架橋することができるが。

Pいったんrotein合金溶液が生成され、検証され、それらは、熱的、機械的、光学的、電気的、化学的、または生物医学的応用( 図4)の材料マトリックスを含む調整可能な特性を有する生体材料の広い範囲に形成することができる。この記事では、これらの材料のための3つの新しいアプリケーションは、タンパク質合金生体材料のユニークな利点を実証する( 図4)選択されている。近代的な微細加工技術を通して、異なる表面パターンは、タンパク質合金材上のマイクロまたはナノスケール( 図4の光学アプリケーション)を発生させることができる。光回折パターンは、フィルム表面上に生成される場合、このフィルムは、異なる光学的パターン22,23にレーザ光 ​​を転送するための媒体として使用することができる。タンパク質合金材料は、酵素溶液中に出現した場合、フィルムの分解プロファイルは、フィルムからのリアルタイム回折パターンを比較することによって理解することができる元のパターンで(代わりに前後に洗浄し、空気中で分解さのフィルムを検査する)。別の新興技術は、コートの異なるマイクロスケール回路およびタンパク質合金材料のワイヤレス共振器( 図4の電気的アプリケーション)である。この技術によって、in vivoでの損傷した組織または器官の微小電流は、直接医師24,51に転送される無線信号をモニターすることができる。体内の材料の機械的靭性および生体耐久性、容易比率および材料の特定のタンパク質成分をブレンドすることによって制御することができる。最後に、異なる可溶性または不溶性の抗癌剤は、直接タンパク質合金材料( 図4化学アプリケーション)に組み込むことができる。抗がん剤は、多くの場合、非常に毒性であり、がん細胞だけでなく、正常なヒト免疫系だけでなく、損傷します。したがって、体内で一日あたりのがん薬物送達の領域および用量を制御すること、tの一つである彼製薬科学において最も重要なトピック。タンパク質合金材料に癌薬を組み込むことを通じて、唯一の癌組織または器官に物質を注入することができ、およびタンパク質成分を制御して、混合比によってタンパク質合金ネットワークから日当たり癌薬物の放出速度を制御する。タンパク質マトリックスは完全に生分解性であるので、タンパク質合金材料は、自動的に、薬物放出期間の後に体内酵素によって除去される。タンパク質合金材料の残留物は、純粋に自然に、インビボで他の必須タンパク質を産生するために体内に吸収され得るアミノ酸である。移植されたタンパク質の合金材料から癌薬の制御放出によって硬化を得る患者は、最終的に体内の添加剤なしに回収し、天然タンパク質合金マトリックスと癌薬の両方を効率的に、この硬化プロセス中に体内に吸収される。

、タンパク質水溶液から溶解する溶媒を除去するdianalysizing、溶液に不溶性のタンパク質材料を溶解し、遠心分離し、異なる比で一緒に混合し、洗浄を含むまたはタンパク質材料源を精製タンパク質合金材を製造するために、図4の一般的な手順、および物理的または化学的処理を架橋する。タンパク質合金ソリューション、その後、熱的、機械的、光学的、電気的、化学的、または生物医学的応用のための材料マトリックスを含む調整可能な特性を有する生体材料の広い範囲に形成することができる。 拡大版を表示するには、ここをクリックしてくださいこの図の。

ここでは、proteに電気材料を製造する方法の重要な手順を示した図5の細部との合金で、このような電気回路のような薄い金属膜蒸着、パルスレーザ堆積、又はスパッタリングを含むいくつかの異なる堆積技術を使用して作成することができる。それはガス圧とカソードのサイズを調整することにより、陰極ならびに堆積均一に適用されるスパッタガス圧とパワーの調整を介してスパッタリング種のエネルギーに大きな柔軟性を提供するので、スパッタリングは、現在の研究のために選択した。スパッタ堆積は、ガラス基板( 図5A)上に金属膜を投影するために使用することができる。この場合、Agの回路フィルムは、約1×10 -7 Torrのベース圧力に高真空チャンバ内で堆積させた。アルゴンスパッタガスは、20ミリトールの圧力でチャンバに導入し、Agが基板表面から8cmで2インチの平面型マグネトロンカソードから20分間100 WのRF発生器を使用して堆積させた。デバイスはデフですINED湿式化学エッチングに続いて、ガラス上の膜に一般的なフォトリソグラフィ技術を用いて( 図5Aにおける詳細な手順を参照してください)。デバイスはまた、タンパク質膜上に直接物理的マスクを通して堆積によって定義することができる。タンパク質フィルム上の電気回路の室温での電気抵抗率は、両方の二端子と四端子法を用いて測定された。四端子アプローチの利点は、測定値から接触抵抗を排除することであるが、私たちは、接触抵抗がので、2つの端子測定が十分であるか重要ではないことを見つける。 2端子測定は、金属線の両端(模式的に図5Bに示されている)でのフィルムとオームのスケールを作る接点に設定された良質のマルチメータを使用しています。この測定では、マルチメータは、電流源と電圧計と測定された抵抗の両方が現在で分圧された電圧をそのまま提供しています。抵抗率を用いて計算されるρ= Rは抵抗であり、RA / lは、Aは、ワイヤの断面積であり、lは、プローブ間の距離である。ここで作成するために、Rは、 図5B(R =ΔVoltage/ΔCurrent)における電圧-電流曲線の勾配を使用して23.5Ωであることが測定された、lは4.45×10 -2 mとし、Aは6.685×10であることが見出された-10 m 2ある 。これらの数値を用いて、3.6×10 -7Ω·mでの抵抗率は、バルク銀金属(1.6×10 -8Ω·m)でのそれよりも約20倍も大きく、フィルムのために発見された。バルクと比較して膜中に測定された高い抵抗率に起因既に拘束電流経路と欠陥を回避するために電荷キャリアのできないことが典型的である。ヒートガンで金属を加熱して金属伝導の特性フォノンによる電子散乱率の増加を示し、その抵抗を増加させた

「図5」のfo:コンテンツ幅=は、(a)コーティングされていない顕微鏡スライド:タンパク質合金膜上(例として野生タッサーシルクや桑絹ブレンドフィルム上に、ここで銀回路)の電気回路を作るために、図5(A)手順(b)は、2フィートの直径のターゲットからのスパッタ堆積中の銀プラズマ; (c)は銀コーティングされたガラススライド; (d)は、フォトレジストを追加する前に、真空チャックを使用して、スピナーに開催されたシルバーコーティングされたサンプル; (e)のフォトレジストが塗布されたシルバーのスライドは、120℃でソフトベークオーブンに入れ; (f)は、フォトレジスト中のポリマー結合を破壊するためにUV放射線に公開; (g)は、フォトレジストを開発すること。ハードベーク酸でエッチングするための準備をレジストを(H); (i)と、次いで水浴中ですすぐことによって、エッチングを停止する、酸エッチ; (j)がスライドを乾燥; (k)をスライド上にキャストタンパク質合金溶液; (l)の乾燥タンパク質の膜への転送銀パターンを、(B) -7Ω、周りを測定する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
ブレンドされたタンパク質系の混和性を検証するための、図6の熱解析モデル。プロテインA及びBは、個別の単一のガラス転移温度は、それぞれT gを (A)およびT gの(B)、(緑及び青の曲線)、完全に混和性がある場合タンパク質合金系は、AおよびB(赤の曲線)のT g秒と異なる唯一のガラス転移を示すであろう。それ以外の場合は、タンパク質sが2つと複合材料は、ガラス転移(オレンジ色の曲線)にシフト非混和性のT g(A)およびT gの(B)(黒色の曲線)の両方との混合物、または半混和性である。

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Discussion

「合金」は、タンパク質生産システムの中で最も重要な手順の一つは、ブレンドされた蛋白質の混和性を検証することである。それ以外の場合は、安定した波長可変特性なしのみ非混和性タンパク質混合物またはタンパク質複合システムである。実験的な熱分析法は、この目的のために使用することができ、それらの合金特性を確認するため。タンパク質-タンパク質相互作用は、フローリー·ハギンズの格子「溶媒」との間の相互作用としてモデル48(主要なタンパク質成分)および「溶質」(マイナーなタンパク質成分)に応じて見ることができる。このモデルに基づいて、「溶媒」と「溶質」との間の混合の間の自由エネルギー変化は、ブレンド48の混和性を支配する。一般的に、混和性の三つの異なる程度がある:(a)は完全に混和性(巨視的形態一相物質)、(b)は、準安定(フォームが半混和性材料中の相)、及び(c)の非混和性は、(個別のプロテインA及びBドメイン)3,48と元の2相のままである。これに対応して、二つのタンパク質系のガラス転移挙動はこれらの違いを実証することができ、理想的には相図のモデル( 図6)を使用して表すことができる。プロテインAおよびBは、それらの個別の単一のガラス転移温度、T gを (A)およびT gの(B)であった( 図6、緑、青の曲線)を有している場合、完全に混和性タンパク質合金系は、1つのガラス転移を示すはずである加熱中。この単一のガラス転移は、T A及びB( 図6)の間に、通常、中間体である。そうでなければ、タンパク質は非混和性ブレンドを形成することができることにより、T gは 、両方の(A) そして T gは (B)は、元の位置( 図6)に表示されます。タンパク質はまた、半混和2で示されるシステムガラストランシフトを形成することができるsitions( 図6)。完全に混和性タンパク質「合金」システム(フォームワンのガラス転移)の具体例を図4(熱アプリケーション)9シルク·トロポエラスチンブレンド試料のDSCスキャンで見つけることができます。シルク含有量の減少に伴って、ブレンドのガラス転移温度(T g)は 190°C(純粋トロポエラスチン)9を178°C(純粋な絹)から次第に増加し、まだ一貫して全てのタイプの均質な単一のガラス転移を保つブレンド。フローリー·ハギンズのモデルによれば、これは、さまざまな混合比のすべてのシルクトロポエラスチンのブレンドは安定であり、完全に任意のマクロ相分離せずに混和性タンパク質合金であることを示している。

結論として、タンパク質合金材料の新世代を製造することができ、制御されたマグロと異なる医療デバイス( 例えば 、フィルム、縫合糸、ネジ、プレート、マイクロニードル、ゲル)に加工BLE光学的、電気的、化学的、熱的、および機械的特性。混合成分および比率を制御することによって、そのような弾性、強度、表面粗さ、表面電荷、生体耐久性および化学的活性などのタンパク質合金材料のさまざまな生物物理学的特性は、最終的に組織の機能に影響を与えるだけでなく、局所的な細胞性があり、操作することができるこれらの材料に関連した行動。さらに、タンパク質は「プログラマブル寿命の性質のため、 生体内でこれらの合金材料のための実行可能なプラットフォームとなる。このような利点は、ポストリペア外科用回収を回避することができ、将来的に移植可能な医療デバイスのための新規のオプションを提供することができます。これらのタンパク質の合金の生体材料はまた、調整可能な生物学的機能や特性を持つ、と組織コンプライアンスおよび関連ニーズにマッチした医療機器を製造するための新たな経路を提供するであろう。この記事では、これらのデバイスを製造する方法については一般的なプロトコルのレビューを提供し、複数の生物医学の分野で科学者や臨床医の両方に利益をもたらすだろう。

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Disclosures

利害関係が宣言されていない。

Acknowledgments

著者らは、この研究をサポートするためローワン大学に感謝します。タフツ大学のXHも感謝デビッドL.カプランと前の技術的なトレーニングのためのNIH P41ティッシュ·エンジニアリングリソースセンター(TERC)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

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