कीट उड़ान व्यवहार की निगरानी के लिए प्रारंभिक रूपांतरित निवेशन प्रौद्योगिकी

1Department of Electrical and Computer Engineering, North Carolina State University
* These authors contributed equally
Published 7/12/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Verderber, A., McKnight, M., Bozkurt, A. Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring. J. Vis. Exp. (89), e50901, doi:10.3791/50901 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

इलेक्ट्रोड डालने, यहां तक कि telemetric रिकॉर्डिंग अनुप्रयोगों के लिए कीड़ों से जुड़ी इलेक्ट्रॉनिक प्रणालियों के साथ, प्राकृतिक उड़ान 1 के दौरान कैसे तंत्रिका प्रणाली समारोह को समझने के लिए एक प्रमुख विधि से किया गया है. कीड़ों में कृत्रिम सिस्टम संलग्न या दाखिल कीट की प्राकृतिक उड़ान को परेशान करने की क्षमता से जुड़े कई चुनौतियों के समक्ष रखी गई है. सतही लगाव या वयस्क कीट पर कृत्रिम प्लेटफार्मों की शल्य प्रविष्टि के कारण शरीर प्रेरित Inertial और तनाव बलों की वजह से डाला उपकरणों के संभावित स्थानांतरण के लिए अविश्वसनीय है. अल्पज्ञता संलग्न या शल्य चिकित्सा द्वारा डाला इलेक्ट्रोड भी एक विदेशी शरीर के रूप में कीड़ों द्वारा अस्वीकार कर दिया होने का खतरा है. इसके अलावा, आरोपण आपरेशन बहिःकंकाल के आसपास तराजू और बवासीर को हटाने की आवश्यकता है. मोटी छल्ली परत भी है, जिससे कीट की प्राकृतिक उड़ान के साथ हस्तक्षेप, जमानत के ऊतकों को नुकसान का कारण बन सकता है जो शल्य innervations के लिए प्रवेश कर जाने की जरूरत है. सभी टीhese कारकों एक शल्य चिकित्सा या सतही आरोपण ऑपरेशन एक चुनौती है और नाजुक काम कर सकते हैं. बाह्य कीटों को नियंत्रण और संवेदन प्रणालियों संलग्न में शामिल इन चिंताओं को कम करने के लिए, रूपांतरित विकास से जुड़े एक उपन्यास पद्धति इस आलेख में वर्णित किया जाएगा.

holometabolic कीड़ों का रूपांतरित विकास एक मध्यवर्ती पोटा संबंधी मंच (चित्रा 1) के साथ एक वयस्क में लार्वा (या अप्सरा) के परिवर्तन के साथ शुरू होता है. कायापलट प्रक्रिया remodeling द्वारा पीछा अध: पतन सहित एक व्यापक ऊतक reprogramming शामिल है. इस बदलाव में कई जटिल व्यवहार 2,3 प्रदर्शन कीट एक वयस्क के लिए एक स्थलीय लार्वा बदल जाता है.

सर्जरी जल्दी रूपांतरित चरणों 4,5 के दौरान प्रदर्शन किया गया जहां चरम parabiotic सर्जरी के बाद कीड़ों के अस्तित्व का प्रदर्शन किया गया है. इन ऑपरेशनों में, विकास ऊतकजनन causएड शल्य घाव कम durations में मरम्मत की. विद्युत प्रवाहकीय इलेक्ट्रोड का आरोपण रूपांतरित विकास के पहले चरण (चित्रा 1) के दौरान प्रदर्शन किया गया था, जहां इन टिप्पणियों के बाद, एक नई तकनीक विकसित की गई है. इस कीट के 6 पर एक biomechanically सुरक्षित लगाव सक्षम बनाता है. एक अत्यंत विश्वसनीय इंटरफेस भी कीट के तंत्रिका और neuromuscular प्रणाली 7 के साथ सुरक्षित है. इस तकनीक "प्रारंभिक कायापलट निवेशन प्रौद्योगिकी" (फेंकना) 8 के रूप में जाना जाता है.

पूरे ऊतक प्रणाली के पुनर्निर्माण के बाद, प्यूपा में डाला संरचनाओं वयस्क कीट के साथ उभरेगा. फ्लाइट मांसपेशी समूहों कुल वक्ष शरीर द्रव्यमान का 65% करने के लिए बनाने के लिए और, इस प्रकार, फेंकना प्रक्रिया 9 के लिए एक अपेक्षाकृत सुविधाजनक लक्ष्य है. बुनियादी विंग धड़कन के दौरान, dorsolongitudinal (डीएल) शक्ति उड़ान की आकृति विज्ञान और dorsoventral में परिवर्तन (डीवी) की मांसपेशियों को पंख articulat कारणलिफ्ट 10 उत्पन्न करने के लिए आयन ज्यामिति. इसलिए डीएल और डीवी मांसपेशियों के कार्यात्मक समन्वय उड़ान Neurophysiology के तहत एक सक्रिय अनुसंधान विषय रहा है. इलेक्ट्रॉनिक रूप क्रमादेशित दृश्य वातावरण में tethering कीड़े जटिल locomotory व्यवहार 11,12 के Neurophysiology के अध्ययन के लिए सबसे आम तरीका है. प्रकाश उत्सर्जक डायोड पैनल से बना बेलनाकार एरेनास उड़ान कीड़े बीच में सीमित कर रहे हैं और प्रस्ताव को गतिशील आसपास के मनोरम दृश्य प्रदर्शन को अद्यतन करने से प्रेरित है, जहां इन आभासी वास्तविकता वातावरण के लिए इस्तेमाल किया गया है. ऐसे ड्रोसोफिला फल मक्खी के रूप में छोटे कीड़े, के मामले में, tethering कीट के पृष्ठीय छाती के लिए एक धातु पिन संलग्न और एक स्थायी चुंबक 13,14 के तहत पिन रखकर हासिल की है. इस विधि केवल किसी भी electrophysiological विश्लेषण के बिना उच्च गति कैमरों के साथ दृश्य टिप्पणियों के माध्यम से मोटर प्रतिक्रियाओं की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस methआयुध डिपो Manduca sexta का बड़ा और भारी शरीर को निलंबित करने के लिए अक्षम किया गया है. इस समस्या को हल करने के लिए हम उनके नीचे से जुड़े मैग्नेट विद्युत चुम्बकीय बलों के माध्यम से उत्तोलित कर रहे हैं के साथ हल्के वजन फ्रेम जहां चुंबकीय उड़ती तख्ते से लाभान्वित. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तंत्रिका एम्पलीफायरों और एलईडी सरणियों के साथ संयुक्त, यह उड़ान मोटर उत्पादन को नियंत्रित करने और Manduca sexta के संबंधित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्ड करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आवश्यक सामग्री और अभिकर्मकों के स्रोत नीचे "अभिकर्मकों" तालिका में प्रदान की जाती है.

1. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कनेक्शन के लिए मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) की तैयारी

ध्यान दें: एक व्यावहारिक प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करने के लिए, तार इलेक्ट्रोड एक FFC (लचीला फ्लैट केबल) कनेक्टर में इन इलेक्ट्रोड डालने के लिए एक पीसीबी को soldered हैं.

  1. टुकड़े टुकड़े पहने कॉपर की एक 0.5x5 2 सेमी टुकड़ा काट.
  2. एक ठीक टिप मार्कर का उपयोग करना, मुखौटा पैटर्न नक़्क़ाशी के रूप में तीन 0.1x5cm 2 आयत पैड आकर्षित.
  3. एक हवादार क्षेत्र या धूआं हुड के अंदर एक पीसीबी एचेंट का उपयोग कर अवगत कराया टुकड़े टुकड़े खोदना. गैर प्रतिक्रियाशील टेप के साथ टुकड़े टुकड़े कटआउट की लंबाई के बारे में 1 सेमी कवर. पीसीबी एचेंट और टेप स्कॉच टेप के साथ स्नातक की उपाधि प्राप्त बीकर के अंदर करने के लिए तांबे के टुकड़े टुकड़े कटआउट के कम से कम 100 मिलीलीटर के साथ एक स्नातक की उपाधि प्राप्त बीकर भरें. तांबे के टुकड़े टुकड़े cutou के आधाटी पीसीबी एचेंट में डूबे हुए किया जाना चाहिए.
  4. 20 मिनट के लिए घूर्णन एक मंच पर बीकर रखें.
  5. एचेंट से कटआउट निकालें और 10 मिनट के लिए पानी से भरे एक बीकर में जगह है.
  6. एक टिशू पेपर का प्रयोग, isopropyl शराब लागू करते हैं और गैर etched तांबे पैड का पर्दाफाश करने के चिह्नों को हटा दें.
  7. लगभग 1 सेमी लंबी छोटे वर्गों में मुद्रित सर्किट बोर्ड में कटौती.
  8. 3 सेमी प्रत्येक की लंबाई करने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग लेपित, annealed, स्टेनलेस स्टील के तार के दो टुकड़े (नंगे 0.11 "0.008, लेपित") में कटौती. स्टेनलेस स्टील के तार के इन टुकड़ों को कीट की छाती में डाला जाएगा कि सक्रिय इलेक्ट्रोड हैं.
  9. एक ब्लेड का उपयोग करना, प्रत्येक तार के प्रत्येक के अंत से प्लास्टिक कोटिंग के 4-5 मिमी हटा दें. एक माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल की सिफारिश की है.
  10. जमीन इलेक्ट्रोड के लिए एक टिप एक्सटेंशन बनाने के लिए अछूता स्टेनलेस स्टील के तार के एक 0.7 सेमी टुकड़ा काट. धीरे से एक ब्लेड के साथ कोटिंग हटाने या एक टांका आईआर की गर्मी से यह पिघलाके रूप में कदम 1.9 में प्रदर्शन पर.
  11. जमीन कनेक्शन के लिए, 4.5 सेमी की लंबाई के लिए लचीला (Litz या प्रारंभ करनेवाला) तार का एक टुकड़ा काट.
  12. कदम 1.11 में तैयार जमीन कनेक्शन तार करने के लिए कदम 1.10 में तैयार स्टेनलेस स्टील की 0.7 सेमी टुकड़ा मिलाप. एक उजागर स्टेनलेस स्टील टिप जमीन कनेक्शन के अंत में होना चाहिए.
  13. दृढ़ता से एक गैर प्रतिक्रियाशील टेप का उपयोग सोल्डर कार्यक्षेत्र के लिए तैयार इलेक्ट्रोड बोर्ड टेप. इलेक्ट्रोड soldered किया जाएगा जहां बोर्ड पर पैड के सभी लेकिन 1-2 मिमी मुखौटा करने के लिए टेप का प्रयोग करें. पैड का यह नकाबपोश, मिलाप मुक्त अंत कदम 4.1 में वर्णित FFC कनेक्टर में डाला जाएगा.
  14. प्रत्येक के एक छोर इलेक्ट्रोड बोर्ड पर संगत पैड को soldered किया जा सकता है कि इस तरह के तीन इलेक्ट्रोड तारों संरेखित करें. आसान टांका लगाने के लिए इलेक्ट्रोड पैड भर में स्टेनलेस स्टील के प्रवाह को लागू करें.
  15. पैड पर उजागर इलेक्ट्रोड का प्रत्येक मिलाप.
  16. 10 मिनट के लिए एसीटोन और isopropyl शराब में इलेक्ट्रोड विसर्जितप्रत्येक मिलाप अवशेषों को साफ करने के लिए. एक अल्ट्रासोनिक स्नान में इस्तेमाल की सफाई प्रदर्शन में सुधार.

Manduca Sexta Pupae करने के लिए 2. सर्जिकल निवेशन

नोट: कीड़े दिन और रात के बीच संक्रमण के दौरान सबसे अधिक सक्रिय हो जाएगा. इसलिए, एक कृत्रिम दिन / रात चक्र स्वत आउटलेट टाइमर का उपयोग कर एक कीट कक्ष के भीतर स्थापित किया जाना चाहिए. ये एक 7 घंटा अंधेरे और 17 घंटा प्रकाश चक्र अनुकरण करने के लिए सेट किया जाना चाहिए.

  1. एक उपयुक्त प्रविष्टि समय निर्धारित करने के लिए दैनिक Manduca sexta pupae जांच करते हैं. pupae पंख काले धब्बे प्रदर्शन के बाद लगभग एक दिन प्रविष्टि के लिए तैयार हैं.
  2. Pupae anesthetize करने के लिए, लगभग 6 घंटे के लिए फ्रिज (4C) में उन्हें जगह है.
  3. प्रविष्टि कार्यक्षेत्र तैयार करें. कार्यक्षेत्र isopropyl शराब, तेज चिमटी, ब्लेड, और एक 30 ग्राम चमड़े के नीचे सुई को शामिल करना चाहिए. एक विकल्प के रूप में, cyanoacrylate चिपकने वाला इलेक्ट्रोड निर्धारण को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. उन्हें सूई या isopropyl शराब के साथ पोंछते द्वारा सुई, चिमटी, और इलेक्ट्रोड जीवाणुरहित.
  5. फ्रिज से प्यूपा निकालें और कार्यक्षेत्र को हस्तांतरण.
  6. ब्याज की पेशी समूह से मेल खाती है कि छाती पर स्थान निर्धारित करते हैं. इस उदाहरण में काम का ध्यान विंग upstroke आंदोलन के लिए जिम्मेदार dorsoventral मांसपेशियों है.
  7. एक तेज ब्लेड का प्रयोग, धीरे exocutical परत के माध्यम से एक 1x1 सेमी 2 आयत खरोंच. चिमटी का प्रयोग, धीरे धीरे इन टुकड़ों को छील.
  8. (वैकल्पिक) छाती के संपर्क में क्षेत्र से पंख बाल हटाने के लिए एक निर्वात का उपयोग करें.
  9. धीरे धीरे पंख पेशी समूह को लक्षित दो प्रविष्टि अंक बनाने के लिए छाती को देते हैं जहां mesothorax में 5 मिमी के बारे में सुई डालने.
  10. चिमटी का प्रयोग, दो प्रविष्टि अंक में दो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड गाइड.
  11. (वैकल्पिक) इलेक्ट्रोड के आसपास बालों को साफ, यांत्रिक स्थायित्व को बढ़ाने के लिएऔर उदारता से एक तार applicator के साथ छाती पर प्रत्येक प्रविष्टि बिंदु के आसपास cyanoacrylate चिपकने वाला लागू होते हैं.
  12. कीट उद्भव पर चढ़ाई कर सकते हैं इतना है कि दीवारों और छत को कवर उचित सामग्री (किसी न किसी और textured) के साथ उद्भव के लिए एक पिंजरे तैयार करें. छिद्रित गत्ता बक्से या पैकिंग पेपर का इस्तेमाल किया जा सकता है.
  13. लगभग 6 सेमी लंबाई और 2 मिमी व्यास के साथ एक कठोर निर्धारण छड़ी तैयार करें. प्लास्टिक stirrers, एक कपास झाड़ू, या धातु के तारों इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  14. ध्यान से फैलने वाला सूंड नीचे छेद के माध्यम से इस छड़ी स्लाइड.
  15. प्यूपा आसपास रोल नहीं कर सकते हैं कि इस तरह के पिंजरे सतह पर छड़ी के दोनों किनारों को ठीक करें. Mesothorax सामना करना पड़ रहा है कि इस तरह के पिंजरे के अंदर प्यूपा स्थिति. व्यापक आंदोलन hemolymph के इलेक्ट्रोड, नुकसान को नुकसान हो, या प्रविष्टि बेकार प्रदान कर सकते हैं.

3. Manduca Sexta में ग्राउंड इलेक्ट्रोड डालने

नोट: जमीन (उल्लेखखिलाडि़यों) इलेक्ट्रोड संकेत युग्मन से बचने के लिए छाती के पेट या बाहर का भागों में डाला जाना चाहिए. इस प्रविष्टि पोटा संबंधी विकास के बाद के चरणों के दौरान या कीट उभर के बाद भी किया जा सकता है. जमीन इलेक्ट्रोड के लिए खिड़की एक पोटा संबंधी या वयस्क अवस्था जमीन इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के लिए या तो पोटा संबंधी चरण में तैयार हो गया है.

  1. पोटा संबंधी अवस्था प्रविष्टि के लिए: सक्रिय इलेक्ट्रोड के आसपास mesothoracic छल्ली के छीलने के बाद (कदम 2.7 देखें), exocutical परत के माध्यम से एक और आयत खरोंच 30 ग्राम चमड़े के नीचे का उपयोग बंद करे छाती को पृष्ठीय पेट पर (0.5x0.5 चारों ओर सेमी 2) सुई. धारा 2 में वर्णित तकनीक का उपयोग इस विंडो में जमीन इलेक्ट्रोड डालें.
  2. वयस्क अवस्था जमीन इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के लिए: कीट उभरा है एक बार, स्थिर 6-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें.
    बचे हुए चरणों पोटा संबंधी और वयस्क अवस्था सम्मिलन दोनों के लिए ही कर रहे हैं.
  3. INSER तैयार करें isopropyl शराब, तेज चिमटी, एक 30 ग्राम चमड़े के नीचे सुई, cyanoacrylate चिपकने वाला, गोंद के आवेदन के लिए तार का एक टुकड़ा, एक थर्मल cauterizer (वैकल्पिक), और एक दंत मोम छड़ी (वैकल्पिक) सहित tion कार्यक्षेत्र.
  4. लगभग 1-2 सेमी की दूरी पर पीछे पेट के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से एक सम्मिलन बिंदु का पता लगा.
  5. धीरे धीरे पेट पंचर और एक प्रविष्टि साइट प्रदान करने के लिए सुई डालें.
  6. चिमटी का प्रयोग सावधानी से प्रविष्टि साइट में जमीन इलेक्ट्रोड डालने और यह गहरी 3-4 मिमी है जब तक दबाव लागू होते हैं. जगह में इलेक्ट्रोड पकड़ो और सम्मिलन स्थल के आसपास गोंद लागू करने के लिए एक तार का उपयोग करें.
  7. (वैकल्पिक), यांत्रिक शक्ति बढ़ाने थर्मल cauterizer का उपयोग करें और टिप में मोम के एक छोटे (2-3 मिमी) मनका लेने के लिए. प्रविष्टि साइट के करीब टिप प्लेस और मोम इलेक्ट्रोड के चारों ओर और जगह में मजबूती से यह मानती है कि गर्मी में इस तरह लागू होते हैं.

एडाप्टर बोर्ड की 4. तैयारी

"ontent> ध्यान दें:. एक एडाप्टर बोर्ड एक FFC (फ्लैट लचीला केबल) कनेक्टर के माध्यम से वायरलेस रिकॉर्डिंग headstage के लिए इलेक्ट्रोड बोर्ड कनेक्ट करने के लिए आवश्यक है इस के लिए, इलेक्ट्रोड बोर्ड के लिए इसी तरह एक बोर्ड का पालन करके तैयार रहने की जरूरत 1.1-1.7 कदमों .

  1. तैयार बोर्ड के एक छोर से एक FFC कनेक्टर मिलाप.
  2. दूसरे छोर पर तीन पैड के लिए तारों को हुक तीन 30 AWG (अमेरिकी वायर गेज) मिलाप.
  3. अगले चरण में वर्णित के रूप में आस्टसीलस्कप रीडिंग के लिए एडाप्टर बोर्ड पर तीन पैड को तीन मिनी कनेक्टर्स मिलाप.
  4. Headstage कनेक्टर को इन तीन तारों के दूसरे छोर मिलाप.
  5. उत्तोलन फ्रेम के शीर्ष पर headstage सर्किट बोर्ड सुरक्षित.

5. आस्टसीलस्कप (वैकल्पिक) के साथ Prerecording

नोट: इलेक्ट्रोड की विश्वसनीयता का आकलन और शोर अनुपात करने के लिए संकेत का पालन करने के लिए, सीमित आस्टसीलस्कप रिकॉर्डिंग wirel तैनाती से पहले प्राप्त किया जा सकता हैईएसएस रिकॉर्डिंग सिस्टम. एडाप्टर बोर्ड पर मिनी तार connectors इस बात के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

  1. एक बाह्य तंत्रिका रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर को आस्टसीलस्कप कनेक्ट करें. 1 हर्ट्ज, 20 kHz के एक कम पास कट ऑफ आवृत्ति, और 100 का एक लाभ का एक उच्च पास कट ऑफ आवृत्ति एम्पलीफायर मानकों सेट.
  2. एम्पलीफायर इनपुट चैनलों को एडाप्टर बोर्ड पर महिला मिनी तार connectors के प्रत्येक जुड़ें.
  3. यह (अपने भोर के समय के दौरान) एक सक्रिय अवस्था में है जब पिंजरे से प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड बोर्ड के साथ कीट निकालें. माप लिया जाता है उस पर पहले ही आराम करने के लिए कीट के तहत टिशू पेपर का एक टुकड़ा रखें.
  4. चिमटी का प्रयोग, अनुकूलक बोर्ड पर FFC रिसेप्टर में इलेक्ट्रोड बोर्ड स्लाइड. कीट आराम कर रहा है जब एक फ्लैट और कम वोल्टेज आधारभूत निरीक्षण और कीट अपने पंख फ्लैप के रूप में विद्युतपेशीलेख (EMG) की पीढ़ी spikes.
    नोट: representat के लिए वायरलेस रिकॉर्डिंग सिस्टम के साथ अवलोकन कीट उड़ान: धारा 6 को देखेंआस्टसीलस्कप परिणाम ive.
  5. जरूरत के रूप में आस्टसीलस्कप के देखने के मापदंडों को समायोजित करें. आस्टसीलस्कप पर डाटा कैप्चर और डेटा को बचाने के.

वायरलेस रिकॉर्डिंग सिस्टम के साथ 6. अवलोकन कीट उड़ान

नोट: एक विद्युत चुम्बकीय उत्तोलन मंच सीमित Manduca sexta उड़ान के दौरान EMG संकेतों के वायरलेस रिकॉर्डिंग के लिए बनाया जा सकता है. उत्तोलन मंच एक tethering तंत्र में संतुलन बनाया एक फ्रेम के होते हैं. उत्तोलन फ्रेम, और इसलिए कीट, tethering तारों की बाधा के बिना परीक्षण के दौरान रास्ते से हटना करने के लिए अनुमति देता है. फ्रेम एक दूसरे से जुड़ने बयान मॉडलिंग (FDM) मशीन का उपयोग तेजी से prototyped किया जा सकता है. एक चुंबक आधार मंच में मैग्नेट की एक श्रृंखला से उत्तोलित करने के लिए इस फ्रेम के नीचे से जुड़े होने की जरूरत है. कीट फ्रेम के ऊपर से निलंबित FFC कनेक्टर से जुड़ा है. इस उड़ती मंच usin निर्माण किया गया था, जो एलईडी अखाड़ा के अंदर स्थित है5x7 व्यक्ति एल ई डी के एक सरणी से बना जी 60 पैनलों. यह प्रणाली 15, 16, 17 मक्खियों फल का दृश्य उत्तेजना के लिए एक वातावरण विकसित करने के लिए स्थापित तरीकों के आधार पर किया गया था. अखाड़ा दक्षिणावर्त और counterclockwise रोटेशन के साथ ही घूर्णी गति का नियंत्रण दोनों की एक microcontroller की अनुमति अनुकरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है.

  1. उत्तोलन मंच पर अनुकूलक बोर्ड कनेक्टर को headstage जोड़ने के द्वारा वायरलेस रिकॉर्डिंग प्रणाली की स्थापना की.
  2. यह अपने भोर के समय के दौरान अधिमानतः एक सक्रिय अवस्था में है जब पिंजरे से कीट निकालें.
  3. चिमटी का प्रयोग, ध्यान कीट सेटअप के भीतर मजबूती से निलंबित कर दिया है कि इस तरह उड़ती फ्रेम पर FFC रिसेप्टर में इलेक्ट्रोड बोर्ड डालें.
  4. वायरलेस डेटा संचरण को सक्रिय करने के लिए headstage पर चुंबकीय स्विच निकट चुंबकीय छड़ी रखें. एक नीली बत्ती headstage सक्रिय है यह दर्शाता है कि पर आ जाएगा.
  5. में लाइट बंद करेंपूरी तरह अंधेरे के लिए कमरा. एक लाल दीपक के कमरे में प्रकाश जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक कंप्यूटर पर टेलीमेटरी डाटा संग्रह सॉफ्टवेयर खोलें और प्रदान की अगर उचित प्रीलोडेड विन्यास फाइल का चयन करें. देखने के संकेतों शुरू करने के लिए डाटा अधिग्रहण शुरू करो.
  6. एक विश्वसनीय वायरलेस कनेक्शन और इलेक्ट्रोड संचालन को सुनिश्चित करने के लिए वायरलेस रिकॉर्डिंग सिस्टम पर EMG संकेतों के अवलोकन के लिए प्रासंगिक यूजर इंटरफेस का चयन करें.
  7. विनियमित डीसी बिजली की आपूर्ति और microcontroller: सभी एलईडी अखाड़ा घटकों पर मुड़ें. microcontroller चक्रीय प्रकाश पैटर्न की प्रति मिनट rotations समायोजित कर सकते हैं और भी प्रकाश रोटेशन की दिशा को नियंत्रित कर सकते हैं.
  8. धीरे धीरे क्षेत्र के भीतर उत्तोलन मंच संतुलन. ध्यान से उत्तोलन आधार के केन्द्र से ऊपर फ्रेम, अन्यथा फ्रेम संभवतः कीट घायल भूमि पर जल्दी से निकाला जाएगा संरेखित करें.
  9. वीडियो रिकॉर्डिंग सिस्टम आरंभ करें.
  10. सॉफ्टवेयर की प्रासंगिक रिकॉर्डिंग टैब का चयन करेंइंटरफ़ेस. रिकॉर्डिंग समय निर्धारित करते हैं और गंतव्य फ़ाइल सहेजें. डेटा को बचाने के लिए उचित उत्पादन सेटिंग्स चुनें. सॉफ्टवेयर के भीतर एक रिकॉर्डिंग सत्र आरंभ करने के लिए शुरू बटन पर क्लिक करें. यह संख्यात्मक अभिकलन वातावरण में आयात किया जा सकता है, जो डेटा फ़ाइल की बचत होगी.
  11. कीट एल ई डी के आंदोलन के साथ मेल खाती है उस दिशा में मक्खियों के रूप में ध्यान से देखें. एल ई डी की दिशा रिवर्स और कीट दिशा पराजयों की पुष्टि करें. वांछित के रूप में इस रूप में कई बार प्रदर्शन करना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

समग्र फेंकना प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध hawkmoth का रूपांतरित चक्र और इसी इलेक्ट्रोड प्रविष्टि चरणों में प्रमुख चरणों दिखा, चित्रा 1 में प्रस्तुत किया है. इलेक्ट्रोड प्रविष्टि 4 से 7 दिनों eclosion पहले देर से पोटा संबंधी चरण में किया जाना चाहिए. यह मांसपेशी फाइबर इलेक्ट्रोड के आसपास विकसित और कीट में प्रत्यारोपण सुरक्षित करने के लिए अनुमति देता है.

दो सक्रिय इलेक्ट्रोड और जमीन इलेक्ट्रोड डाला गया है जहां एक पूरा देर पोटा संबंधी अवस्था प्रविष्टि के ठेठ परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है.

दो सक्रिय इलेक्ट्रोड और जमीन इलेक्ट्रोड डाला गया है जहां एक पूरा वयस्क अवस्था प्रविष्टि के ठेठ परिणाम चित्रा 3 में दिखाया गया है.

एलईडी अखाड़ा 4 चित्र में दिखाया गया है Manduca sexta के लिए उड़ान के दौरान मोड़ प्रेरित किया. एक microcontroller डब्ल्यूएलईडी सरणी खड़ी पैटर्न की घूर्णी गति के नियंत्रण की अनुमति के लिए प्रोग्राम के रूप में. एलईडी पैटर्न की कोणीय वेग प्रति सेकंड 7.3 डिग्री पर सेट किया गया था. चुंबकीय उत्तोलन मंच कीट आज़ादी एलईडी सरणी के जवाब में बारी करने के लिए अनुमति देने के लिए एलईडी क्षेत्र के केंद्र में रखा गया था.

चित्रा 5 पंख फड़फड़ा से पहले और बाद आस्टसीलस्कप के साथ dorsoventral मांसपेशियों से हासिल कर ली मांसपेशियों संभावित संकेत से पता चलता है. संकेत 100 बार प्रवर्धन और 1 हर्ट्ज की एक उच्च पास फिल्टर और 20 kHz के एक कम पास फिल्टर के साथ कार्रवाई की गई है. मौन की अवधि में, कोई पेशी क्षमता मनाया जाता है. पंख फड़फड़ा के दौरान मांसपेशियों क्षमता लगभग 15 हर्ट्ज-20Hz पर होते हैं.

चित्रा 6 पंख फड़फड़ा पहले और बाद में वायरलेस उपकरण के साथ हासिल कर ली मांसपेशियों संभावित संकेत से पता चलता है. मौन की अवधि में, कोई पेशी क्षमता मनाया जाता है. पेशी क्षमता durपंख फड़फड़ा आईएनजी लगभग 15Hz-20 हर्ट्ज होते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रक्रिया फेंकना. Manduca sexta पर प्रदर्शन फेंकना प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख, प्रोटोकॉल में वर्णित है.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्यूपा निवेशन. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड फेंकना का उपयोग कर सम्मिलित थे तुरंत बाद एक देर मंच प्यूपा की तस्वीर.

चित्रा 3
चित्रा 3. मोठ उद्भव. प्रत्यारोपित रिकॉर्डिंग के साथ एक वयस्क कीट की तस्वीर एक इलेक्ट्रोडfter eclosion.

चित्रा 4
चित्रा 4. रिकॉर्डिंग सेटअप. चुंबकीय उत्तोलन मंच और एलईडी अखाड़ा Manduca sexta उड़ान की मांसपेशियों से EMG संकेत रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ एक Manduca sexta परिक्रामी ले पैटर्न के जवाब में एक रास्ते से हटना पैंतरेबाज़ी प्रदर्शन कर रहा है.

चित्रा 5
चित्रा 5. आस्टसीलस्कप EMG. एक एम्पलीफायर और एक आस्टसीलस्कप का उपयोग कर एक dorsoventral पेशी के एक 2.5 सेकंड EMG रिकॉर्डिंग.

चित्रा 6
चित्रा 6. वायरलेस EMG. 1.9वायरलेस headstage रिकॉर्डिंग इकाई और डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर dorsoventral पेशी के सेकंड EMG रिकॉर्डिंग.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में डेटा रिकॉर्ड करने की क्षमता को प्रभावित करने वाले रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की शल्य प्रविष्टि के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड अपनी पृष्ठीय पक्ष पर विंग स्पॉट प्रदर्शन के बाद प्यूपा एक दिन में डाला जाना चाहिए. प्रविष्टि के दो या अधिक दिनों के इस समय के बाद किया जाता है, तो कीट के ऊतकों डाला इलेक्ट्रोड के आसपास विकसित और स्थिर करने के लिए पर्याप्त समय नहीं होगा. इस वयस्क अवस्था में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड और अविश्वसनीय रिकॉर्डिंग के आंदोलन का नेतृत्व कर सकेगी.

यह अधिक से अधिक 5 मिमी की गहराई पर पोटा संबंधी उड़ान की मांसपेशियों में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. अन्यथा, hemolymph प्रविष्टि अंक से बाहर निकलें और कमजोर उड़ान की मांसपेशियों के विकास में परिणाम होगा. Hemolymph उभरने करता है, तो प्रक्रिया को रोकने और प्यूपा 24 घंटा फिर इलेक्ट्रोड डालने के लिए प्रयास करने से पहले ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रविष्टि साइट वें साफ किया जाना चाहिएoroughly सभी विंग बाल का इलेक्ट्रोड प्यूपा में डाला जाता है पहले. इस प्रविष्टि छेद में प्रवेश करने और इलेक्ट्रोड ऊतक इंटरफेस के साथ हस्तक्षेप से बाल रोकता है.

वयस्क कीट में इष्टतम विंग स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए, प्रविष्टि साइट चिमटी का उपयोग विंग बाल का eclosion पहले दिन फिर से साफ किया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह अगले दिन होने वाली eclosion की सहायता के लिए चमड़े के नीचे सुई के साथ छिन्न गया था कि छल्ली खिड़की के किनारों को ढीला करने के लिए चिमटी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. किसी भी गोंद या hemolymph छल्ली खिड़की के किनारों के निकट सूख गया है, तो कीट eclosion के बाद अपने पंख बढ़ नहीं कर सकेंगे और यह नमूना प्रयोगों के लिए उपयोगी नहीं होगा.

सम्मिलन टाइम्स दिनों में दिए जाते हैं रूपांतरित विकास के समय poikilotherms के लिए पालन तापमान के एक समारोह के रूप में, इन थोड़ा भिन्न हो सकते हैं. उपलब्ध कराई दिनों आरटी में पाला कीड़ों के लिए कर रहे हैं. एक मानक 25 ° हैं; सी insectary इनक्यूबेटर प्रयोग किया जाता है, विकास लगभग 10-20% तेजी से हो जाएगा और प्रविष्टि टाइम्स के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है.

इस अध्ययन की एक सीमा है कि तेजी से prototyped एबीएस प्लास्टिक उत्तोलन फ्रेम से सेटअप करने के लिए शुरू की घूर्णी जड़ता होगा. एक कीट के द्रव्यमान के बारे में 4 ग्राम है, जबकि फ्रेम की बड़े पैमाने पर करने के लिए 200 ग्राम हो सकता है. एक electromagnetically उत्तोलित फ्रेम का उपयोग कर के लाभ के फ्रेम और एक सहायक संरचना के बीच घर्षण संपर्क का नुकसान हुआ है. हालांकि, एक अपेक्षाकृत भारी फ्रेम का उपयोग कीट परिक्रामी एलईडी पैटर्न के जवाब में रास्ते से हटना युद्धाभ्यास को पूरा करने के लिए अधिक ऊर्जा व्यय करने का कारण बनता है. इस अध्ययन में इस्तेमाल tethering फ्रेम के लिए एक संशोधन एक कम घने सामग्री और / या Inertial लोड को कम करने के लिए एक पतले फ्रेम निर्माण का उपयोग किया जा सकता है.

कायापलट दौरान विकासात्मक परिवर्तन कीड़े उड़ान भरने के लिए सीखने के लिए तंत्रिका इंजीनियरिंग के तरीकों के लिए नई क्षमताओं लाने.यह एक उल्लेखनीय टिप्पणी है कि वयस्क अवस्था सम्मिलन के लिए सम्मान के साथ क्रमशः समाप्त ऊतक प्रतिक्रियाओं में पोटा संबंधी चरणों के परिणाम के दौरान इलेक्ट्रोड प्रविष्टि. कीट locomotory व्यवहार पर कम से कम अल्पावधि प्रभाव के साथ एक उम्मीद के मुताबिक neuromuscular इंटरफ़ेस साकार इसलिए, जबकि आधारित फेंकना सम्मिलन, में या एक कीट पर सिंथेटिक प्रणालियों के यांत्रिक लगाव सुनिश्चित करते हैं. पिछले दो दशकों के दौरान, बहुत छोटे पैमाने पर मानव रहित हवाई वाहनों पर काम कर robotists कीट उड़ान द्वारा प्रेरित किया गया है. एक उपन्यास electrophysiological तकनीक को सक्षम करने के अलावा, फेंकना प्रक्रिया भी इसकी संवेदी और व्यवहार फिजियोलॉजी 8 नियंत्रित करने के लिए कीट की विद्युत उत्तेजनीय कोशिकाओं को तंत्रिका इंजीनियरों के लिए पहुँच प्रदान कर सकता है कि कीट मशीन इंटरफेस (आई एम आई) के लिए अनुमति देता है. यह "biobotically" वश में है और कीट हरकत को नियंत्रित करने के लिए एक संभावित है. इसलिए, इस आलेख में प्रस्तुत विशिष्ट पद्धति कीट उड़ान के अध्ययन के लिए उपयोगी है, लेकिन यह भी के लिए ही नहीं हैसंकर सेंटीमीटर पैमाने पर उड़ान के रूप में कीड़े domesticating 18 Biobots. इस तरह के एक संकर मंच का एक आवेदन मोबाइल पर्यावरण संवेदन प्रणालियों में कीड़े कन्वर्ट करने के लिए है. ये काम कर जानवरों के संभावित पर्यावरणीय जानकारी एकत्र करने और भंडारण के द्वारा सह साझा पारिस्थितिकी प्रणालियों की निगरानी में मनुष्य की सहायता कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

अटल बिहारी कृतज्ञता (1245680) साइबर शारीरिक प्रणालियों कार्यक्रम (1239243) के तहत और डिवीजन अंडर शिक्षा के वित्त पोषण के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन मानता है; और इस काम के पहले चरण के समर्थन के लिए डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट एजेंसी (DARPA). इस कार्य के पहले चरण कॉर्नेल विश्वविद्यालय के प्रोफेसर अमित लाल की प्रयोगशाला में अटल बिहारी द्वारा किया गया था. अटल बिहारी धन्यवाद उस स्तर पर प्रयोगात्मक मार्गदर्शन और विचार पीढ़ी के लिए Ayesa सिन्हा और प्रो लाल. Manduca sexta (लिनिअस 1763) अमरीका के ड्यूक विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग, डरहम, नेकां, द्वारा बनाए रखा एक कॉलोनी से प्राप्त किया गया. पतिंगे eclosion के 5 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया गया. हम उनके Neuroware प्रणाली के उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और उपयोग के लिए त्रिभुज Biosystems इंटरनेशनल, विशेष रूप से डेविड Juranas और कैटी Millay धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी प्रयोगों के दौरान उनकी मदद के लिए विल Caffey धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated stainless steel wire A-M Systems 791900 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire Litz or inductor wire can be used. 
Surface-mount FFC connector Hirose Connector FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers Grobet USA Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes Kimberly-Clark Worldwide 34155 Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape 5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle Becton Dickinson & Co. 30511 20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer Advanced Meditech International CH-HI CT2103 (tip) Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taubes, G. Biologists and engineers create a new generation of robotics that imitate life. Science. 288, (7), 80-83 (2000).
  2. Duch, C., Bayline, R. J., Levine, R. B. Postembryonic development of the dorsal longitudinal flight muscle and its innervation in Manduca sexta. Journal of Comparative Neurology. 422, (1), 1-17 (2000).
  3. Levine, R. B., Morton, D. B., Restifo, L. L. Remodeling of the insect nervous system. Current opinion in neurobiology. 5, (1), 28-35 (1995).
  4. Williams, C. M. Physiology of insect diapause: the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm Platysamia cecropia. Bio. Bull. 90, 234-243 (1946).
  5. Williams, C. M. The juvenile hormone. II. Its role in the endocrine control of molting, pupation, and adult development in the Cecropia silkworm. Bio. Bull. 121, 572-585 (1961).
  6. Bozkurt, A., Lal, A., Gilmour, R. Radio control of insects for biobotic domestication. 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering. 215-218 (2009).
  7. Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. In vivo electrochemical characterization of a tissue–electrode interface during metamorphic growth. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, (8), 2401-2406 (2011).
  8. Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Insect–machine interface based neurocybernetics. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56, (6), 1727-1733 (2009).
  9. Chapman, R. F. The Insects: Structure and Function. Cambridge University Press. (1998).
  10. Eaton, J. L. Morphology of the head and thorax of the adult tobacco hornworm, Manduca sexta (Lepidoptera:Sphingidae). I. Skeleton and muscles. Annals of the Entomological Society of America. 64, 437-445 (1971).
  11. Resier, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of Neuroscience Methods. 167, (2), 127-139 (2008).
  12. Dombeck, D. A., Reiser, M. B. Real neuroscience in virtual worlds. Current opinion in neurobiology. 22, (1), 3-10 (2011).
  13. Weir, P. T., Dickinson, M. H. Flying drosophila orient to sky polarization. Current Biology. 22, (1), 21-27 (2012).
  14. Ristroph, L., Bergou, A. J., et al. Discovering the flight autostabilizer of fruit flies by inducing aerial stumbles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, (11), 4820-4824 (2010).
  15. Strauss, R., Schuster, S., Götz, K. G. Processing of artificial visual feedback in the walking fruit fly Drosophila melanogaster. The Journal of experimental biology. 20, (9), 1281-1296 (1997).
  16. Lindemann, J., Kern, R., Michaelis, C., Meyer, P., van Hateren, J., Egelhaaf, M. FliMax, a novel stimulus device for panoramic and highspeed presentation of behaviourally generated optic flow. Vision Research. 43, (7), 779-791 (2003).
  17. Reiser, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of neuroscience methods. 167, (2), 127-139 (2008).
  18. Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Balloon-assisted flight of radio-controlled insect biobots. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56, (9), 2304-2307 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats