कैल्शियम का आकलन बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्पार्क्स

1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Department of Physiology and Cell Biology, Davis Heart and Lung Research Institute, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3Department of Molecular Biophysics and Physiology, Rush University Medical Center, 4Department of Internal Medicine, Davis Heart and Lung Research Institute, The Ohio State University Wexner Medical Center
Biology

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Summary

सीधे कैल्शियम स्पार्क्स को मापने के लिए एक विधि यहाँ है वर्णित, सीए 2 + की प्राथमिक इकाइयों बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में sarcoplasmic जालिका से जारी. इस विधि पृथक मांसपेशी फाइबर में ryanodine रिसेप्टर से सीए 2 + रिहाई के आसमाटिक तनाव की मध्यस्थता ट्रिगर का इस्तेमाल करता. गतिशीलता और intracellular सीए 2 + संकेतन के homeostatic क्षमता स्वास्थ्य और रोग में पेशी समारोह का आकलन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

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Park, K. H., Weisleder, N., Zhou, J., Gumpper, K., Zhou, X., Duann, P., Ma, J., Lin, P. H. Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers. J. Vis. Exp. (84), e50898, doi:10.3791/50898 (2014).

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Abstract

Homeostatic सीए 2 + संकेतन को बनाए रखने के जीवित कोशिकाओं में एक मौलिक शारीरिक प्रक्रिया है. सीए 2 + स्पार्क्स के रूप में अत्यधिक sarcoplasmic जालिका (एसआर) झिल्ली पर चैनलों जारी + (RyR) सीए ryanodine रिसेप्टर द्वारा मध्यस्थता सीए 2 + रिहाई की घटनाओं 2 स्थानीयकृत दिखाई देते हैं धारीदार मांसपेशी फाइबर में संकेत + 2 सीए की प्राथमिक इकाइयां हैं. उचित मूल्यांकन पेशी के सीए 2 + स्पार्क्स स्वस्थ और रोगग्रस्त धारीदार मांसपेशियों के intracellular सीए 2 + से निपटने के गुण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है. सीए 2 + घटनाओं आमतौर पर आराम कर cardiomyocytes में देखा जाता है स्पार्क्स हालांकि, वे शायद ही कभी कंकाल की मांसपेशी फाइबर आराम में मनाया जाता है, इस प्रकार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्पार्क्स उत्पन्न करने और विश्लेषण करने के तरीकों के लिए एक की जरूरत है.

यहाँ विस्तृत च का उपयोग कर अलग flexor digitorm ब्रेविस (FDB) मांसपेशी फाइबर में सीए 2 + स्पार्क्स मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हैluorescent सीए 2 + indictors और लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी. इस दृष्टिकोण में, अलग FDB फाइबर isotonic शारीरिक समाधान के लिए एक वापसी के बाद क्षणिक hypoosmotic तनाव को उजागर कर रहे हैं. इन शर्तों के तहत, एक मजबूत सीए 2 + प्रतिक्रिया युवा स्वस्थ FDB मांसपेशी फाइबर में sarcolemmal झिल्ली से सटे पता चला है स्पार्क्स. बदल सीए 2 + प्रतिक्रिया dystrophic या वृद्ध कंकाल की मांसपेशी फाइबर में पता चला है स्पार्क्स. यह दृष्टिकोण हाल ही में झिल्ली सीमांकित संकेतन inositol के बीच परस्पर बात (1,4,5) triphosphate रिसेप्टर (आईपी 3 आर) को शामिल दिखा दिया है कि और RyR सीए कंकाल की मांसपेशी में 2 + चिंगारी सक्रियण के लिए योगदान देता है. संक्षेप में, आसमाटिक तनाव का उपयोग हमारी पढ़ाई सीए प्रेरित 2 + स्पार्क्स इस intracellular प्रतिक्रिया एक मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान में तंत्र संकेत और माउस पेशी dystrophy के मॉडल (MDX चूहों) या amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस मॉडल सहित / रोग राज्यों, उम्र बढ़ने दर्शाता है कि पता चला).

Introduction

Intracellular मुक्त सीए 2 + ([सीए 2 +] मैं) (समीक्षा के लिए Stutzmann और Mattson 1 देखें) ऐसे न्यूरॉन्स, हृदय, कंकाल और चिकनी मांसपेशियों के रूप में उत्तेजनीय कोशिकाओं में कई सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करता है एक बहुमुखी और महत्वपूर्ण माध्यमिक दूत है. Sarcoplasmic जालिका (एसआर) और टी छोटी नली के बीच सीए 2 + जुटाना और पार से बात विनियमित (टीटी) झिल्ली मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान के मौलिक नियामकों हैं. इसके अलावा, सीए 2 + संकेतन में परिवर्तन विभिन्न मांसपेशियों की बीमारियों में सिकुड़ा शिथिलता का एक अंतर्निहित तंत्र होना दिखाया गया था.

सीए 2 + स्पार्क्स sarcoplasmic जालिका (एसआर) झिल्ली 2 पर ryanodine रिसेप्टर (RyR) चैनल के उद्घाटन से होने वाले प्राथमिक सीए 2 + रिहाई घटनाओं स्थानीयकृत हैं. हृदय की मांसपेशी में, स्पार्क्स एक सीए 2 + प्रेरित सीए 2 + rele द्वारा RyR2 चैनल के उद्घाटन के माध्यम से सहज होएएसई (CICR) तंत्र 3-5. कंकाल की मांसपेशी में, RyR1 सख्ती से टीटी झिल्ली 6,7 पर वोल्टेज संवेदक द्वारा नियंत्रित किया जाता है. बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में आराम की स्थिति में इस प्रकार सीए 2 + स्पार्क्स दबा रहे हैं और शायद ही कभी पता लगाया. + कंकाल की मांसपेशी 8,9 में पता लगाया जा करने की घटनाओं चिंगारी अभी हाल तक, जरूरत sarcolemmal झिल्ली RyR1 पर वोल्टेज संवेदक के दमन अलग करना विभिन्न रासायनिक या यांत्रिक "skinning" तरीकों से बाधित होने के लिए और 2 सीए के लिए अनुमति दी. एक विधि पहले से सैपोनिन डिटर्जेंट 10 से मांसपेशी फाइबर की झिल्ली की permeabilization का वर्णन किया.

2003 में, हम क्षणिक hypoosmotic तनाव या hyperosmotic तनाव या तो 2 + बरकरार मांसपेशी फाइबर 11 में sarcolemmal झिल्ली से सटे स्पार्क्स परिधीय सीए उत्पन्न कर सकता है कि खोज की. इस विधि के बाद सीए 2 + की आणविक तंत्र और मॉडुलन अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया है 12-16. यहाँ हम बरकरार कंकाल की मांसपेशी में सीए 2 + स्पार्क्स के शामिल होने का पता लगाने और विश्लेषण के लिए हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का विवरण रूपरेखा. हम भी कंकाल की मांसपेशी, जैसे चिंगारी आवृत्ति और आयाम RyR चैनलों का खुला संभावना को दर्शाता है जो (Δ F/F0, में व्यक्तिगत सीए 2 + स्पार्क्स के मौलिक गुण यों इस्तेमाल किया जा सकता है कि हमारे कस्टम निर्मित चिंगारी विश्लेषण कार्यक्रम पेश और एसआर अंदर सीए 2 + भार), शिखर समय (समय वृद्धि) और अवधि (FDHM, स्पार्क्स के आधा अधिक से अधिक आयाम में पूर्ण अवधि), साथ ही सीए 2 + स्पार्क्स के स्थानिक वितरण. इसके अलावा, हम ऐसे पेशी कुपोषण और amyotrophic पार्श्व काठिन्य के रूप में कंकाल की मांसपेशी में विभिन्न pathophysiological राज्यों, सीए 2 + स्पार्क्स बदल कि लिंक साक्ष्य प्रस्तुत करते हैं.

इस तकनीक का लाभ अपेक्षाकृत undam में सीए 2 + उपाय करने की क्षमता शामिल हैइसके बजाय, मांसपेशी फाइबर अलग करना शारीरिक करने की स्थिति में रिकॉर्डिंग सीए के 2 + स्पार्क्स करीब की अनुमति के वृद्ध कोशिकाओं,. इसके अतिरिक्त, हमारे कस्टम डिजाइन कार्यक्रम मांसपेशी फाइबर के संबंध में चिंगारी की संपत्तियों की अधिक सटीक गणना प्रदान करता है.

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Protocol

1. आसमाटिक तनाव छिड़काव प्रणाली की स्थापना

चित्रा 1 कैल्शियम की एक योजनाबद्ध प्रोटोकॉल बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में मूल्यांकन स्पार्क्स है.

  1. दो चैनलों की एक न्यूनतम युक्त छिड़काव प्रणाली की दुकान की नोक पोजीशनिंग करने में सक्षम एक तीन अक्ष (xyz) micromanipulator सेट करें. जिस तरह से Luer - - पर और / या छिड़काव समाधान के प्रवाह के बंद करने के लिए लोक पानी निकलने की टोंटी यह संलग्न तीन के साथ डिस्पोजेबल Luer-सिरिंज प्रति बैरल के साथ किया जा सकता है. ये छिड़काव चैनल एक> 0.2 मिमी व्यास के साथ एक एकल छिड़काव टिप के माध्यम से समाधान की> 1 मिलीग्राम / मिनट देने में सक्षम होना चाहिए.
  2. छिड़काव प्रणाली, Hypotonic Tyrode समाधान के साथ Isotonic Tyrode समाधान के साथ एक और अन्य दो चैनलों लोड करें.

2. माउस से तैयारी बरकरार एकल flexor digitorum ब्रेविस (FDB) मांसपेशी फाइबर

  1. एक माउस यूरोपीय संघ से पैर निकालेंटखने संयुक्त ऊपर पैर के माध्यम से काटने के द्वारा भारी विदारक कैंची की एक जोड़ी का उपयोग एनआईएच और IACUC दिशा निर्देशों का पालन thanized.
  2. तल सतह का सामना करना पड़ के साथ कम से कम 2 Ca + Tyrode समाधान के साथ भरा एक विच्छेदन कक्ष पर पैर पिन.
  3. पट्टा काटने और धीरे आसपास के ऊतकों से मांसपेशियों को अलग करने के लिए पट्टा पर खींच कर FDB काटना.
  4. मांसपेशियों की गहरी परतों में व्यक्तिगत अंकों में जहां यह शाखाओं बाहर का पट्टा काटने से विच्छेदन खत्म करो.
  5. मांसपेशी फाइबर के लिए अतिरिक्त नुकसान से बचने और Collagenase पाचन समाधान की एक thawed विभाज्य साथ एक ट्यूब में जगह के लिए अपने tendons के माध्यम से संदंश के साथ उठा द्वारा FDB मांसपेशियों स्थानांतरण 37 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed
  6. 160 आरपीएम की गति के साथ 60-90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर ईमानदार FDB युक्त ट्यूब सेते हैं. यह मांसपेशी बंडलों हदबंदी प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक पशुओं के विभिन्न प्रकारों के लिए जांच की जरूरत, विशेष रूप से झिल्ली क्षति की चपेट में उन रोग / उत्परिवर्ती फाइबर के लिए.
  7. Isotonic Tyrode समाधान के 700 μl के साथ ट्यूब में पचा FDB स्थानांतरण और धीरे सुझावों को दूर करने के लिए धीरे - धीरे एक स्वच्छ धार के साथ काटने के माध्यम से व्यास को कम करने के लिए 200 मिलीलीटर micropipette सुझावों की एक श्रृंखला के माध्यम से पेशी कई बार ड्राइंग द्वारा तंतुओं जारी करने triturate 200 मिलीलीटर micropipette की. रोग से विशेष रूप से कमजोर मांसपेशियों में हानिकारक फाइबर से बचने के लिए, टिप फाइबर बंडल चिपके हुए बिना के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए अभी काफी बड़ा है सुनिश्चित करें. बहुत छोटा एक खोलने के माध्यम से बंडल मजबूर मत करो.
  8. धीरे Isotonic के 1 मिलीलीटर युक्त एक 35 मिमी डेल्टा टीपीजी डिश के केंद्र में एक कट 200 मिलीलीटर micropipette के साथ दोहन और resuspending FDB फाइबर ट्यूब में और फिर 70 मिलीलीटर (कुल फाइबर का 1/10) बाहर ड्राइंग द्वारा FDB फाइबर बाहर प्लेट Tyrode समाधान पकवान भर में प्रसार को कम करने के लिए.
  9. डी में बरकरार एकल फाइबर की संख्या का निर्धारणएक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग ish. डिश पर 3-4 बरकरार फाइबर प्राप्त करने के लिए FDB फाइबर की अतिरिक्त aliquots जोड़ें.
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त पृथक मांसपेशी फाइबर स्टोर और 6 घंटे के भीतर का उपयोग करें.

3. Fluo-04:00 डाई लोड हो रहा है और सीए 2 + इमेजिंग (स्पार्क्स माप)

  1. एक ट्यूब में 10 मिलीलीटर Fluo-4:00 स्टॉक (1 मिमी) के साथ में स्थानांतरित चढ़ाया FDB फाइबर के साथ पकवान से Isotonic Tyrode समाधान के 500 मिलीलीटर, मिश्रण और 10 मिमी के अंतिम Fluo-04:00 एकाग्रता के लिए डिश के लिए वापस जोड़ने. वैकल्पिक रूप से, pluronic एसिड डाई लदान क्षमता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए लोड करें.
  3. ध्यान से एक काटा हुआ 200 मिलीलीटर प्लास्टिक micropipette टिप के साथ पकवान से Fluo 4 बजे सुबह से युक्त Isotonic Tyrode समाधान के 500 मिलीलीटर बाहर ड्राइंग द्वारा फाइबर धो लें और ताजा Isotonic Tyrode समाधान के बराबर मात्रा के साथ बदलें.
  4. इस प्रक्रिया 3 बार दोहराएँ.
  5. Mitochondrial समारोह कल्पना, Isoto की 500 मिलीलीटर हस्तांतरणएक ट्यूब 5 मिलीलीटर TMRE स्टॉक (1 मिमी) के साथ, मिश्रण, और 50 एनएम के अंतिम एकाग्रता के लिए वापस पकवान को जोड़ने में FDB फाइबर के साथ पकवान से एनआईसी Tyrode समाधान.
  6. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. सावधानी के 500 मिलीलीटर बाहर ड्राइंग द्वारा फाइबर धो TMRE युक्त एक काटा हुआ 200 मिलीलीटर की प्लास्टिक micropipette टिप के साथ पकवान से Isotonic Tyrode समाधान और ताजा Isotonic Tyrode समाधान के बराबर मात्रा के साथ बदलें.
  8. इस प्रक्रिया 3 बार दोहराएँ.
  9. Confocal खुर्दबीन के लिए पकवान स्थानांतरण और स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स और प्रयोग के लिए एक चिकनी sarcolemmal झिल्ली के साथ एक अक्षुण्ण फाइबर का चयन करें.
  10. Micromanipulator नियंत्रण का उपयोग कर दूर लक्ष्य मांसपेशी फाइबर से और केंद्र बंद छिड़काव प्रणाली 400-500 माइक्रोन की टिप स्थिति.
  11. FDB फाइबर जगह में रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए Isotonic Tyrode समाधान का प्रवाह शुरू.
  12. एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ Fluo 4 बजे से प्रतिदीप्ति संकेत रिकॉर्ड और एक साथ Fluo-04:00 उत्तेजितआर्गन लेजर (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 488 एनएम) और रिकॉर्ड उत्सर्जन संकेतों (तरंगदैर्ध्य 510-580 एनएम). फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता intracellular सीए 2 + एकाग्रता ([सीए 2 +] मैं) के सापेक्ष स्तर के लिए आनुपातिक है.
  13. फाइबर पर आसमाटिक तनाव निर्माण करने के क्रम में कोशिकी समाधान के आसमाटिक दबाव बदलकर सीए 2 + यात्रियों प्रेरित. प्रारंभ में सूजन उत्पन्न करने के लिए 100 सेकंड के लिए Hypotonic Tyrode समाधान (170 mOsm) के साथ फिर Isotonic Tyrode समाधान (290 mOsm) (60 सेकंड के लिए आधारभूत संग्रह) के साथ फाइबर छिड़कना और. Isotonic Tyrode समाधान के साथ FDB फाइबर वापस छिड़कना. आम तौर पर, केवल एक आसमाटिक सदमे से एक डेल्टा टीपीजी पकवान में एक भी बरकरार फाइबर और चिंगारी घटनाओं डाटा अधिग्रहण के लिए पिछले 10 मिनट के लिए लागू किया जाता है.
  14. 166 LPS (प्रति सेकंड लाइन, और ईए के स्कैन की गति के साथ XY दो आयामी छवियों का एक समय श्रृंखला का उपयोग सीए 2 + स्पार्क्स (चित्रा 2) के रिकॉर्ड स्थानिक स्थानीयकरणisotonic (1 मिनट की प्रत्येक स्थिति के लिए 3.08 सेकंड / फ्रेम में जिसके परिणामस्वरूप 512 पिक्सल) के शामिल CH लाइन), hypotonic तनाव (100 सेकंड) और बाद hypotonic तनाव (5 मिनट). ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए स्टोर संकेतों प्रयोग के पूरा होने के बाद सीए 2 + स्पार्क्स के वितरण और आवृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए.
  15. एक नए पकवान पर एक नए फाइबर का पता और सीए 2 + यात्रियों को उत्पन्न करने के लिए एक ही आसमाटिक सदमे प्रोटोकॉल का पालन करें. सीधे sarcolemmal झिल्ली के नीचे रखा confocal स्कैन लाइन के साथ एक मिनट (यानी 30,000 लाइनों) के लिए सीए 2 + यात्रियों रिकॉर्ड करने के लिए एक confocal लाइन स्कैन (XT) मोड (लंबाई में 512 पिक्सल, 2 मिसे / स्कैन लाइन का नमूना दर का प्रयोग (चित्रा 3 ). व्यक्ति सीए 2 + स्पार्क्स की भयावहता और कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए linescans के 1 मिनट के अंतराल में तीन अनुक्रमिक श्रृंखला () दर्ज करने के लिए विभिन्न फोकल विमानों को स्कैन लाइन बदलें.

4. डेटा विश्लेषण

  1. की एक बड़ी संख्या लीजिए, शिखर, अवधि (FDHM के लिए समय, समय वृद्धि, xt लाइन स्कैन, व्यक्तिगत सीए 2 + स्पार्क्स मापदंडों की आकारिकी और कैनेटीक्स का मूल्यांकन आयाम यानी (एफ 0 आराम सीए 2 + प्रतिदीप्ति है जहां एफ / एफ 0) निशान , आधा परिमाण में पूर्ण अवधि), और दर्ज स्पार्क्स के स्थानिक चौड़ाई (FWHM, आधा परिमाण में पूरी चौड़ाई). इन मानकों ऐसे सीए 2 + प्रवाह (आयाम) के रूप में RYR सीए 2 + चैनलों की बुनियादी gating गुणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और RYRs (अवधि) के gating कैनेटीक्स.
  2. पहले 11,16 वर्णित के रूप में, छवि प्रसंस्करण भाषा आईडीएल (इंटरएक्टिव डेटा भाषा) के साथ बनाया गया था, जो एक कस्टम विकसित, अर्द्ध स्वचालित एल्गोरिथ्म के साथ डिजिटल छवि डेटा का विश्लेषण. सीए 2 + का अनूठा कैनेटीक्स आसमाटिक तनाव से FDB फाइबर में प्रेरित सीए 2 + स्पार्क्स के मामले में जारी है, क्योंकि यह 2 + घटनाओं चिंगारी सीए की मैनुअल और स्वचालित सुविधाओं गठबंधन करने के लिए बेहतर हैइन कस्टम गठन छवि विश्लेषण कार्यक्रमों 11 के साथ पहचान और प्रसंस्करण. यह स्वयं कुछ मांसपेशियों की बीमारी के मॉडल में रॉय (ब्याज के क्षेत्र) की पहचान करने के लिए आवश्यक है जब यह एल्गोरिथ्म बहुत उपयोगी है. एक रॉय परिभाषित किया गया है एक बार, एल्गोरिथ्म स्वतः तो Excel फ़ाइल को निर्यात किया जा सकता है जो कि ऊपर उल्लेख किया चिंगारी पैरामीटर प्राप्त सकता है. वैकल्पिक रूप से, सार्वजनिक उपलब्ध इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर, ImageJ में जैसे SparkMaster, सीए 2 + स्पार्क्स की गतिज गुण और कंकाल की मांसपेशी 17 में उनके स्थानिक वितरण परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

पहले के अध्ययनों क्षणिक hypoosmotic तनाव + परिधीय सीए 11. चित्रा 1 चिकनी sarcolemmal झिल्ली और विशेषता स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स साथ बरकरार एकल मांसपेशी फाइबर के चित्रों से पता चलता बरकरार मांसपेशी फाइबर में sarcolemmal झिल्ली से सटे 2 स्पार्क्स प्रेरित दिखाया. चित्रा 2 ठेठ सीए 2 + पता चलता है (XY छवियों के रूप में) स्पार्क्स जवान, स्वस्थ चूहों से FDB मांसपेशी फाइबर फूल जाती है कि एक hypoosmotic समाधान के साथ क्षणिक (100 सेकंड) उपचार से प्रेरित थे. मांसपेशी फाइबर वापस मूल मात्रा सिकुड़ती के रूप में, एक मजबूत सीए 2 + चिंगारी प्रतिक्रिया सीधे मांसपेशी फाइबर के sarcolemma के तहत किया जाएगा. ये XY छवियों चिंगारी आवृत्तियों की गणना और इस प्रतिक्रिया के लिए क्षय प्रोफाइल साजिश करने के लिए उपयोग किया जाता है. 3 चिंगारी विश्लेषण की इस विधा के साथ उत्पन्न ठेठ लाइन स्कैन (XT) से पता चलता है. confocal स्कैन लाइन सीधे के नीचे स्थित हैsarcolemmal झिल्ली (चित्रा 3). चिंगारी घटनाओं के समय श्रृंखला पर कब्जा कर लिया गया और संबंधित ROIs (ब्याज के क्षेत्र) हमारे कस्टम विकसित, अर्द्ध स्वचालित "स्पार्क फ़िट" कार्यक्रम (3B चित्रा) से पहचाना जा सकता है. चित्रा -3 सी आयाम की एक ठेठ स्पार्क फ़िट विश्लेषण से पता चलता है और दी सीए 2 + चिंगारी के कैनेटीक्स. सीए 2 + चिंगारी तीव्रता Fluo-04:00 संकेतों के आयाम बदल (एफ शिखर Fluo 4 तीव्रता है और एफ 0 चिंगारी उत्पन्न होने से पहले आराम कर Fluo 4 तीव्रता है जहां Δ एफ / एफ 0) के रूप में गणना की है. चिंगारी की अवधि FDHM (आधा परिमाण की पूरी अवधि) और वृद्धि समय के साथ ही यह भी गणना की जा सकती पीक करने के लिए समय का प्रतिनिधित्व करती है. एक ठेठ 3 डी (तीन आयामी) प्रतिनिधित्व सीए 2 + तीव्रता परिवर्तन (चित्रा 3 डी) दिखाने के लिए निर्दिष्ट ROIs से बनाया जा सकता है. चित्रा 4 सीए 2 + चिंगारी की छवियों को दर्शाता हैविभिन्न शारीरिक और pathophysiological राज्यों तहत कंकाल की मांसपेशी फाइबर से linescans. स्वस्थ, युवा (3 महीने) से व्युत्पन्न जंगली प्रकार की मांसपेशी (चित्रा -4 ए), और वृद्ध (22 महीने) मांसपेशी (चित्रा 4 बी) सीए 2 + स्पार्क्स के स्कैन लाइन (XT) श्रृंखला. वृद्ध मांसपेशी फाइबर में होता है कि कम संकेत ध्यान दें. युवा MDX मांसपेशी फाइबर मजबूत सीए 2 + स्पार्क्स (चित्रा 4C) प्रदर्शित करते हैं. 5 चित्रा से पता चलता है extensor digitorum longus (EDL) मांसपेशी जंगली प्रकार से फाइबर (चित्रा 5A) और amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) से सीए 2 + स्पार्क्स (XY तस्वीरें) बीमारी, लक्षण पेशी शोष और क्षतिग्रस्त mitochondria (चित्रा 5 ब) के साथ एक मोटर न्यूरॉन बीमारी. सीए 2 + तीव्रता Fluo 4 संकेतों (हरा, बाएं पैनल) और श्वसन राज्यों TMRE संकेत (लाल, सही पैनल) द्वारा दिखाए जाते हैं mitochondria से दिखा रहे हैं. टी कि नोटवह मजबूत सीए 2 + स्पार्क्स बंदरगाहों (TMRE संकेत खोने) mitochondria क्षतिग्रस्त.

चित्रा 1
चित्रा 1. कैल्शियम की योजनाबद्ध प्रोटोकॉल बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में मूल्यांकन स्पार्क्स. कैल्शियम की योजनाबद्ध प्रोटोकॉल बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में मूल्यांकन स्पार्क्स. इस विश्लेषण और फाइबर पर आसमाटिक तनाव उत्पन्न करने के लिए छिड़काव प्रणाली का सेट अप के लिए बरकरार FDB मांसपेशी फाइबर प्राप्त करने के लिए कदम वार प्रक्रिया से पता चलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2 चित्रा 2. प्रतिनिधि सीए 2 + स्पार्क्स (XY तस्वीरें) कंकाल FDB मांसपेशी फाइबर के एपिसोड. मध्य ट्रेस प्रोटोकॉल में अनुक्रमिक आसमाटिक दबाव परिवर्तन करने के लिए समय है और इसी XY छवियों (शीर्ष पैनल) से पता चलता है. शीर्ष पैनल छोड़ दिया - फाइबर Isotonic Tyrode समाधान के साथ इलाज किया, शीर्ष मध्य पैनल - Hypotonic Tyrode समाधान के साथ इलाज फाइबर, और शीर्ष सही पैनल - फाइबर Isotonic Tyrode समाधान के साथ इलाज के लिए लौट आए. XY इमेजिंग के साथ मनाया चिंगारी प्रकरणों का एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम तल पर दिखाया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि सीए 2 + स्पा RKS (लाइन xt छवियों को स्कैन करता है) और फ़िट विश्लेषण स्पार्क (ए) Confocal स्कैन लाइन (लाल धराशायी लाइन) सही मांसपेशी फाइबर की sarcolemmal झिल्ली के नीचे रखा जाता है;. (बी) आसमाटिक तनाव 2 + स्पार्क्स लाइन स्कैन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं असतत सीए पैदा (XT) मोड. स्पार्क फ़िट एसआर सीए 2 + प्रवाह जारी करने के लिए आनुपातिक है जो सीए 2 + तीव्रता (Δ एफ / एफ 0) प्रदर्शित करने के लिए एल्गोरिथ्म, और कैनेटीक्स (FDHM के रूप में प्रतिनिधित्व अवधि) के साथ (सी) स्पार्क विश्लेषण. (डी) spatio-अस्थायी मोड और उनकी तीव्रता में आसमाटिक तनाव पैदा स्पार्क्स दिखा एक Fluo 4 लाइन स्कैन छवि के तीन आयामी साजिश है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 4. आसमाटिक तनाव के जवाब में पेशी में प्रतिनिधि सीए 2 + स्पार्क्स शारीरिक और pathophysiological राज्यों युवा से व्युत्पन्न सीए 2 + स्पार्क्स के (ए) लाइन स्कैन (xt छवियों) (3 महीने) स्वस्थ FDB मांसपेशी फाइबर;. (बी) (आयु वर्ग से स्पार्क्स 22 महीने) FDB मांसपेशी फाइबर और (सी) युवा (3 महीने) dystrophic MDX माउस FDB मांसपेशियों से स्पार्क्स. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि सीए आसमाटिक तनाव के जवाब में FDB मांसपेशियों से 2 + स्पार्क्स (XY तस्वीरें). (ए 2 + स्पार्क्स जंगली प्रकार FDB मांसपेशियों से (XY तस्वीरें) और ए एल एस मांसपेशियों से (बी) सीए 2 + स्पार्क्स. एक साथ Fluo 4 AM साथ लेबल FDB मांसपेशी फाइबर (सीए 2 +, हरी संकेतों, बाएं पैनल) और TMRE (mitochondrial, सही पैनल पर लाल संकेत). छवियाँ आसमाटिक दबाव में परिवर्तन करने से पहले और बाद यात्रियों दिखा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

बरकरार कंकाल की मांसपेशी में सीए 2 + स्पार्क्स का आकलन करने का यह तरीका मांसपेशी शरीर विज्ञान और रोग अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण है. हम सीए 2 + चिंगारी प्रतिक्रिया 18, 19, और साथ ही amyotrophic पार्श्व काठिन्य 20 में उम्र बढ़ने, पेशी dystrophy 11 सहित विभिन्न परिस्थितियों में बदल दिया गया था कि पता चला है. हमारे हाल के अध्ययन में यह भी सीए करने के लिए कंकाल की मांसपेशी फाइबर 21 में 2 + स्पार्क्स सक्रियण योगदान देता है कि एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व आईपी -3 रिसेप्टर और RyR के बीच कार्यात्मक युग्मन का पता चला. कई अन्य अनुसंधान समूहों को भी कार्यात्मक गतिविधियों और dystrophic मांसपेशियों 12 के जीन बचाव रणनीति की प्रभावकारिता का पता लगाने, और कुछ रोग राज्यों 13,22 में बदल redox तनाव के संकेत चिंगारी + 2 सीए लिंक करने के लिए इस तकनीक को रूपांतरित किया. आसमाटिक तनाव से झिल्ली विरूपण RYR Corre पर DHPR के दमन को राहत देने के तथ्य यह है किlates अच्छी तरह से कंकाल की मांसपेशी 23 फर्क में सीए 2 + स्पार्क्स नियमन करने में DHPR-RYR के शारीरिक संपर्क (युग्मन) की अनिवार्य भूमिका के साथ, और इस प्रकार इन निष्कर्षों को आगे सीए 2 + स्पार्क्स के रूप में महत्वपूर्ण शारीरिक घटनाओं फंसाना. सीए 2 + स्पार्क्स व्यवस्थित करना कुछ शारीरिक एजेंटों या inhibitors लागू करने के लिए इस तकनीक का और विस्तार कोशिकाओं 24 में संकेत + 2 सीए पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करेगा.

हमारे परख की सबसे महत्वपूर्ण कदम सीए 2 + डाई लोड करने से पहले खुर्दबीन के नीचे बरकरार मांसपेशी फाइबर अलग करने और पहचान है. इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम इन शर्तों के संभावित फाइबर अलगाव के दौरान कोशिका झिल्ली क्षति प्रदान सकता है बदलने के रूप में collagenase पाचन समय और तापमान है. एक फाइबर मजबूती _ डेल्टा टीपीजी व्यंजन के नीचे से जुड़े और विशेषता सीधे, छड़ी की तरह उपस्थिति, 70-100 के आकार के साथ बरकरार आकारिकी प्रदर्शित किया जाना चाहिए6; मीटर (लंबाई) और 8-18 माइक्रोन (पार व्यास), वर्दी striation पैटर्न और सीए 2 + स्पार्क्स माप के लिए उपयोगी हो सकता है एक चिकनी sarcolemmal झिल्ली. डेटा संग्रह के पिछले सीमाओं पर एक सुधार सीए 2 + स्पार्क्स के संभावित सबसे सटीक रीडिंग कब्जा करने के लिए प्रत्येक फाइबर के भीतर कई फोकल विमानों पर माप ले जा रहा है. हम चिंगारी आवृत्ति, गतिशीलता और विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए एक कस्टम व्युत्पन्न "स्पार्क फिट 'कलन विधि का उपयोग हालांकि, इसी तरह के कार्यक्रमों में इस तरह के ImageJ 17 में" SparkMaster "के रूप में चिंगारी पैरामीटर विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए सार्वजनिक क्षेत्र के लिए उपलब्ध हैं. इस विधि को मामूली संशोधनों आसमाटिक तनाव का जवाब है कि अन्य प्रकार के ऊतकों में 2 + स्पार्क्स ryanodine रिसेप्टर से जारी + सीए के 2 ट्रिगर मध्यस्थता सीए के बेहतर दृश्य अनुमति दे सकता है.

वयस्क कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्थानीय और वैश्विक सीए 2 + संकेतों के दृश्य के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हैआर पेशी शरीर विज्ञान और हृदय अनुसंधान. एक साथ मानव रोग अनुसंधान और शक्तिशाली आणविक जीव विज्ञान के दृष्टिकोण (जैसे जीन overexpression या जीन मुंह बंद) के कार्यान्वयन के विभिन्न पशु मॉडल के साथ कंकाल की मांसपेशी में सीए 2 + स्पार्क्स का पता लगाने के लिए इस विधि का विस्तार सीए 2 + के नियमन पर विशाल जानकारी का उत्पादन करना चाहिए मानव स्वास्थ्य और रोगों में संकेत.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम जेएम, RO1-AR063084to एनएलडब्ल्यू, और JZ को RO1-AR057404 को RO1-AG028614 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit DOW CORNING 184 SIL ELAST KIT Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate. 
60 mm glass Petri dish  Pyrex 3160 Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution  Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution  Sigma-Aldrich
Collagenase type I  Sigma-Aldrich C-5138 Fiber digestion 
Fluo-4 AM  Invitrogen F14201 Fluorescent Ca2+ imaging dyes 
TMRE Invitrogen T669 mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes  Bioptechs 0420041500C 35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator Narishige International MHW-3
Temperature controllable orbital shaker New Brunswick scientific Fiber dissociation

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References

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