Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mengen is een efficiënte benadering van biomaterialen met een breed scala van eigenschappen en gecombineerde functies te genereren. Door het voorspellen van de moleculaire interacties tussen de verschillende natuurlijke zijde proteïnen, kunnen nieuwe zijde-zijde eiwit legering platforms met instelbare mechanische veerkracht, elektrische reactie, optische transparantie, chemische verwerkbaarheid, biologische afbreekbaarheid, of thermische stabiliteit worden ontworpen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vezeleiwitten scherm verschillende sequenties en structuren die zijn gebruikt voor diverse toepassingen in biomedische gebieden zoals biosensoren, nanogeneesmiddelen, weefselregeneratie en geneesmiddelafgifte. Het ontwerpen van materialen op basis van de moleculaire schaal interacties tussen deze eiwitten zal helpen bij het genereren van nieuwe multifunctionele eiwit lichtmetalen biomaterialen met instelbare eigenschappen. Dergelijke legeringen materiaalsystemen voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren geven ook samen met de materialen biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en houdbaarheid in het lichaam. Dit artikel gebruikt de proteïne mengsels van wilde tussahzijde (Antheraea pernyi) en binnenlandse moerbei zijde (Bombyx mori) als een voorbeeld om bruikbare protocollen met betrekking tot deze onderwerpen, met inbegrip van hoe je eiwit-eiwit interacties te voorspellen door computationele methoden, hoe eiwitten legering produceren bieden oplossingen, hoe lichtmetalen systemen te verifiëren door middel van thermische analyse, en hoe variabel legering materialen te fabricerenwaaronder optische materialen met diffractie roosters, elektrische materialen met circuits coatings en farmaceutische materialen voor afgifte van geneesmiddel en de levering. Deze werkwijzen kunnen belangrijke informatie voor het ontwerpen van de volgende generatie multifunctionele biomaterialen op basis van verschillende eiwitten legeringen.

Introduction

De natuur heeft strategieën ontwikkeld om afstembare en multifunctionele biologische matrices met een beperkt aantal structurele eiwitten produceren. Zo worden elastins en collagenen altijd samen in vivo de verstelbare sterke en functies voor specifieke weefsels 1,2 verschaffen. De sleutel tot deze strategie is het mengen. Mengen het mengen eiwitten met specifieke verhoudingen en is een technologische benadering van eenvoudige materiële systemen met instelbare en gevarieerde eigenschappen 3-5 te genereren. In vergelijking met synthetische strategieën 6,7 techniek kan ook mengen materiaal uniformiteit en de mogelijkheid om het materiaal verwerken vanwege het bedieningsgemak 8-16 verbeteren. Daarom is het ontwerpen van multifunctionele, biocompatibele eiwit legeringen is een opkomend gebied van medisch onderzoek. Deze technologie zal ook een systematische kennis van de invloed van natuurlijke proteïne matrices geven op cel-en weefsel functies, zowel in vitro en in vivo 10,17. Door het optimaliseren moleculaire interfaces tussen verschillende eiwitten kan-eiwit gebaseerde legeringen diverse lichaamsfuncties, zoals thermische stabiliteit bij verschillende temperaturen, elasticiteit diverse weefsels, elektrische gevoeligheid ondersteunen variabele organen en optische eigenschappen cornea weefselregeneratie 3 omvatten, 18-27. De uitkomst van deze studies zal een nieuw eiwit-materialen platform op het gebied van de biomedische wetenschappen bieden directe relevantie voor afstembare weefsel reparaties en ziekte behandelingen en verder leiden tot biologisch afbreekbare implantaten waar hun nieuwe therapeutische en diagnostische functies kunnen worden voor ogen 3.

Veel natuurlijke structurele eiwitten hebben kritische fysieke en bioactieve eigenschappen die kunnen worden benut als kandidaten voor het biomateriaal matrixen. Zijde uit verschillende soorten wormen, keratines van haren en wol, elastins en collageen uit verschillende weefsels, endiverse plantaardige eiwitten zijn enkele van de meest voorkomende structurele eiwitten gebruikt voor het ontwerpen van niet-eiwit gebaseerde materialen (Figuur 1) 18-27. In het algemeen kunnen deze eiwitten moleculaire secundaire structuren (bijvoorbeeld beta sheets voor zijde, of gewikkelde spoelen voor keratine) vanwege hun unieke repetitieve primaire aminozuursequenties 3,28-35 vormen. Deze eigenschappen bevorderen de vorming van zelf-geassembleerde macroscopische structuren met unieke functies op biologische interfaces gevraagd hun nut als een waardevolle bron van biopolymeermaterialen. Hier zijn twee soorten structurele eiwitten werden gebruikt (eiwit A van wilde tussahzijde en eiwit B van gedomesticeerde moerbei zijde als voorbeeld) om de algemene protocollen van de productie van verschillende eiwitten lichtmetalen biomaterialen demonstreren. De protocollen aangetoond onder deel 1: eiwit interactie voorspellingen en simulaties, deel 2: de productie van eiwitten legering oplossingen, en deel 3: productie van eiwitten legeringen systemen voor optische, elektrische en farmaceutische toepassingen.

Figuur 1
Figuur 1 Grondstoffen van verschillende structurele eiwitten die vaak worden gebruikt in ons laboratorium voor het ontwerpen-eiwit gebaseerde materialen, waaronder zijde uit verschillende soorten wormen, keratines van haren en wol, elastins uit verschillende weefsels, en diverse plantaardige eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Voorspelling van Protein Interactions

  1. Bioinfomatics Analyse van eiwitmoleculen
    1. Bezoek het National Center for Biotechnology Information website (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), en zoek het eiwit namen die gebruikt zal worden voor de legering studie. Opmerking: In dit voorbeeld werden twee eiwitten gebruikt: proteïne A, dat de wild tussahzijde fibroin en eiwit B, die de interne moerbei zijdefibroïne. Voor eiwit A, kan het aminozuur sequenties gevonden worden in "fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi is de Chinese (Eik) Tussah Mot). Voor eiwit B, kan het aminozuur sequenties gevonden worden in "fibroin zware keten voorloper [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001106733.1" en "fibroin lichte keten voorloper [Bombyx mori] NCBI Reference Sequence: NP_001037488.1" samen (Bombyx mori is de gedomesticeerde zijderups van de moerbeiboom).
    2. Selecteer en save de aminozuursequenties van de eiwitten A en B eiwit uit de database.
    3. Bezoek de ExPASy website (de SIB Bioinformatics Resource Portal) (www.expasy.org) of gebruik andere commerciële software de basis bioinfomatics gegevens van eiwitten berekenen op basis van de sequenties waaronder, maar niet beperkt tot, totale lading per molecule, hydrofobiciteit index het molecuul titratie curve van de moleculen bij verschillende pH-waarden, etc. Deze informatie wordt gebruikt als basiselementen voor de computersimulatie van eiwit interacties en helpt te begrijpen of deze twee eiwitten hebben sterke interacties. [Opmerking: Deze stap is niet juist voor elk detail van het eiwit interactie zoals die gebruikt worden in kleine peptiden of functionele eiwitten wetenschap voorspellen. Het doel van dit gedeelte is alleen om te voorkomen dat de productie van een proteïne mengsel met duidelijke macrophase scheidingen die niet een "legering" materiaal kan worden genoemd. Daarom kon de schatting bij benadering, maar ste zijne eiwit legering systeem kan worden gecontroleerd door een experimentele methode in stap 3.1 wordt beschreven met behulp van nauwkeurige thermische analyse].
  2. Computationele Simulatie van Protein Alloy systeem
    Hier wordt beschreven een werkwijze voor het eiwit legering te simuleren. Een simulatie programma is geschreven in C programmeertaal die kan worden gebruikt op een of multiprocessor computersysteem. Een rooster-veer-massa (LSM) model gebruikt om de legering eiwitten 36-39 simuleren. De LSM-model geeft een eenvoudige beschrijving van de netto kracht op een massa wanneer bevestigd aan een veer en kan men de kracht vergelijking om de beweging voor elke massa begrijpen lossen. Een eenvoudig programma algoritme om dit eiwit legeringssysteem modelleren met de LSM model als volgt gegeven:
    1. Vormen een eiwit als grofkorrelige deeltjes een massa m heeft.
    2. Gebruik een Hookean of een neo-Hookean voorjaar om een band 38,39 vertegenwoordigen. Door onderlinge verbinding van een eindig aantal deeltjes met veren, kan men make een sub-legering domein dat een stabiele bouwsteen van de legering-eiwitten vertegenwoordigt. Om verschillende soorten van obligaties in de intra-koppeling vertegenwoordigen, maken gebruik van verschillende veerconstanten / stijfheid.
    3. Modelleren het eiwit legering systeem als een materiaal bestaande uit dof-verknoopt sub-legeringen. Hier weer verschillende stijfheden werden gebruikt om verschillende banden tussen de verwevenheid van de sub-legeringen vertegenwoordigen.
    4. Het model van de band te breken en hervormingsproces door een Bell Model 40,41, waardoor zwakke bindingen mogen worden hervormd, maar sterke banden kan niet hervormen als ze eenmaal zijn gebroken. Wanneer het systeem voldoende wordt benadrukt (zowel op de intra-en inter-suballoy suballoy obligaties), kunnen obligaties worden gebroken en hervormd.
    5. Om vervorming effecten te onderzoeken van de legering-eiwitten wanneer ze gestresst, externe krachten toegepast op het systeem. Bij het oplossen van de kracht vergelijking (De wetten van Newton) verdelen deze krachten ook voor elk deeltje.
    6. Voor het modelleren van interactiestussen de oplossing (bijvoorbeeld water moleculen) en eiwitten, breng een extra sleepkracht of wrijvingskracht elk deeltje.
    7. Los de kracht vergelijking voor elk deeltje met de acties van elke kracht (de veerkracht van de obligatie, de externe kracht, en de wrijvingskracht).
    8. Bereken en extraheer de posities van de eiwitdeeltjes als functie van de tijd.
    9. Bereken de fysische grootheden die de legering-eiwitten te karakteriseren van de posities van de deeltjes.
    10. Wijzig de binding stijfheid in het programma interacties tussen verschillende eiwitten begrijpen. (De gemiddelde binding stijfheid wordt berekend op basis van de Young's modulus van het eiwit materialen. De Young's modulus van verschillende vezelig eiwit materialen kunnen worden verkregen, hetzij door Universal Trekproef 18, of rechtstreeks bij de vorige literatuur 2-4,18).

2 Productie van eiwit Alloy Solutions

Wild tussahzijde (proteïne A) en binnenlandse moerbei zijde (eiwit) worden hier geselecteerd als een voorbeeld van eiwit legering systeem. Dit protocol geeft eerst hoe je de wilde tussahzijde (proteïne A) oplossing te verkrijgen.

  1. Snijd rauwe wilde tussah zijdecocons of vezels bij een gewicht van 3 g.
  2. Maatregel 3 g natrium bicarbonaat of natriumcarbonaat (Opmerking: Bij gebruik van natriumcarbonaat, zal het molecuulgewicht van eiwitketens tijdens het kookproces 42 verminderen).
  3. Vul een 2 L bekerglas met gedestilleerd water (H2O). Plaats vervolgens het bekerglas op een hete podium, dek het af met aluminiumfolie en warmte aan de kook.
  4. Verwijder de aluminium folie deksel en voeg de gemeten natrium butyldicarbonaat langzaam in het kokende water, zodat het volledig oplossen. (Opmerking: De rol van natrium bicarbonaat is de "soap" schoon te maken uit aangesloten op het oppervlak van wilde zijde vezels oplosbare sericine eiwitten en andere onzuiverheden Bij gebruik oth.re aard eiwit vezels, selecteer dan corresponderende chemische middelen volgens de literatuur).
  5. Voeg de rauwe eiwit vezels (wilde zijde vezels) in het kokende water en laat koken gedurende 2-3 uur (Let op:. De kooktijd heeft kritische impact op het molecuulgewicht van eiwitketens 26,43 Men moet een geschikt moment te selecteren op basis de literatuur of door het uitvoeren van controle-experimenten 26,43. De kooktemperatuur kan ook worden aangepast om het molecuulgewicht van de eiwitketens 26,43,44) beïnvloeden.
  6. Na het koken zorgvuldig de eiwitvezels verwijderen met een spatel uit de oplossing en knijp ze om het overtollige water te verwijderen. (LET OP: De vezels zijn zeer heet!)
  7. Vervolgens dompel de vezels in een 2 L beker met koud gedestilleerd water, en was de vezels tweemaal gedurende 30 min elk met de onzuivere residu volledig van het vezeloppervlak. Droog de vezels in een zuurkast gedurende ten minste 12 uur.
  8. Smelt 45,784 g calcium nitrate (Ca (NO 3) 2) in een bekerglas op een vloeistof bij 65 ° C te vormen voor het oplossen van de wilde zijde eiwit vezels. (Opmerking: als u andere natuurlijke proteïne vezels, kiest u een overeenkomstige oplosmiddel om de eiwitten te ontbinden Hier kunt u ook 9,3 M LiSCN of LiBr oplossing, of een 85% fosfaat-oplossing voor het oplossen van verschillende zijde vezels te gebruiken..)
  9. Combineer de vezels en het oplosmiddel in een verhouding van 1 g vezel in 10 ml oplosmiddel. Laat de vezels oplossen bij 95 ° C gedurende 5 tot 12 uur. (Opmerking: De oplostijd is afhankelijk van het molecuulgewicht van eiwitten 26,43-45)
  10. Met behulp van spuiten, injecteer de wilde zijde oplossing in 12 ml dialyse cassettes (maximaal 1.000 MW als de cutoff-formaat) of in een verzegelde dialyse buizen (maximaal 1.000 MW als de cutoff grootte) en dialyseren tegen 2 L gedestilleerd water. (Opmerking: De injectie efficiëntie kan handhaven van de oplossing bij 35 ° C, omdat anders de viscositeit eiwitoplossing dramatisch toenemen bij kamertemperatuur). Verander het gedestilleerd water regelmatig om Ca verwijderen (NO 3) 2 oplosmiddelen in de oplossing (na 30 min, 2 uur, 6 uur, en vervolgens elke 12 uur gedurende 3 dagen. In totaal zullen er ongeveer 8 veranderingen water).
  11. Na 3 dagen, verzamel de eiwitoplossingen van de dialyse cassettes of buizen en het in een 13.000 rpm beoordelingscijfer buizen.
  12. Centrifugeer de oplossing gedurende 1 uur bij 3500 rpm bij 4 ° C 3x tot afzettingen te verwijderen. Na elke centrifuge draaien, trek snel de bovenstaande vloeistof in nieuwe buizen. Bewaar de uiteindelijke oplossing in een 4 ° C koelkast.
  13. Giet 5 ml eiwit oplossing op een polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat of ander plat hydrofoob substraat en laat het goed drogen (dit duurt meestal meer dan 12 uur). Weeg de resterende vaste eiwit film en bereken de uiteindelijke oplossing concentratie gewichtspercentage (w / v%) = gemeten gewicht (in mg) ÷ 5 (in ml) ÷ 10.
  14. Verzamel een andere geselecteerde natuurlijke eiwit vezels (in dit case werd geacclimatiseerd moerbeizijde als het eiwit B), en herhaal bovenstaande proces met een geschikt "soap" en oplosmiddel zijn, totdat de uiteindelijke eiwit wateroplossing met gemeten concentratie wordt verkregen. [Opmerking: Als het eiwit materialen zijn in de vorm van poeder, gebruik dan een geschikte poreuze buizen of membranen om de monsters te houden tijdens de "inzepen" proces. Als het eiwit reeds gezuiverd, eens stap 2.8 het poeder oplost. Indien het proteïne al gezuiverd en is wateroplosbaar, maak waterige oplossing met een gewenste concentratie eerst en dan naar beneden naar stap 2.15 mengsel eiwitoplossingen maken.]
  15. Langzaam verdunnen de Proteïne A oplossing (here wild zijde oplossing) in gedestilleerd water bij 4 ° C een 1,0 gew% eiwit vormen een waterige oplossing. Doe hetzelfde proces voor eiwit B (hier gedomesticeerd zijde).
  16. Roerend de 1 gew% proteïne A oplossing B Protein oplossing bij 4 ° C met behulp van een pipet om p vermijdenrotein aggregatie tijdens het mengen. (Opmerking 1: niet een vortex instrument te gebruiken om de eiwitten te mengen, omdat sommige eiwitten (bijvoorbeeld zijde) hydrogels zal vormen tijdens de trilling 46,47 Opmerking 2:. Indien mogelijk, gebruik van extra apparaten op de mengverhouding en het mengen van grootte, waardoor controle ervoor om ze te mengen zo langzaam mogelijk om aggregatie te voorkomen. Laat snel niet de oplossing pipet tijdens het mixen).
  17. De uiteindelijke mengen oplossingen moeten een bepaalde massaverhouding of een molaire verhouding van Proteïne A zijn: Protein B. Doorgaans mengen met massaverhouding van 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 verkrijgen een breed spectrum van legering oplossingen. Gebruik zuivere eiwit A en eiwit B oplossingen als controlegroep. Voor een menging oplossing met een molaire verhouding van Proteïne A: Proteïne B = R: (100-R). Bereken het mengen volumeverhouding (gebaseerd op eenzelfde 1 gewichts% oplossing) door: deel A: Deel B = R · (MW A): (100 R) · (MW B).
  18. Onmiddellijk wierp de laatste oplossingen op PDMS substraten om films of andere desi vormenbestaande situaties materialen. (Opmerking: hoge concentratie eiwit legering oplossingen niet gedurende langere tijd meer aggregaten vormen later door de eiwit-eiwit interacties in water.). Indien nodig, verdunnen het mengsel oplossingen met-ion vrij gedestilleerd water en bewaar ze op een 4 ° C koelkast om extra proteïne aggregatie in oplossingen te vermijden.

3 Fabrication van Variable Protein Alloy Materials

  1. Bevestig Alloy Voorspelling door Thermal Analysis 3,9,31-35
    1. Bereid PDMS substraten en maak ze schoon door het weken in gedestilleerd water.
    2. Wierp het eiwit mix oplossingen met verschillende mengverhoudingen op de PDMS substraten.
    3. Droog de oplossingen voor ten minste 12 uur in een chemische kap met luchtstroom tot films worden gevormd (Let op: Gebruik dezelfde volume voor verschillende oplossingen zodat de dikte van de films kunnen worden vastgesteld).
    4. Verwijder het eiwit legering films uit de PDMS substraten en leg ze op een schone vaat.
    5. Weeg veel Differential Scanning Calorimetrie (DSC) aluminium pannen en deksels voor DSC studie. Overeenkomen met de pan en het deksel paren een gelijk totaal gewicht hebben (gewicht van de pan plus het gewicht van het deksel is gelijk aan een constant gewicht). Bijvoorbeeld, hier een totaal gewicht van het deksel en pan 22,50 mg werd gebruikt, en acht sets van deksel en pan combinaties met dit totaalgewicht bereid.
    6. Kapselen 6 mg elke soort gedroogd eiwit past in aluminium DSC pannen en verzegelen ze met hun afgedekte deksels in proces 3.1.5. Verbinding een lege pan en het deksel pair voor gebruik met het monster als referentie zodat alleen de warmtecapaciteit monsters zelf zullen tijdens de thermische analyse (NB opgenomen: De DSC wordt de warmtecapaciteit van referentie pan + deksel tegen dat vergelijk van het monster + pan + deksel. Vanwege de gelijke gewichten, zal de achtergrond warmtecapaciteit van de pannen en deksels worden verantwoord waardoor alleen de warmtecapaciteit van het monster in de pan).
    7. Zet verzegeld referenties en monster pannen in een DSC-instrument, metdoorgeblazen droog stikstofgas van 50 ml / min, en voorzien van een gekoelde koelsysteem. Voordat het monster metingen moet de DSC instrument eerst gekalibreerd met saffier en indium warmtestroom en temperatuur respectievelijk.
    8. Voorlooptijd de DSC met een verwarmingssnelheid van 2 K / min tot 150 ° C en houdt bij deze temperatuur gedurende 15 min om alle resterende watermoleculen in de monsters (typisch ongeveer 3-10% van het totale gewicht) te verwijderen. Snel afkoelen (10 K / min) tot 25 ° C.
    9. Voer de DSC opnieuw bij een verwarmingssnelheid van 2 K / min tot 300 ° C, of tot de achteruitgang piek van eiwit mengsels weergegeven 34. Noteer de warmtecapaciteiten van het eiwit monster bij verschillende temperaturen tijdens dit proces. Afkoelen DSC en oude monster veranderen in nieuw monster met een andere mengverhouding.
    10. Berekenen en plotten de warmtecapaciteit versus temperatuur curves voor elk eiwit mix monster met behulp van de DSC-software 31-35.
    11. Oordelen over de miscibility eiwit blends door de volgende werkwijze (zie Figuur 4 Thermische en figuur 5) en als de twee eiwitten volledig mengbaar, ook genaamd "eiwit legeringen". Anders wordt de term "eiwit composiet" zou een geschikte naam zijn volgens polymeer beschrijvende theorieën 48,49):
      1. De afzonderlijke eiwitten A en B moeten individuele regeling glasovergangen temperatuur, Tg (A) en Tg (B) (De groene en blauwe curven in figuur 5) 3,48 hebben;
      2. Deze enkele glasovergangstemperatuur doorgaans tussen die van de twee individuele eiwitcomponenten, Tg (A) en Tg (B) (zie Figuur 5) 3,48;
      3. Mengbare mengsels fasescheiding wordt verkregen als zowel Tg (A) en Tg (B) bleek hun oorspronkelijke positie (figuur 5), en met elke Tg staphoogte in verhouding tot de samenstelling, de twee eiwitten volledig mengbaar 3,48.
      4. Semi-mengbare composietmengsel type zal een zeer breed glasovergangstemperatuur hebben, of kunnen nog twee glasovergangen, maar elk heeft dichter bij elkaar ten gemigreerd naar de pure eiwitcomponenten, Tg (A) en Tg (B) ( zie figuur 5). In dit geval kunnen er micro-heterogene fase structuren gevormd tussen de twee eiwit componenten, en de samenstelling kan variëren van plaats tot plaats.
    12. If (3.1.11.1) is het in DSC geval, en kan worden bevestigd dat het eiwit AB is een legering systeem, dan naar eiwit legeringen fabriceren.
  2. Fabricage van optische materialen door Protein Alloys
    1. Produceren (in de fabricage lab) of de aanschaf van een ontworpen topografische ondergrond voor het gieten. In dit specifieke voorbeeld, een glas met vier diffractiepatronen werd gebruikt (figuur 4Optisch).
    2. Plaats het glas met diffractie patronen in een schaal, en zorg ervoor dat het oppervlak met patroon wordt opwaarts geconfronteerd.
    3. Verdeel PDMS oplossing gelijkmatig op het glas en de oppervlakte patronen volledig bedekken (PDMS De oplossing wordt door ingieten en katalysatoroplossing in een 9: 1 mengverhouding volgens de gebruiker instructies 23,44).
    4. Plaats het gieten schaal in een 65 ° C oven gedurende ten minste 2 uur terwijl op een vlakke ondergrond. De PDMS oplossing, drogen in een vast substraat tijdens dit proces.
    5. Verwijder PDMS substraat uit het glas. De diffractiepatronen moet nu naar de PDMS oppervlak.
    6. Pons de PDMS mallen met diffractie patronen met behulp van een geschikte perforator.
    7. Drop eiwit legering oplossingen op de PDMS oppervlakken diffractiepatronen en drogen gedurende ten minste 12 uur folies met diffractiepatronen te verkrijgen.
    8. Onoplosbare eiwitten legeringen te verkrijgen, plaatst u de gehele set van dry films, waaronder de PDMS mallen in een 60 ° C vacuümoven (25 kPa) met een waterbak op de bodem van de kamer. Pomp lucht in de oven, en laat het water dampen gloeien monsters gedurende minstens 2 uur. (Dit proces heet temperatuurgestuurde waterdamp gloeien 45. Vergelijken met de veel gebruikte methanol methode, kan het vergelijkbaar beta-sheet-gehalte in de zijde materialen 45 genereren). Hef het vacuum op en trek het niet in water oplosbare film van de PDMS substraat met behulp van een tang. In dit voorbeeld zijn wild-zijde geacclimatiseerd zijde legeringen gebruikt.
    9. Test de kwaliteit van diffractiepatronen van films door vergelijking met de originele patronen op het glas (bijvoorbeeld verzamelen SEM afbeeldingen voor de micro-schaaldetails, verzamel laser diffractie patronen voor het algemene patroon kwaliteit).
  3. Fabricage van elektrische schakelingen op Protein Alloys Materials
    1. Om een ​​elektrisch circuit patroon op glas substraat fabriceren, eerste cleana glasplaatje met een ontvettingsmiddel zoals Alconox in een ultrasoon reiniger voor 5 min, gevolgd door 5 min in aceton, gevolgd door 5 min in methanol. De methanol wordt de laatste gebruikt, omdat het verdampt langzamer dan aceton, zodat kan worden afgeblazen de ondergrond in plaats van drogen en resten achter te laten.
    2. Blaas het glaasje droog met droog stikstofgas dat wordt gegenereerd door de kook-off van een 180 L vloeibare stikstof Dewar.
    3. Introduceer het substraat materialen in de afzettingskamer. (Deze richtlijnen zijn voor een sputterende systeem, maar andere depositie technieken kunnen worden gebruikt.) Als de kamer is ontworpen met een loadlock, wordt het vacuüm in de afzettingskamer niet significant beïnvloed. Evacueren de loadlock tot een druk van 30 mTorr.
    4. Open de afsluiter tussen de uitvoerlaadsluis en de belangrijkste afzettingskamer en introduceren het substraat in de kamer.
    5. Zet het Ar gas en de drukregelaar en de controle van de druk om de gewenste deposition druk. Een hogere druk geeft een lager energieverbruik sputterde metaalatomen en meer uniforme films, terwijl een lagere druk tot betere aanhangen sneller gedeponeerde films. Het gebied van drukken is over het algemeen tussen 3 mTorr en 60 mTorr, met 20 mTorr goed werken.
    6. Metalen worden dan geprojecteerd op een sluiter die het substraat bekleden met een RF vermogen van 100 W. tuning circuit nodig om het HF-vermogen aan de metalen doel richten beschermt. DC voeding kan worden gebruikt in plaats van RF voor metalen doelen. Om oxide lagen en verontreinigingen van het doel te verwijderen, pre-sputteren enkele minuten.
    7. Open de sluiter en sputteren de metalen op de ondergrond. De depositie tarief voor de beschreven configuratie is ongeveer 10 nm per min. Dit tarief is afhankelijk van het werk afstand, druk, magneet kracht in de magnetron kathode, doel dikte en de metalen sputterde. Stel de afzettingstijd om de gewenste dikte te bereiken.
    8. Verwijder de beklede glazen dia dekamer.
    9. Met behulp van een spinner, spin fotoresist coating op het oppervlak van de film. Vele resists worden gebruikt. Voor dit geval werd een positieve fotoresist gebruikt.
    10. Nadat de resist wordt gesponnen op de film zacht bakken bij 90 ° C gedurende 5 min drogen de resist.
    11. Plaats een contact masker met een afbeelding van de inrichting stevig tegen de resist. Een UV-lichtbron wordt gebruikt om de fotoresist bloot. De belichting 10 sec, maar varieert afhankelijk van de sterkte van de lichtbron en de resist gebruikt.
    12. Plaats de film in de fotolak ontwikkelaar totdat het geprojecteerde beeld verschijnt. De ontwikkelaar spoelt de resist die is blootgesteld aan het UV-licht dat het breken van het polymeer bindingen veroorzaken. Onmiddellijk na het beeld verschijnt, dompel de film in DI water om de ontwikkelaar te stoppen van het werken aan de niet-blootgestelde fotolak.
    13. Blaas de films droog met droog stikstofgas.
    14. Plaats de films in een oven bij 120 ° C gedurende 15 min "hard bakken" de fotoweerstaan.
    15. Na de films afkoelen, leg ze in een ets oplossing totdat de metalen niet beschermd door de fotolak stijgt op. Dip in water om de ets stoppen.
    16. Spoelen met aceton om het geharde fotolak verwijderen.
    17. Spoelen met methanol en föhnen met droge stikstof.
    18. Nadat de beklede glazen klaar, vallen ander eiwit legering oplossingen op de glasoppervlakken en droog ze ten minste 12 uur eiwit legering films op glazen verkrijgen. (Voorgesteld wordt eerst de legering oplossingen 5 gew% concentraat dikke eiwit legering films te verkrijgen.)
    19. Vanwege de hydrofobe-hydrofiele interacties, zal de dunne metalen folies worden overgedragen door de glasoppervlakken bijgaande eiwit legeringsfilm oppervlakken 51. Trek het eiwit legering films met de dunne metalen patronen uit de glazen substraten met behulp van een tang.
    20. Onoplosbare eiwitten legeringen te verkrijgen, plaatst u de droge films in een 60 ° C vacuüm oven (25 kPa) met awater schaal op de bodem van de kamer. Pomp lucht in de oven, en laat het water dampen gloeien monsters gedurende minstens 2 uur. Hef het vacuum op en trek het niet in water oplosbare film van het substraat met behulp van een tang.
    21. Test de elektrische eigenschappen van metaalpatronen op proteïne legering films zoals elektrische weerstand en te vergelijken met de oorspronkelijke patronen op het glas.
  4. Fabricage van farmaceutische stoffen door Protein Alloys
    1. Een eiwit legering films met farmaceutische verbindingen fabriceren, eerst bereid een PDMS substraat zoals beschreven in stap 3.2. Reinig de gevormde PDMS substraat door gedestilleerd water.
    2. Oplossen of dispergeren van de farmaceutische verbindingen in een waterige oplossing. Gebruik echografie of vortex de farmaceutische verbindingen homogeen mengen met het water. Indien de verbindingen niet wateroplosbaar, dispergeren de poeders met een homogene verdeling in de ion-vrij gedestilleerd water.
    3. Bereken de gewenste massaverhoudingverbindingen van het eiwit legeringen door: volume van verbinding oplossing x gewichtspercentage van verbinding oplossing: volume eiwit legering oplossing x gewichtspercentage van verbinding oplossing (hier 1 gew% aluminium werd gebruikt). Selecteer een verhouding van een film met gewenste verbinding dichtheid in het eiwit legeringsfilm verkrijgen.
    4. De verbinding oplossing met het eiwit legering oplossing volgens dezelfde aanwijzingen in hoofdstuk 2 proces 2.16 langzaam mengen. (Let op: Om te geleren te voorkomen, niet ultrasonicate of vortex de oplossing tijdens het mengen).
    5. Giet een berekende volume van het mengsel op de PDMS substraat en drogen ten minste 12 uur in een chemische kap een verkrijgen eiwit legeringsfilm die een verhouding gemaakt van farmaceutische verbindingen.
    6. Fysiek verknoopt de film volgt dezelfde instructie in paragraaf 3.2 proces 3.2.8. Een voorbeeld van aluminium films met onoplosbare model geneesmiddelen met een lage dichtheid (LD) of hoog (HD) dichtheid te zien in figuur 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typische eiwit-eiwit interacties (bijvoorbeeld tussen eiwit A en eiwit B) kunnen lading-lading (elektrostatisch) attracties waterstofbinding vorming, hydrofobe-hydrofiele interacties, alsmede dipool, oplosmiddel, tegenion en entropische effecten tussen de specifieke bevatten domeinen van twee eiwitten (figuur 2) 3. Daarom fundamenteel, we kunnen de effecten van deze interacties door computationele simulaties voorspellen.

Figuur 2
Figuur 2 Interacties tussen eiwit A en eiwit B. Gewoonlijk kunnen deze interacties worden gebaseerd op lading-lading (elektrostatisch) attracties waterstofbinding vorming of hydrofobe-hydrofiele interacties tussen de specifieke gebieden van deze twee eiwitten.

De eiwit-legeringsysteem kan worden gemodelleerd als een materiaal bestaande uit verknoopte eiwit sub-legering domeinen, waarbij elk van deze sub-legeringen wordt geacht stabiel te zijn. De interacties tussen de eiwitten (A en B) kunnen worden beschouwd als banden met verschillende stijfheden (voor deze studie beschouwen we twee soorten zwakke of sterke bindingen in figuur 3). De zwakke bindingen kunnen waterstofbruggen en andere obligaties beschreven in figuur 2 Het eiwit-legering vertegenwoordigen. Als geheel wordt gevormd door middel van dual cross-verbanden tussen de vele sub-legeringen die samen begrensd door zowel de sterke en zwakke bindingen. De sub-legeringen worden gevormd met behulp van sterke banden en binnen de sub-legeringen we toestaan ​​dat de vorming van zwakke bindingen. De eiwit-legering als geheel wordt gevormd door dubbele cross-verbanden tussen vele sub-legeringen die samengebonden via verschillende sterke en zwakke bindingen. Wanneer het systeem voldoende wordt benadrukt, zijn zowel de zwakke en sterke banden gescheurd. In de juiste omstandigheden de zwakke bindingen mogenhervorming van de verbanden weer. Toch zal de sterkere banden onomkeerbaar verbroken. Het bestaan ​​van de zwakke bindingen maakt de legering-eiwit zijn structurele integriteit onder externe spanning 36-41 houden. Deze numerieke simulatie maakt gebruik van een wiskundig model ontwikkeld door middel van een bottom-up benadering die is gebaseerd op de eindige elementen methode via rooster-veer model 36-41.

Figuur 3
Figuur 3 computersimulatie de mechanische voordeel van een eiwit legeringssysteem tijdens het spannen. Tijdens het strekken simulatie tonen, kan een type eiwit (blauwe kleur) een elastisch netwerk zoals veren verschaffen super-elasticiteit van het materiaal te vormen, terwijl een ander type eiwit (groene kleur) kan sterk fysische verknopingsmiddelen voor het stabiliseren van het materiaal netwerk. Dynamische structural overgangen (bijvoorbeeld waterstofbinding formaties en vervormingen) worden geïnduceerd in verschillende domeinen voor het opslaan en vrijgeven van energie of aanvullende mechanische ondersteuning bij strekking.

Figuur 3 toont een typische computersimulatie van de mechanische eigenschappen van een eiwit legeringssysteem (met wilde tussahzijde als proteïne A en gedomesticeerde moerbeizijde eiwitbestanddelen B) tijdens het spannen. Tijdens het strekken simulatie kan een type eiwit (blauwe kleur) een elastisch netwerk met veren voorzien superelastische voor de materialen vormen, terwijl een ander type eiwit (groene kleur) kunnen dienen als deeltjes met sterke fysieke crosslinkers van het materiaal netwerk. Dynamische structurele overgangen (bijvoorbeeld, vorming en vervorming waterstofbruggen) kan worden geïnduceerd in verschillende domeinen voor de opslag en het vrijmaken van energie of het verstrekken van extra mechanische ondersteuning tijdens het traject. De simulatie-studies gevensa algemene theoretische beeld om de interacties tussen verschillende structurele eiwitmoleculen, zodat bruikbare paren van eiwitten kunnen worden opgehaald eiwit legeringen met sterke interacties en specifieke eigenschappen, zoals buitengewone mechanische elasticiteit genereren begrijpen.

In het algemeen, wanneer het proteïne A en B worden geselecteerd (hier zijn ze wild zijde en gedomesticeerde zijde), een eiwit legering oplossing kan worden geproduceerd in verschillende stappen (figuur 4). Ten eerste moet de eiwitbronnen zoals natuurlijke vezels of poeders worden gereinigd of gezuiverd. Bijvoorbeeld, zou een ontharsingsproces worden gebruikt om de oplosbare eiwitten zijde Sericin meeste zijdefibroïne vezels 20 bedekt verwijderen. Ten tweede, dient een geschikt oplosmiddel worden gevonden voor de onoplosbare eiwitbronnen lossen in oplossingen. Bijvoorbeeld hoge concentratie LiBr oplossing is een goed oplosmiddel voor beta-sheet secundaire structuren in verschillende zijde snijden en los de vezels in oplossingen.Ten derde kan een dialyse werkwijze worden in een waterige oplossing verwijderen oplosmiddel zijn en herstellen van de eiwitmoleculen. Extra centrifugeren is vaak noodzakelijk om de onzuiverheden en onopgeloste aggregaten in de oplossing te verwijderen. Tenslotte ander eiwit waterige oplossingen kunnen samen voorzichtig gemengd met verschillende verhoudingen. Daarom, als de twee eiwitoplossingen geen macrophase scheiding, zullen deze worden gemengd samen met sterke interacties en vormen nieuw eiwit legeringssysteem voor verschillende biomedische toepassingen. Om het eiwit legering materialen onoplosbaar in het lichaam te kunnen verschillende fysische of chemische verknopende behandeling worden aangepast. Zo blijkt dat hoge temperatuur en hoge druk waterdamp annealing kan ongelooflijk crosslink andere zijde of elastine materialen 6,52. Terwijl verschillende keratinematerialen kan worden verknoopt met de natuurlijke disulfidebindingen in het eiwit zijketens 53.

Zodra de protein legering oplossingen worden geproduceerd en geverifieerd, kunnen ze worden gevormd in een groot aantal biomaterialen met instelbare eigenschappen, waaronder materiaal matrices voor thermische, mechanische, optische, elektrische, chemische of biomedische toepassingen (figuur 4). In dit artikel, drie nieuwe toepassingen voor deze materialen tonen de unieke voordelen van eiwitten legering biomaterialen zijn geselecteerd (figuur 4). Door de moderne micro-fabricagetechnieken, kunnen verschillende oppervlakte patronen gegenereerd worden op micro of nano-schalen op eiwit legeringen (Figuur 4 optische toepassing). Als bijvoorbeeld een optisch diffractie-patroon geproduceerd op het filmoppervlak, kan deze film gebruikt als media om laserstralen te zetten in verschillende optisch patroon 22,23. Als het eiwit legering materiaal ontstaan ​​in een enzymoplossing, kan de afbraak profiel van de films worden begrepen door de real-time diffractiepatronen vergelijken van de filmmet het originele patroon (in plaats van heen en weer wassen en onderzoek van de aangetaste films in de lucht). Een andere nieuwe techniek is om de vacht van verschillende micro-schaal circuits en draadloze resonatoren op het eiwit legeringen (Figuur 4 elektrische toepassing). Via deze techniek kunnen micro-stromen van beschadigde weefsels of organen in vivo worden gevolgd, met draadloze signalen direct overgebracht naar artsen 24,51. En het materiaal mechanisch taaiheid en biodurability in het lichaam kan eenvoudig worden gecontroleerd door het mengen's en specifieke eiwitcomponenten van de materialen. Tenslotte kunnen andere oplosbare of onoplosbare kankergeneesmiddelen rechtstreeks opgenomen in het eiwit legeringen (figuur 4 chemische toepassing). Kanker geneesmiddelen zijn vaak toxisch en niet alleen de kankercellen, maar ook de normale menselijke immuunsysteem aantasten. Daarom regelen van de regio en dosis kanker geneesmiddelafgifte per dag aan het lichaam is een van de thij de belangrijkste onderwerpen in de farmaceutische wetenschappen. Door integratie kanker drugs in eiwit legeringen, kunnen we het materiaal pas in kanker weefsels of organen implanteren, en de controle van de afgiftesnelheid van de kanker geneesmiddel per dag vanaf eiwit legering netwerk door het regelen van de eiwitcomponenten en mengverhoudingen. Aangezien het eiwit matrix volledig biologisch afbreekbaar zal het eiwit legeringen automatisch verwijderd lichaamsenzymen na de geneesmiddelafgifte-periode. De residuen van eiwit legeringen zuiver aminozuren, dat kan worden opgenomen door het lichaam van nature verder produceren van andere essentiële eiwitten in vivo. Patiënten die te genezen door gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen tegen kanker van geïmplanteerde eiwit legeringsmaterialen eindelijk hersteld zonder toevoegingen in het lichaam, en beide natuurlijk eiwit lichtmetalen matrices en kanker medicijnen zal efficiënt worden geabsorbeerd in het lichaam tijdens het uitharden.

"Figuur Figuur 4 algemene stappen om eiwit legeringsmateriaal, zoals reinigen of zuiveren van het proteïnemateriaal bronnen oplossen van de onoplosbare proteïnen in oplossingen, dianalysizing het oplossen van oplosmiddel uit een proteïne waterige oplossing te verwijderen, centrifugeren en mengen met verschillende verhoudingen te produceren, en fysische of chemische verknoping behandelingen. Het eiwit legering oplossing kan vervolgens worden gevormd in een breed scala van biomaterialen met instelbare eigenschappen, met inbegrip van materiaal matrices voor thermische, mechanische, optische, elektrische, chemische of biomedische toepassingen. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Hier hebben we aangetoond dat de kritische procedures van hoe elektrische materialen op prote fabricerenin legeringen met details in figuur 5. Dunne metalen films zoals elektrische circuits kunnen worden gemaakt met behulp van verschillende technieken, waaronder afzetting verdamping, gepulste laser depositie, of sputteren. Sproeien was geselecteerd voor de huidige studie aangezien biedt aanzienlijke flexibiliteit voor de energie van de gesputterde species door aanpassing sputteren gasdruk en aangelegd op de kathode en depositie uniformiteit door aanpassing van de gasdruk en kathode maat. Sputteren kunnen worden gebruikt om een metaalfilm op een glassubstraat (figuur 5A) projecteren. In dit geval werden Ag circuit films gedeponeerd op een hoog vacuümkamer met een basisdruk van ongeveer 1 x 10 -7 Torr. Ar sputtergas werd aan de kamer bij een druk van 20 mTorr en Ag werd gedeponeerd met een RF-generator 100 W gedurende 20 min van een 2-inch vlakke magnetron kathode is 8 cm van het substraatoppervlak. Apparaten zijn defined gebruikelijke fotolithografische technieken in de films op glas, gevolgd door nat chemisch etsen (zie gedetailleerde procedure in figuur 5A). Apparaten kunnen ook worden gedefinieerd door afzetting door een fysiek masker direct op het eiwit films. De kamertemperatuur elektrische weerstand van de elektrische circuits van het eiwit films werd gemeten met zowel twee aansluitingen en vier-terminal technieken. Het voordeel van de vier-terminal benadering is contactweerstand van de meting elimineren maar wij vinden dat de overgangsweerstand niet zo significant Twee-eindstandige meting voldoende. De twee eindstandige metingen gebruikt een goede kwaliteit multimeter ingesteld op het ohm schaal maken contact met de folie aan beide uiteinden van de metalen draad (schematisch getoond in figuur 5B). Het niveau van de multimeter dient als een stroombron en een voltmeter en de gemeten weerstand de spanning gedeeld door de stroom. De weerstand wordt berekend metρ = RA / l, waarbij R de weerstand is A de dwarsdoorsnede van de draad en L de afstand tussen de probes. Voor hier gemaakt, werd de R gemeten en 23,5 Ω met de helling van de spanning-stroom curve in figuur 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), l 4,45 x 10 -2 m en A bleek 6,685 x 10 -10 m 2. Met behulp van deze nummers, een weerstand van 3,6 x 10 -7 Ω · m werd gevonden voor de films, ongeveer 20x groter dan die voor bulk zilveren metalen (1,6 x 10 -8 Ω · m). Een hogere weerstand gemeten films ten opzichte van bulk typisch door het reeds gedwongen stroompad en het onvermogen van ladingsdragers gebreken voorkomen. Het verwarmen van de metalen met een warmtepistool verhoogde de weerstand wijst op een toename in de snelheid van elektronoverdracht door verstrooiing fononen kenmerkend metalen geleiding.

"Figuur Figuur 5 (A) Procedure voor elektrische circuits op eiwit lichtmetalen films (hier zilver circuits op wilde tussah zijde en moerbei zijde mix films als voorbeeld): (a) Uncoated microscoopdia; (B) Zilver plasma tijdens het sputteren van een doel diameter 2 meter; (C) Zilver gecoat glasplaatje; (D) monster Zilver gecoat gehouden om de spinner met behulp van de vacuüm boorkop voor het toevoegen van de fotolak; (E) zilver slide gecoat met fotolak werd in oven Te zacht bakken bij 120 ° C; (F) blootstellen aan UV straling het polymeer bindingen in de fotoresist te breken; (G) Het ontwikkelen van de fotolak; (H) Hard-bakken de resist te bereiden voor het etsen in zuur; (I) Ets in het zuur, stop de ets door spoelen in een waterbad; (J) Droog de slide; (K) Cast eiwit legering oplossing op de glijbaan; (L) Transfer zilver patronen om de gedroogde film eiwit. (B) -7 Ω · m, ongeveer 20x groter dan die voor bulk zilveren metalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6 Thermische analyse model dat wordt gebruikt voor het verifiëren van de mengbaarheid van blended eiwit systeem. Indien eiwit A en B hebben een individuele enkelvoudige glasovergangstemperaturen, T g (A) en T g (B), respectievelijk (groene en blauwe curven), een volledig mengbaar eiwit legeringssysteem slechts een glasovergang anders dan de Tg 's van A en B (rode curve) vertonen. Anders, het eiwits onmengbaar mengsels met zowel Tg (A) en Tg (B) (kromme) of semi-mengbaar composieten met twee verschoven glasovergangen (oranje curve).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een van de meest kritische procedures productie "legering" eiwit systeem is de mengbaarheid van het gemengde eiwitten verifiëren. Anders is uitsluitend mengbaar eiwitmengsel of proteïne samengestelde systeem zonder stabiel en afstembare eigenschappen. Een experimentele thermische analyse methode kan worden gebruikt voor dit doel en hun legeringen eigenschappen bevestigen. Eiwit-eiwit interacties kunnen worden bekeken volgens Flory-Huggins's roostermodel 48 interactie tussen het "oplosmiddel" (de belangrijkste eiwitcomponent) en "opgeloste" (de minor eiwitcomponent). Op basis van dit model, de vrije energie verandering tijdens het mengen tussen de "oplosmiddel" en de "opgeloste" regelt de mengbaarheid van het mengsel 48. Algemeen zijn er drie verschillende graden van mengbaarheid: (a) volledig mengbaar (formulier een fase materiaal macroscopisch), (b) metastabiele (formulier semi-mengbare fasen in het materiaal) en (c) mengbaar (nog originele twee-fasen met individuele proteïne A en B-domeinen) 3,48. Dienovereenkomstig kan de glasovergangstemperatuur gedrag van een twee eiwit systeem deze verschillen aantonen en idealiter worden uitgedrukt onder gebruikmaking van een fasediagram model (figuur 6). Als bijvoorbeeld proteïne A en B hun individuele enkelvoudige glasovergangstemperatuur, Tg (A) en Tg (B) respectievelijk (figuur 6 groene en blauwe curven), volledig mengbaar eiwit legering systeem alleen een glasovergangstemperatuur vertonen tijdens het verwarmen. Deze enkele glasovergangstemperatuur normale intermediair tussen de Tg's van A en B (figuur 6). Anders kan het eiwit een onmengbare blend vormen waarbij beide Tg (A) en Tg (B) lijken op de oorspronkelijke positie (figuur 6). De eiwitten kunnen ook een semi-mengbare systeem aangegeven door twee verschoven glas tran vormennames (Figuur 6). Een praktisch voorbeeld van volledig mengbaar eiwit "lichtmetalen" systeem (vorm een-glas overgang) is te vinden in het DSC-scans van zijde-tropo-elastine mix monsters in figuur 4 (thermische toepassing) 9. Met de afname van zijdegehalte, de glasovergangstemperatuur (Tg) van de mengsels geleidelijk verhoogd van 178 ° C (zuivere zijde) tot 190 ° C (zuivere tropo-elastine) 9, nog steeds een homogene enkele glasovergangstemperatuur voor alle soorten behouden combineert. Volgens Flory-Huggins model, betekent dit dat alle zijde-tropo-elastine mengsels van verschillende mengverhoudingen zijn stabiel en volledig mengbaar eiwit legeringen zonder macrophase scheidingen.

Concluderend kan nieuwe generaties eiwit legeringen worden geproduceerd en vervaardigd in verschillende medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld films, hechtingen, schroeven, platen, micro-naalden, gels), met gecontroleerde en tonijnble optische, elektrische, chemische, thermische en mechanische eigenschappen. Door het regelen van de mengcomponenten en verhoudingen, verschillende biofysische eigenschappen van eiwitten legeringen, zoals elasticiteit, sterkte, oppervlakteruwheid, oppervlaktelading, biodurability en chemische activiteit kan worden gemanipuleerd, die uiteindelijk kan invloed hebben op de tissue functies en het telefoonnetwerk gedrag geassocieerd met deze materialen. Bovendien, vanwege de aard van programmeerbare levensduur proteïnen in vivo wordt een levensvatbaar platform voor deze legeringen. Dergelijke voordelen kunnen nieuwe mogelijkheden voor implanteerbare medische hulpmiddelen in de toekomst waar na chirurgische reparatie ophalen kunnen worden vermeden. Deze eiwitten lichtmetalen biomaterialen ander zou ook een nieuwe weg naar medische hulpmiddelen met instelbare biologische functies en eigenschappen, en met bijpassende weefsel compliance en aanverwante behoeften te produceren. Dit artikel geeft een algemeen protocol voor beoordeling hoe deze apparaten te fabriceren enzou profiteren van zowel wetenschappers en klinische artsen in meerdere biomedische velden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs danken Rowan University voor de ondersteuning van dit onderzoek. XH ook dankzij Dr David L. Kaplan aan de Tufts University en de NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) voor de voorafgaande technische trainingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics