Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Biology

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Summary

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.

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Park, K. H., Weisleder, N., Zhou, J., Gumpper, K., Zhou, X., Duann, P., Ma, J., Lin, P. H. Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers. J. Vis. Exp. (84), e50898, doi:10.3791/50898 (2014).

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Abstract

Aufrechterhalten homöostatischen Ca 2 +-Signal ein Grund physiologischer Prozess in lebenden Zellen. Ca 2 +-Sparks sind die elementaren Einheiten der Ca 2 +-Signalgebung in der quergestreiften Muskelfasern, die als stark lokalisierten Ca 2 +-Freisetzung Veranstaltungen von Ryanodin-Rezeptor vermittelt (RyR) Ca 2 +-Freisetzung Kanäle auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran erscheinen. Die richtige Einschätzung der Muskel Ca 2 +-Sparks könnten Auskunft über die intrazelluläre Ca 2 + Handhabungseigenschaften von gesunden und kranken quergestreiften Muskeln. Obwohl Ca 2 + Funken Ereignisse werden bei Ruhe Kardiomyozyten zu sehen, sind sie selten in Ruheskelettmuskelfasern beobachtet, somit besteht ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung und Analyse von Funken in Skelettmuskelfasern.

Detaillierte hier ist ein experimentelles Protokoll für die Messung Ca 2 +-Sparks in isolierten Beuge digitorm brevis (FDB) Muskelfasern mit fluorescent Ca 2 +-Indikatoren und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Bei diesem Ansatz, isoliert FDB Fasern, um transiente hypoosmotischen Stress, gefolgt von einer Rückkehr zu isotonischen physiologischen Lösung ausgesetzt sind. Unter diesen Bedingungen wird eine robuste Ca 2 +-Antwort Funken ist angrenzend an die Membran sarkolemmalen bei jungen gesunden FDB Muskelfasern nachgewiesen. Veränderte Ca 2 + Funken Antwort wird in dystrophischen oder im Alter von Skelettmuskelfasern nachgewiesen. Dieser Ansatz wurde kürzlich gezeigt, dass Membran-getrennte Signalisierung mit Übersprechen zwischen Inositol-(1,4,5)-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) und RyR trägt zur Ca 2 + Funke Aktivierung der Skelettmuskulatur. Zusammenfassend unsere Studien durch osmotischen Stress induzierte Ca 2 + Funken zeigten, dass diese intrazelluläre Antwort spiegelt eine Muskelsignalisierungsmechanismus in der Physiologie und Altern / Krankheitszuständen, einschließlich Mausmodellen der Muskeldystrophie (mdx-Mäusen) oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS Modell).

Introduction

Intrazellulären freien Ca 2 + ([Ca 2 +] i) ist eine vielseitige und wichtige sekundäre Messenger, der mehrere zelluläre Funktionen in erregbaren Zellen wie Neuronen, Herz-, Skelett-und glatte Muskulatur reguliert (für eine Übersicht siehe Stutzmann und Mattson 1). Geregelte Ca 2 +-Mobilisierung und Übersprechen zwischen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und T-Tubuli (TT)-Membranen sind grundlegende Regulatoren der Muskelphysiologie. Ferner können Änderungen in Ca 2 +-Signal gezeigt worden war, um eine zugrundeliegende Mechanismus des kontraktilen Dysfunktion bei verschiedenen Erkrankungen zu sein.

Ca 2 +-Sparks lokalisiert sind elementare Ca 2 +-Freisetzung Ereignisse vom Öffnen des Ryanodin-Rezeptor (RyR) Kanal auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Membran 2 stammen. Im Herzmuskel auftreten Funken spontan durch die Öffnung des RyR2-Kanal von einem Ca 2 +-induzierte Ca 2 + release (IKRK)-Mechanismus 05.03. Im Skelettmuskel wird RyR1 ausschließlich durch den Spannungssensor an der Membran TT 6,7 gesteuert. So Ca 2 + Funken werden unterdrückt und in Ruhebedingungen in intakten Skelettmuskelfasern selten erkannt. Bis vor kurzem sarkolemmalen Membran benötigt, um durch verschiedene chemische oder mechanische "Hautbildung" Methoden aufgebrochen werden, um die Unterdrückung des Spannungssensors auf RyR1 entkoppeln und Ca 2 +-Ereignisse erlaubt in Skelettmuskel 8,9 detektiert werden entfachen. Ein Verfahren zuvor beschrieben erforderlich Permeabilisierung der Membran von Muskelfasern von Saponin Reinigungsmittel 10.

Im Jahr 2003 entdeckten wir, dass entweder transient hypoosmotischen Stress oder hyperosmotischen Stress könnte peripheren induzieren Ca 2 + Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern 11. Dieses Verfahren ist seit modifiziert worden, um die molekularen Mechanismen und Modulation von Ca 2 + zu studieren 16.12. Hier beschreiben wir die Details unserer experimentellen Ansatz für Induktion, Erfassung und Analyse von Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskulatur. Wir präsentieren auch unsere maßgeschneiderten Funke-Analyse-Programm, das verwendet werden kann, um die elementaren Eigenschaften der einzelnen Ca 2 +-Sparks in der Skelettmuskulatur, z. B. Funken Frequenz und Amplitude (Δ F/F0, die die Offenwahrscheinlichkeit der RyR Kanäle spiegelt quantifizieren und die Ca 2 +-Last in der SR), die Zeit bis zum Peak (Anstiegszeit) und Dauer (FDHM, Vollzeit bei halb-maximale Amplitude) der Funken, sowie die räumliche Verteilung der Ca 2 +-Funken. Darüber hinaus präsentieren wir Beweise, die auf die verschiedenen pathophysiologischen Zuständen in der Skelettmuskulatur, wie Muskeldystrophie und amyotrophe Lateralsklerose verändert Ca 2 +-Sparks Links.

Der Vorteil dieser Technik beinhaltet die Fähigkeit, Ca 2 + in relativ unbeschädigt zu messengealterten Zellen, anstatt Strippen der Muskelfasern ermöglicht Aufnahme von Ca 2 + Funken in physiologischen Bedingungen näher. Darüber hinaus bietet unsere maßgeschneiderten Programm genauere Berechnungen der Eigenschaften des Funkens in Bezug auf die Muskelfasern.

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Protocol

1. Einrichten osmotischen Stress-Perfusionssystem

Fig. 1 ist eine schematische Protokoll von Calcium Funken Bewertung in intakten Skelettmuskelfasern.

  1. Richten Sie ein Drei-Achsen (xyz) Mikromanipulator in der Lage, die Positionierung der Steckdose Spitze der Perfusions-System mit mindestens zwei Kanälen. Weg Luer - - Lok Hahn auf und / oder aus der Strömung des Perfusionslösungen wechseln Dies könnte mit Luer-Spritzenzylinder mit drei befestigt werden. Diese Kanäle sollten Perfusion der Lage ist,> 1 ml / min der Lösung durch eine einzige Spitze mit einer Perfusion> 0,2 mm Durchmesser sein.
  2. Legen Sie zwei Kanäle der Perfusion System, eine mit Isotonische Tyrode-Lösung und die andere mit Hypotone Tyrode-Lösung.

2. Vorbereiten Intakte Einzel Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern aus Maus

  1. Nehmen Sie den Fuß von einer Maus eufolgenden NIH und IACUC Richtlinien mit einem Paar schwerer Sezieren von Schere schneiden durch die Bein oberhalb des Sprunggelenks thanized.
  2. Pin den Fuß auf eine Dissektion Kammer mit Minimal Ca 2 + Tyrode-Lösung gefüllt mit der Sohlenfläche nach oben zeigt.
  3. Sezieren FDB durch Schneiden der Sehne und leichtes Ziehen auf der Sehne des Muskels aus dem umgebenden Gewebe zu trennen.
  4. Beenden Dissektion durch Schneiden des distalen Sehnen wo es sich in einzelne Ziffern in den tiefen Schichten des Muskels.
  5. Übertragen Sie die FDB Muskel durch Abheben mit der Pinzette über seine Sehnen, um zusätzliche Schäden an den Muskelfasern zu vermeiden und in einen Schlauch mit einem aufgetauten Aliquot Kollagenaseverdau Lösung vorgewärmt auf 37 ° C
  6. Das Röhrchen FDB enthält aufrecht auf einem Orbitalschüttler bei 37 ° C für 60-90 min mit einer Drehzahl von 160 Umdrehungen pro Minute. Experimentell für verschiedene Stämme von Tieren untersucht werden Diese Muskelbündel Dissoziation Protokoll muss, Besonders für jene Krankheit / Mutante Fasern anfällig für Membranschäden.
  7. Übertragen Sie die Faul FDB in das Rohr mit 700 ul Isotonische Tyrode-Lösung und sanft verreiben, um die Fasern durch Ziehen der Muskel mehrmals durch eine Reihe von 200-ml-Mikropipettenspitzen mit allmählich abnehmender Durchmesser über das Schneiden mit einer sauberen Rasierklinge freizugeben, um die Spitzen zu entfernen 200 ml Mikropipette. Um eine Beschädigung der Fasern in besonders schwachen Muskeln von der Krankheit zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spitze ist gerade groß genug, um das Faserbündel durch ohne zu kleben passieren. Sie das Bündel durch eine Öffnung zu klein, nicht mit Gewalt.
  8. Platte aus der FDB Fasern durch leichtes Klopfen resuspendiert und FDB Fasern in dem Rohr und dann Herausziehen 70 ml (1/10 der Gesamtfasern) mit einem Ausschnitt 200 ml Mikropipette in die Mitte einer 35 mm Delta TPG Schale mit 1 ml isotonischer Tyrode-Lösung, um die Diffusion über die Schüssel zu reduzieren.
  9. Bestimmen der Anzahl der intakten, einzelnen Fasern in der dish mit einem Dissektionsmikroskop. Fügen Sie zusätzliche Aliquots der FDB Fasern zu 3-4 Fasern intakt auf den Teller zu bekommen.
  10. Bewahren Sie zusätzliche isolierte Muskelfasern bei 4 ° C und innerhalb von 6 Stunden.

3. Fluo-04.00 Farbstoffbeladung und Ca 2 +-Imaging (Sparks Measurement)

  1. Über 500 ml Isotonische Tyrode-Lösung von plattierten Gericht mit FDB-Fasern in ein Rohr mit 10 ml Fluo-04.00 Lager (1 mM), vermischen und wieder in die Schüssel zu einer endgültigen Fluo-04.00-Konzentration von 10 mM. Alternativ können Pluronsäure verwendet werden, um Farbstoffbeladung Effizienz zu erhöhen.
  2. Laden für 60 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  3. Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml Fluo-4 AM-haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml-Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung.
  4. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen.
  5. Um die Funktion der Mitochondrien zu visualisieren, zu übertragen 500 ml Isotonic Tyrode-Lösung von Gericht mit FDB-Fasern in ein Röhrchen mit 5 ml TMRE Lager (1 mM), Mix, und fügen Sie zurück in die Schale für eine endgültige Konzentration von 50 nM.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
  7. Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml TMRE haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen.
  9. Die Schale in dem konfokalen Mikroskop und wählen Sie eine intakte Faser mit klaren Rillen und einer glatten sarkolemmalen Membran für Experimente.
  10. Positionieren Sie die Spitze des Perfusionssystems 400-500 um weg von der Zielmuskelfaser und aus der Mitte mit Mikromanipulator Kontrollen.
  11. Beginnen Fluss des Isotonische Tyrode-Lösung, um sicherzustellen, dass die FDB Faser bleibt an seinem Platz.
  12. Nehmen Sie das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 AM mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv und begeistern Fluo-4 AM mit einArgon-Laser (Anregungswellenlänge 488 nm) und Rekordemissionssignale (Wellenlänge 510-580 nm). Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist proportional zu der relativen Höhe der intrazellulären Ca 2 +-Konzentration ([Ca 2 +] i).
  13. Induzieren die Ca 2 +-Transienten durch Änderung der osmotische Druck der extrazellulären Lösung, um auf osmotischen Stress Faser herzustellen. Perfusion zunächst die Fasern mit isotonischer Tyrode-Lösung (290 mOsM) (Basissammlung für 60 sec) und anschließend mit Tyrode-hypotonischen Lösung (170 mOsM) für 100 Sekunden, um das Quellen zu induzieren. Perfundieren die FDB Fasern zurück mit Isotonische Tyrode-Lösung. Im allgemeinen wird nur ein osmotischer Schock auf einen einzigen intakten Faser in einem Delta TPG Schale und den Funkenereignisse letzten 10 min für die Datenerfassung angelegt wird.
  14. Datensatz räumliche Lokalisierung von Ca 2 + Funken (Fig. 2) unter Verwendung einer Zeitreihe von xy zweidimensionalen Bildern mit Scan-Geschwindigkeit von 166 LPS (Zeile pro Sekunde, und each Linie von 512 Pixeln, was zu 3,08 sec / Rahmen) für jede Bedingung der isotonischen (1 min umfasste), hypotone Stress (100 sec) und Post-hypotone Stress (5 min). Speichersignale für die Offline-Analyse, um die Verteilung und die Häufigkeit von Ca 2 + Funken nach Abschluss des Experiments zu bewerten.
  15. Suchen Sie eine neue Faser auf einem neuen Teller und folgen den gleichen osmotischen Schock-Protokoll zu induzieren Ca 2 +-Transienten. Verwenden Sie einen konfokalen Zeilen (xt)-Modus (512 Pixel in der Länge, Abtastrate von 2 ms / Zeilen Ca 2 +-Transienten für eine Minute (dh 30.000 Zeilen) mit dem konfokalen Scanlinie direkt unter sarkolemmalen Membran platziert aufzuzeichnen (Abbildung 3 ). Ändern Sie den Zeilen zu unterschiedlichen Fokusebenen zu drei aufeinanderfolgende Serie (bei ​​1-min-Takt) des Linescans für die Analyse der Größe und der Kinetik der einzelnen Ca 2 +-Sparks aufzeichnen.

4. Datenanalyse

  1. Sammeln einer großen Anzahl vonxt Zeilen Spuren, die Morphologie und die Kinetik der einzelnen Ca 2 +-Sparks-Parameter zu bewerten, dh die Amplitude (F / F 0; wobei F 0 ist die Ruhe Ca 2 +-Fluoreszenz), Anstiegszeit, Zeit bis zum Gipfel, Dauer (FDHM , Vollzeit bei halber Größe) und räumliche Breite (FWHM, volle Breite bei halber Größe) der aufgezeichneten Funken. Diese Parameter stellen die grundlegenden Eigenschaften des Gating RYR Ca 2 +-Kanäle wie das Ca 2 +-Fluss (Amplitude) und Gating-Kinetik des RyRs (Dauer).
  2. Analysieren Sie digitale Bilddaten mit einem speziell entwickelten, halbautomatische Algorithmus, der mit Bildbearbeitungssprache IDL (Interactive Data Language) erstellt wurde, wie zuvor beschrieben, 11,16. Weil die einzigartige Kinetik der Ca 2 +-Freisetzung im Fall von Ca 2 +-Sparks in FDB Fasern durch osmotischen Stress induziert, ist es besser, die manuelle und automatisierte Funktionen von Ca 2 + Veranstaltungen kombinieren FunkeIdentifikation und Bearbeitung mit dieser Bild custom-build-Analyseprogramme 11. Dieser Algorithmus ist sehr nützlich, wenn es notwendig ist, in einigen Muskelerkrankung Modelle manuell identifizieren ROI (Region of Interest). Sobald ein ROI definiert ist, könnte der Algorithmus die oben genannten Parameter Funken, die dann auf Excel-Datei exportiert werden könnten, automatisch abzuleiten. Alternativ kann die Öffentlichkeit verfügbaren Bildverarbeitungssoftware, wie zB SparkMaster in ImageJ, verwendet, um die kinetischen Eigenschaften von Ca 2 + Funken und ihre räumliche Verteilung im Skelettmuskel 17 definieren.

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Representative Results

Frühere Studien zeigten, dass vorübergehende hypoosmotischen Stress induzierte periphere Ca 2 + Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern 11. Abbildung 1 zeigt die Bilder der intakten einzelnen Muskelfasern mit glatten sarkolemmalen Membran und charakteristischen Rillen klar. Abbildung 2 zeigt typische Ca 2 + Funken (als xy-Bilder) wurden durch transiente (100 sec) Behandlung mit einer Lösung, die die hypoosmotischen FDB Muskelfasern von jungen, gesunden Mäusen schwillt induziert. Da die Muskelfaser schrumpft zurück auf das ursprüngliche Volumen, wird ein robuster Ca 2 +-Antwort Funken direkt unter dem Sarkolemm der Muskelfaser sein. Diese xy Bilder werden verwendet, um Funkenfrequenzen berechnen und zeichnen den Zerfall Profil für diese Antwort. Abbildung 3 zeigt typische Linienscans (xt) mit dieser Art der Analyse Funken erzeugt. Das konfokale Scanlinie direkt unter der sichsarkolemmalen Membran (3A). Die Zeitreihen der Funke Ereignisse erfasst und die angegebene ROI (Region of Interest) konnte mit unseren Kunden entwickelt, halbautomatische "Funken Fit"-Programm (3B) identifiziert werden. 3C zeigt einen typischen Spark-Fit Analyse der Amplitude und Kinetik der gegebenen Ca 2 + Funken. Die Ca 2 +-Funkenintensität wird als die Amplitudenänderung des Fluo-4-AM-Signale (Δ F / F 0, wobei F die Peakintensität Fluo-4 und F 0 die Ruhe Fluo-4 Intensität vor Funken entstehen) berechnet. Die Dauer des Funkens durch FDHM (gesamte Dauer der halben Grße) und der Anstiegszeit als auch die Zeit bis zum Peak kann auch berechnet werden, dargestellt. Ein typisches 3D (dreidimensional) Darstellung kann von bestimmten ROIs gemacht werden, um Ca 2 + Intensitätsänderung (3D) zu zeigen. Abbildung 4 zeigt Bilder von Ca 2 + FunkeLinescans von Skelettmuskelfasern unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Zuständen. Line-Scan (xt)-Serie von Ca 2 + Funken von gesunden, jungen (3 Monate) abgeleitet Wildtyp-Muskel (4A), und im Alter (22 Monate) Muskel (4B). Beachten Sie die reduzierten Signal, die im Alter von Muskelfasern auftritt. Die jungen mdx-Muskelfasern anzuzeigen robust Ca 2 +-Sparks (4C). Abbildung 5 zeigt Ca 2 +-Sparks (xy-Bilder) aus extensor digitorum longus (EDL) Muskelfasern aus dem Wildtyp (5A) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) Erkrankung, eine Erkrankung der Motoneuronen mit charakteristischen Muskelatrophie und beschädigte Mitochondrien (Fig. 5B). Die Ca 2 +-Intensitäten Show von Fluo-4-Signale (grün, links Panels) und den Mitochondrien Atmungszustände werden durch TMRE Signale (rot, rechte Felder) gezeigt. Beachten Sie, dass ter beschädigte Mitochondrien (verlieren TMRE Signal) birgt robust Ca 2 + Funken.

Figur 1
Fig. 1 ist. Schematische Protokoll von Calcium-Funken Beurteilung in intakten Skelettmuskelfasern. Schematische Protokoll von Calcium-Funken Beurteilung in intakten Skelettmuskelfasern. Dies zeigt, schrittweise vor, um intakt FDB Muskelfasern für die Analyse und den Aufbau der Perfusion System osmotischen Stress auf Fasern induzieren erhalten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2 2. Repräsentative Ca 2 +-Sparks (XY-Bilder) Episoden der FDB Skelettmuskelfasern. Die mittlere Kurve zeigt die Zeitleiste und die entsprechenden xy Bilder (Deckplatten) auf die sequentielle osmotischen Druckänderung in den Protokollen. Top linke Tafel - Faser mit Isotonische Tyrode-Lösung behandelt, oben in der Mitte-Panel - Faser mit Hypotone Tyrode-Lösung behandelt, und oben rechts Panel - Faser zurück auf die Behandlung mit Isotonische Tyrode-Lösung. Ein Vertreter Histogramm der mit xy-Bildgebung beobachtet Funke Episoden ist auf dem Boden gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. Repräsentative Ca 2 + spa rks (Linie scannt xt-Bilder) und Spark-Fit-Analyse (A) Konfokale Zeilen (rot gestrichelte Linie) steht direkt unter der sarkolemmalen Membran der Muskelfaser platziert;. (B) osmotischen Stress hervorgerufen diskreten Ca 2 +-Sparks als Zeilen vorgestellt (xt)-Modus. (C) Funkenanalyse mit Spark-Fit-Algorithmus, um die Ca 2 +-Intensität (Δ F / F 0), die proportional zu der SR-Ca 2 +-Freisetzung Flusses zu zeigen, und die Kinetik (Dauer, wie FDHM dargestellt). (D) Dreidimensionale Handlung eines Fluo-4-Zeilen Bild zeigt die osmotischen Stress hervorgerufenen Funken in räumlich-zeitlichen Modus und deren Intensitäten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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4. Repräsentative Ca 2 +-Sparks in der Muskel physiologischen und pathophysiologischen Zustände in Reaktion auf osmotischen Stress (A) Linienscans (xt-Bilder) von Ca 2 + Funken von jungen abgeleitet (3 Monate) gesund FDB Muskelfasern;. (B) im Alter von Funken ( 22 Monate) FDB Muskelfasern und (C) Funken von jungen (3 Monate) dystrophischen mdx-Maus FDB Muskel. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 5
5. Repräsentative Ca 2 +-Sparks (XY-Bilder) von FDB Muskeln in Reaktion auf osmotischen Stress. (A 2 +-Sparks (XY-Bilder) aus Wildtyp-FDB Muskeln und (B) Ca 2 +-Sparks von ALS Muskeln. FDB Muskelfasern gleichzeitig mit Fluo-04.00 beschriftet (Ca 2 +, grüne Signale, linken Panels) und TMRE (Mitochondrien, rote Signale auf die richtigen Platten). Bilder zeigen Transienten vor und nach der osmotischen Druckänderungen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Diese Methode zur Beurteilung der Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskel ist ein nützliches Werkzeug für Muskelphysiologie und Krankheitsforschung. Wir zeigten, dass die Ca 2 +-Funken Reaktion wurde unter verschiedenen Bedingungen verändert wurde, einschließlich Muskeldystrophie 11, Alterungs 18, 19, sowie in der amyotrophen Lateralsklerose 20. Unsere aktuelle Studie ergab auch, funktionelle Kopplung zwischen IP 3-Rezeptor und RyR, die eine wichtige Komponente, die Ca 2 +-Sparks-Aktivierung in Skelettmuskelfasern 21 beiträgt. Mehrere andere Forschungsgruppen auch diese Technik angepasst, um die funktionellen Aktivitäten und die Wirksamkeit von Gen-Rettungsstrategien der dystrophischen Muskeln 12 zu erkunden, und verknüpfen Ca 2 + Funke Signalisierung zu veränderten Redox-Spannung in einigen Krankheits 13,22. Die Tatsache, dass Membranverformung durch osmotischen Stress die Unterdrückung der DHPR auf RYR entspricht, zu entlastenlates gut mit dem wesentliche Rolle der physikalischen Wechselwirkung (Kopplung) von DHPR-RYR bei der Modulation der Ca 2 +-Sparks bei der Differenzierung von Skelettmuskel-23, und so weiter dieser Ergebnisse implizieren Ca 2 +-Sparks als wichtige physiologische Ereignisse. Der weitere Ausbau dieser Technik auf einige physiologische, Inhibitoren gelten für Ca 2 +-Sparks modulieren liefert aufschlussreiche Informationen über die Ca 2 + Signal in den Zellen 24.

Der wichtigste Schritt der Assay zu isolieren und zu identifizieren intakten Muskelfasern unter dem Mikroskop vor der Ca 2 +-Farbstoffbeladung. Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist das Kollagenaseverdau Zeit und Temperatur verändert diese Bedingungen könnten im Zellmembran Schäden während der Faserisolierung. Ein Faser müssen fest im Boden der Delta TPG Gerichte angebracht werden und zeigen intakte Morphologie mit charakteristischen geraden, stabförmigen Aussehen, Größe von 70-100 _6, m (Länge) und 8-18 um (Querdurchmesser), gleichmäßige Streifenmuster und eine glatte sarkolemmalen Membran für Ca 2 +-Sparks-Messung nützlich zu sein. Eine Verbesserung bei der bisherigen Grenzen der Datenerhebung ist die Messungen an verschiedenen Brennebenen innerhalb jeder Faser die genaueste Messwerte möglich über die Ca 2 +-Sparks zu erfassen. Obwohl wir eine benutzerdefinierte abgeleitete "Spark Fit"-Algorithmus, um Funkenfrequenz, Dynamik und Eigenschaften zu analysieren, sind ähnliche Programme zur Verfügung, um Public Domain zur Analyse Funke Parameter Eigenschaften wie "SparkMaster" in ImageJ 17. Leichte Modifikationen an diesem Verfahren könnte bessere Visualisierung ermöglichen Ca 2 + Funken in anderen Gewebearten, die auf osmotischen Stress reagieren vermittelte Auslösung des Ca 2 +-Freisetzung aus dem Ryanodin-Rezeptor.

Visualisierung von lokalen und globalen Ca 2 +-Signale in der Erwachsenenskelettmuskelfasern ist ein sehr nützliches Werkzeug, for Muskelphysiologie und Herzkreislaufforschung. Erweiterung der Methode für den Nachweis von Ca 2 +-Sparks in der Skelettmuskulatur zusammen mit verschiedenen Tiermodellen menschlicher Erkrankungen Forschung und Umsetzung der leistungsfähigen Molekularbiologie Ansätze (z. B. Gen-Überexpression oder Gen-Silencing) sollten große Informationen über die Regulierung der Ca 2 + erzeugen Signalisierung in die menschliche Gesundheit und Krankheiten.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von RO1-AG028614 JM, RO1-AR063084to NLW und RO1-AR057404 JZ unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit DOW CORNING 184 SIL ELAST KIT Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate. 
60 mm glass Petri dish  Pyrex 3160 Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution  Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution  Sigma-Aldrich
Collagenase type I  Sigma-Aldrich C-5138 Fiber digestion 
Fluo-4 AM  Invitrogen F14201 Fluorescent Ca2+ imaging dyes 
TMRE Invitrogen T669 mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes  Bioptechs 0420041500C 35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator Narishige International MHW-3
Temperature controllable orbital shaker New Brunswick scientific Fiber dissociation

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References

  1. Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease. Pharmacol. Rev. 63, (3), 700-727 (2011).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium sparks. Physiol. Rev. 88, (4), 1491-1545 (2008).
  3. Brochet, D. X., et al. Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart. Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).
  4. Brochet, D. X., et al. Quarky calcium release in the heart. Circ. Res. 108, (2), 210-218 (2011).
  5. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. Imaging calcium sparks in cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).
  6. Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, (9), 763-772 (2006).
  7. Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target. Curr. Drug Targets. 12, (5), 709-723 (2011).
  8. Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle. J. Physiol. 537, 379-389 (2001).
  9. Zhou, J., et al. A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290, (2), 539-553 (2006).
  10. Zhou, J., et al. Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle. Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122, (1), 95-114 (2003).
  11. Wang, X., et al. Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle. Nat. Cell. Biol. 7, (5), 525-530 (2005).
  12. Teichmann, M. D., et al. Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression. PLoS One. 3, (11), e3644 (2008).
  13. Shkryl, V. M., et al. Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers. Pflugers. Arch. 458, (5), 915-928 (2009).
  14. Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297, (3), 571-580 (2009).
  15. Weisleder, N., Ma, J. J. Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy. Acta. 27, (7), 791-798 (2006).
  16. Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers. Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).
  17. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293, (3), 1073-1081 (2007).
  18. Weisleder, N., et al. Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release. J. Cell. Biol. 174, (5), 639-645 (2006).
  19. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Res. Rev. 7, (3), 177-188 (2008).
  20. Yi, J., et al. Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling. J. Biol. Chem. 286, (37), 32436-32443 (2011).
  21. Tjondrokoesoemo, A., et al. Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle. J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).
  22. Martins, A. S., et al. Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 586, (1), 197-210 (2008).
  23. Apostol, S., et al. Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells. J. Muscle Res. Cell Motil. 30, (3-4), 97-109 (2009).
  24. Jiang, Y. L., et al. Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes. J. Biol. Chem. 288, (15), 10381-10394 (2013).

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