Frühe Metamorphic Insertion Technologie für Fluginsektenverhaltensüberwachung

1Department of Electrical and Computer Engineering, North Carolina State University
* These authors contributed equally
Published 7/12/2014
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Behavior

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Verderber, A., McKnight, M., Bozkurt, A. Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring. J. Vis. Exp. (89), e50901, doi:10.3791/50901 (2014).

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Abstract

Introduction

Einfügen von Elektroden, auch mit angehängten elektronischen Systemen, um Insekten zur telemetrischen Aufnahme-Anwendungen, hat eine große Methode, wie neuronale Systeme funktionieren bei Naturflug 1 zu verstehen. Der An-oder Einbau künstlicher Systeme in Insekten hat viele Herausforderungen, denen das Potenzial, die natürlichen Flug der Insekten stören gestellt. Oberflächliche Anhang oder chirurgische Einsetzen von künstlichen Plattformen im erwachsenen Insekt ist unzuverlässig wegen der möglichen Verschiebung der eingesetzten Geräte durch Körper-induzierte Trägheitskräfte und Stress verursacht werden. Oberflächlich angebracht oder chirurgisch eingeführt Elektroden anfällig für von den Insekten als Fremdkörper zurückzuweisen sind. Darüber hinaus ist die Implantation erfordert die Entfernung von Schuppen und Haufen rund um den Exoskelett. Der dicke Schuppenschicht muss auch für chirurgische Innervationen, die Sicherheiten Gewebeschäden führen können durchdrungen werden, was mit dem natürlichen Flug der Insekten stören. Alle tiese Faktoren können eine chirurgische oder oberflächliche Implantation eine schwierige und heikle Aufgabe zu machen. Um diese Bedenken in externes Anbringen Steuerung und Sensorsysteme für die Insekten beteiligt zu lindern, wird ein neues Verfahren mit metamorphen Wachstums in diesem Artikel beschrieben werden.

Die Entwicklung der metamorphen holometabolen Insekten beginnt mit der Umwandlung der Larve (oder Nymphe) in einen Erwachsenen mit einem Zwischenpuppenstadium (Abbildung 1). Die Metamorphose Prozess beinhaltet eine umfangreiche Neuprogrammierung Gewebe einschließlich Degeneration gefolgt von Umbau. Diese Transformation macht aus einem terrestrischen Larve zu einem erwachsenen Insekt demonstrieren mehrere komplexe Verhaltensweisen 2,3.

Das Überleben der Insekten nach extremen Parabiose Operationen hat sich gezeigt, wo die Operationen wurden in den frühen Stadien metamorphen 4,5 durchgeführt. Bei diesen Operationen, die Entwicklungs Histogenese caused Operationswunden in kürzere Laufzeiten repariert werden. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde eine neue Technik entwickelt, bei dem die Implantation von elektrisch leitenden Elektroden während der Anfangsphase der metamorphen Wachstum (Fig. 1) durchgeführt. Dies ermöglicht eine sichere Befestigung biomechanisch auf das Insekt 6. Eine sehr zuverlässige Schnittstelle ist auch mit neuronalen und neuromuskuläre Systeme 7 des Insekts gesichert. Diese Technik wird als "Early Metamorphosis Insertion Technology" (EMIT) 8 bekannt.

Nach dem Wiederaufbau der gesamten Gewebesystem, Strukturen in der Puppe gesteckt entstehen mit dem erwachsenen Insekt. Flugmuskelgruppen machen bis zu 65% der Gesamtkörpermasse thorakalen und somit ist eine relativ bequeme Zielscheibe für die EMIT Verfahren 9. Während der Grundflügelschlag, die Veränderungen in der Morphologie des Flugstromversorgung dorsolongitudinal (dl) und dorsoventraler (dv) Muskeln verursachen die Flügel articulatIonen-Geometrie, um den Auftrieb zu erzeugen 10. Deshalb ist die funktionelle Koordination von dl und dv Muskeln hat ein aktives Forschungsgebiet Neurophysiologie unter der Flug gewesen. Tethering Insekten in elektronisch programmiert visuelle Umgebungen wurde für die Untersuchung der Neurophysiologie von komplexen Bewegungsverhalten 11,12 die häufigste Methode. Zylindrische Arenen der Leuchtdiode Platten zusammengesetzt wurden für diese Virtual-Reality-Umgebungen, in denen fliegende Insekten sind in der Mitte angebunden und die Bewegung wird durch die dynamische Aktualisierung die umliegende Panorama-Sichtanzeige simuliert verwendet. Im Falle kleinerer Insekten, wie Fruchtfliege Drosophila wird Anbinden durch Anbringen eines Metallstift auf den dorsalen Thorax der Insekten und Platzieren des Stifts unter einem Dauermagneten 13,14 erreicht. Diese Methode erlaubt nur Quantifizierung der motorischen Reaktionen durch visuelle Beobachtungen mit Hochgeschwindigkeitskameras ohne elektrophysiologische Analysen. Darüber hinaus diese Method ist ineffizient, die größer und schwerer Körper von Manduca sexta auszusetzen. Um dieses Problem zu lösen, profitierten wir von magnetisch schwebende Bilder, bei denen geringes Gewicht Rahmen mit Magneten, ihre Unterseite angebracht werden durch elektromagnetische Kräfte schwebte. Wenn mit handelsüblichen neuronalen Verstärker und LED-Arrays kombiniert, bietet diese eine Plattform, um Flug-Motorleistung zu kontrollieren und erfassen die bezogene Elektrophysiologie des Manduca sexta.

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Protocol

HINWEIS: Die Quelle der Materialien und Reagenzien benötigt, um das Protokoll zu folgen ist in der "Reagenzien" Tabelle unten.

1. Vorbereitung Printed Circuit Boards (PCB) für die Aufnahme Elektrodenanschluss

HINWEIS: Um eine praktische experimentelle Verfahren bereitzustellen, werden Drahtelektroden auf eine Leiterplatte gelötet, um diese Elektroden in eine FFC (flexible Flachkabel)-Buchse steckt.

  1. Schneiden Sie ein 0.5x5 cm 2 Stück Kupfer verkleidet Laminat.
  2. Mit einer feinen Spitze Marker, ziehen drei 0.1x5cm 2 Rechteck Pads als Ätzen Maskenmustern.
  3. Ätzen des freiliegenden Laminat mit einem PCB-Ätzmittel in einem belüfteten Bereich oder Abzug. Decken Sie etwa 1 cm der Länge des Laminat Ausschnitt mit nicht-reaktiven Band. Füllen Sie einen Messbecher mit mindestens 100 ml PCB Ätzmittel und Band die Kupferlaminat Ausschnitt, um das Innere der Messbecher mit Klebeband. Die Hälfte der Kupferlaminat cutout ist in der PCB-Ätzmittel eingetaucht werden.
  4. Das Becherglas wird auf einer rotierenden Plattform 20 Minuten.
  5. Entfernen Sie den Ausschnitt aus dem Ätzmittel und legen Sie sie in einen Becher mit Wasser für 10 Minuten gefüllt.
  6. Mit einem Seidenpapier, gelten Isopropyl-Alkohol und entfernen Sie die Markierungen, die nicht geätzten Kupfer-Pads aus.
  7. Ca. 1 cm lange Schneiden Sie die Leiterplatte in kleinere Quadrate.
  8. Schneiden Sie zwei Stücke von beschichteten, geglüht, Edelstahldraht (0,11 "beschichtet, 0,008" nackte) mit einer scharfen Klinge auf Längen von jeweils 3 cm. Diese Stücke von rostfreiem Stahldraht sind die aktiven Elektroden, die in den Thorax der Insekten eingesetzt werden.
  9. Verwendung einer Klinge, entfernen 4-5 mm von der Kunststoffbeschichtung von jedem Ende jedes Drahtes. Verwendung eines Mikroskops wird empfohlen.
  10. Schneiden Sie ein 0,7 cm Stück isolierten Edelstahldraht, um ein Spitzenverlängerung für die Masseelektrode erstellen. Die Beschichtung zu entfernen Sie vorsichtig mit einem Messer oder schmelzen sie mit der Hitze eines Löten irauf, wie in Schritt 1.9 durchgeführt.
  11. Für die Masseverbindung, schneiden ein Stück flexibel (Litzen oder Induktivität) Draht auf eine Länge von 4,5 cm.
  12. Löten Sie das 0,7 cm Stück Edelstahl in Schritt 1.10 auf den Boden Anschlussdraht in Schritt 1.11, hergestellt. Eine freiliegende Stahlspitze sollte am Ende der Masseverbindung ist.
  13. Kleben Sie die vorbereitete Elektrodenplatte fest mit dem Löten Arbeitsbereich mit einem nicht-reaktiven Band. Verwenden Sie das Band an alle, aber 1-2 mm von den Pads auf der Leiterplatte, wo die Elektroden wird gelötet werden maskieren. Diese maskierten, lötfreie Ende der Pads in die in Schritt 4.1 beschrieben FFC Verbinder eingesetzt werden.
  14. Ausrichten der drei Elektrodenleitungen, so dass ein Ende jedes zu den entsprechenden Pads auf der Elektrodenplatte gelötet werden. Bewerben Edelstahl Fluss über die Elektroden-Pads für eine einfachere Löten.
  15. Löten jede der freiliegenden Elektroden auf den Pads.
  16. Die Elektroden tauchen in Aceton und Isopropylalkohol für 10 minjeweils um die Lotreste reinigen. Verwendung eines Ultraschallbades verbessert die Reinigungsleistung.

2. Chirurgische Insertion in die Manduca Sexta Puppen

HINWEIS: Die Insekten werden während der Übergänge zwischen Tag und Nacht aktiv sein. Daher sollte ein künstlicher Tag / Nacht-Zyklus innerhalb einer Insektenkammer mit Hilfe der automatischen Timer Steckdose eingerichtet werden. Diese sollte auf eine 7 Stunden und 17 Stunden dunkel Lichtzyklus zu simulieren.

  1. Untersuchen Sie die Manduca sexta Puppen täglich, eine geeignete Einführungszeit zu bestimmen. Die Puppen sind bereit zum Einsetzen ungefähr einen Tag, nachdem die Flügel weisen dunkle Flecken.
  2. Um die Puppen zu betäuben, legen Sie sie in den Kühlschrank (4C) für ca. 6 Stunden.
  3. Bereiten Sie die Einfügemarke Arbeitsbereich. Der Arbeitsbereich sollte Isopropyl-Alkohol, scharfe Pinzette, Messer, und eine 30 G Injektionsnadel gehören. Als Option können Cyanoacrylat-Klebstoff verwendet wird, um die Elektrode Fixierung zu verbessern.
  4. Sterilisieren Sie die Nadel, Pinzette, und die Elektroden, die durch Eintauchen in oder Abwischen mit Isopropyl-Alkohol.
  5. Entfernen Sie die Puppe aus dem Kühlschrank und überträgt es auf den Arbeitsbereich.
  6. Bestimmen Sie den Speicherort auf den Brustkorb, die zum Muskelgruppe von Interesse entspricht. Der Schwerpunkt der Arbeit in diesem Beispiel ist die dorsoventraler Muskeln für Flügel Aufschlag Bewegung verantwortlich.
  7. Mit einem scharfen Messer vorsichtig kratzen ein 1x1 cm 2 Rechteck durch die exocutical Schicht. Mit der Pinzette langsam ablösen diese Stücke.
  8. (Optional) Verwenden Sie einen Staubsauger an Flügel Haar von der freigelegten Bereich des Brustkorbes zu entfernen.
  9. Sie die Nadel langsam ca. 5 mm in die mesothorax wo die Flügel zu befestigen, um den Brustkorb zu beiden Punkten gezielt den Muskelgruppe zu erstellen.
  10. Mit einer Pinzette, führen die beiden Aufzeichnungselektroden in die beiden Einstichstellen.
  11. (Optional) Zur Verbesserung der mechanischen Festigkeit, reinigen Sie die Haare um die Elektrodenund großzügig Cyanacrylatklebstoff anwenden um jeden Einfügemarke auf den Brustkorb mit einem Draht-Applikator.
  12. Bereiten Sie einen Käfig für Entstehung mit der richtigen Material (rau und texturierte), die die Wände und die Decke, so dass die Insekten können beim Austritt klettern. Perforierte Kartonschachteln oder Packpapier verwendet werden.
  13. Bereiten Sie eine starre Fixierung Stick mit etwa 6 cm Länge und 2 mm Durchmesser. Rührstäbchen, einem Wattebausch oder Metalldrähte können für diesen Schritt verwendet werden.
  14. Schieben Sie diesen Stick durch das Loch unter dem vorstehenden Rüssel.
  15. Fix beide Seiten der Stick auf den Käfig Fläche, so dass die Puppe kann nicht wälzen. Positionieren Sie die Puppe im Inneren des Käfigs, so dass die mesothorax nach oben zeigt. Umfangreiche Bewegung kann zu Schäden an der Elektrode, Verlust von Hämolymphe verursachen, oder machen das Einsetzen nutzlos.

3. Einsetzen der Masseelektrode in Manduca Sexta

HINWEIS: Der Boden (sieheReferenzelektrode) sollte in den Bauch oder distalen Teile des Thorax eingeführt werden, um die Signalkopplung zu vermeiden. Diese Einführung kann entweder während der späteren Stadien der Puppenentwicklung oder nachdem der Insekten hervor erfolgen. Das Fenster für die Masseelektrode im Puppenstadium entweder für einen Erwachsenen oder Puppenstadium Masseelektrode Insertion hergestellt werden.

  1. Für Puppenstadium Einfügen: nach dem Schälen der mesothorakalen Nagelhaut um den aktiven Elektrode (siehe Schritt 2.7), kratzen ein weiteres Rechteck durch die exocutical Schicht auf der dorsalen Abdomen in der Nähe des Thorax (ca. 0.5x0.5 cm 2) mit der 30 G Injektions Nadel. Legen Sie die Masseelektrode in dieses Fenster mit dem im Abschnitt 2 beschriebenen Technik.
  2. Für die Stufe Masseelektrode Einsetzen Erwachsenen: einmal das Insekt hat sich gezeigt, legen Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C für 6 bis 24 Stunden zu immobilisieren.
    Die restlichen Schritte sind die gleichen für beide Puppen und erwachsenen Stadium Insertionen.
  3. Bereiten Sie die Insertion tion Arbeitsbereich einschließlich Isopropyl-Alkohol, scharfe Pinzette, einer 30 G Injektionsnadel, Sekundenkleber, ein Stück Draht zum Auftragen von Leim, einer thermischen cauterizer (optional) und einem Dentalwachs-Stick (optional).
  4. Suchen Sie eine Einfügemarke etwa 1-2 cm von der Aufzeichnungselektroden entlang der hinteren Bauch.
  5. Sie die Nadel langsam, um den Bauch zu punktieren und bieten eine Einführungsstelle.
  6. Mit einer Pinzette die Masseelektrode vorsichtig in die Einstichstelle und Druck ausüben, bis sie 3-4 mm tief ist. Halten Sie die Elektrode an Ort und Stelle und mit einem Draht zu kleben rund um die Einstichstelle bewerben.
  7. (Optional) Zur Verbesserung der mechanischen Festigkeit, verwenden Sie die thermische cauterizer und sammeln eine kleine (2-3 mm) Perlen aus Wachs an der Spitze. Setzen Sie die Spitze in der Nähe der Einstichstelle und erwärmen, so dass das Wachs umgibt die Elektrode und hält es fest sitzt.

4. Vorbereitung der Adapterkarte

NHALT ">. HINWEIS: Ein Adapterplatte wird benötigt, um die Elektrodenplatte mit dem drahtlosen Aufnahme heads durch eine FFC (Flexible Flachbandkabel)-Anschluss verbinden Dazu ein Brett ähnlich der Elektrodenplatte muss durch folgende Schritte vorbereitet werden 1,1 bis 1,7 .

  1. Löten Sie einen FFC-Stecker an einem Ende der vorbereitet Bord.
  2. Löten drei 30 AWG (American Wire Gauge) anschließen Drähte zu drei Pads auf der anderen Seite.
  3. Löten drei Mini-Anschlüsse zu den drei Kontaktstellen auf der Adapterplatine für die Oszilloskop-Messwerte als in der nächsten Stufe beschrieben.
  4. Löten Sie das andere Ende dieser drei Drähte an der heads Anschluss.
  5. Sichern Sie die headsLeiterPlatte, auf der Oberseite des Schweberahmen.

5. Voraufzeichnung mit Oszilloskop (Optional)

HINWEIS: Um die Zuverlässigkeit der Elektroden zu beurteilen und beobachten das Signal-Rausch-Verhältnis, Fessel Oszilloskop-Aufnahmen können vor der Bereitstellung der wirel erhalten werdeness Aufzeichnungssystem. Die Mini-Draht-Anschlüsse auf der Adapterplatine sollte dafür verwendet werden.

  1. Schließen Sie das Oszilloskop an einen extrazellulären neuronalen Aufzeichnungsverstärker. Einstellen der Parameter des Verstärkers an eine Hochpass-Grenzfrequenz von 1 Hz, einen Tiefpass-Grenzfrequenz von 20 kHz und einer Verstärkung von 100.
  2. Schließen Sie jede der weiblichen Mini-Draht-Anschlüsse auf der Adapterplatine mit den Verstärkereingangskanäle.
  3. Entfernen Sie das Insekt mit der implantierten Elektrodenplatte aus dem Käfig, wenn es in einem aktiven Zustand (während der Morgendämmerung Zeit). Legen Sie ein Stück Seidenpapier unter der Insekten für sie zu ruhen, bevor Messungen vorgenommen werden.
  4. Mit einer Pinzette, schieben Sie die Elektrodenplatte in die FFC-Rezeptor auf der Adapterplatine. Beachten Sie eine flache und Niederspannungsausgangs, wenn das Insekt ruht und die Erzeugung von Elektromyogramm (EMG) Spikes als das Insekt mit den Flügeln schlägt.
    HINWEIS: Siehe Abschnitt 6: Beobachten Insektenflug mit dem Wireless-Aufnahmesystem für representative Oszilloskop Ergebnisse.
  5. Anpassen der Anzeigeparameter des Oszilloskops nach Bedarf. Erfassen Sie die Daten auf dem Oszilloskop und speichern Sie die Daten.

6. Observing Insect Flug mit dem Wireless-Aufnahmesystem

HINWEIS: Eine elektromagnetische Schwebeplattform kann für die drahtlose Erfassung von EMG-Signale während Manduca sexta Fesselflug gebaut werden. Die Schwebeplattform besteht aus einem Rahmen ausgebildet, um einen Halteseilmechanismus auszugleichen. Das ermöglicht es dem Schweberahmen und damit das Insekt, bei der Prüfung ohne den Zwang Anbinden Drähte Gieren. Der Rahmen kann Rapid-Prototyp mit einem Fused Deposition Modeling (FDM)-Maschine. Ein Magnet muss an der Unterseite dieser Rahmen durch eine Reihe von Magneten in der Basisplattform Schwebe werden angebracht werden. Das Insekt an dem FFC Verbinder von der Oberseite des Rahmens aufgehängt ist. Diese schwebenden Plattform innerhalb der LED-Arena, die usin gebaut wurde entfernt60 g Platten einer Anordnung von 5x7 einzelnen LEDs zusammengesetzt. Dieses System wurde auf bewährte Methoden für die Entwicklung einer Umgebung für visuelle Stimulation von Fruchtfliegen, 15, 16, 17 basiert. Die Arena ist von einem Mikrocontroller so Simulation sowohl im Uhrzeigersinn und entgegen dem Uhrzeigersinn eine Drehung sowie Steuerung der Drehgeschwindigkeit gesteuert.

  1. Richten Sie die WLAN-Aufzeichnungssystem, indem Sie den heads auf der Adapterplatine Anschluss auf der Schwebeplattform.
  2. Entfernen Sie die Insekten aus dem Käfig, wenn es in einem aktiven Zustand vorzugsweise während der Dämmerung der Zeit.
  3. Mit einer Pinzette vorsichtig die Elektrodenplatte einfügen in die FFC-Rezeptor auf der Schweberahmen, so dass das Insekt fest im Setup eingestellt.
  4. Setzen Sie den Magnetstab in der Nähe der Magnetschalter an der heads um drahtlose Datenübertragung zu aktivieren. Ein blaues Licht auf die anzeigt, dass die heads aktiv ist gekommen.
  5. Schalten Sie das Licht in derRaum für völliger Dunkelheit. Eine rote Lampe kann verwendet werden, um Licht in den Raum hinzuzufügen. Öffnen Sie die Telemetriedatenerfassungs-Software auf einem Computer und wählen Sie die entsprechende Konfigurationsdatei vorgespannten, wenn vorgesehen ist. Starten Sie die Datenerfassung, um die Betrachtung Signale beginnen.
  6. Wählen Sie das entsprechende Benutzerschnittstelle zur Beobachtung der EMG-Signale auf dem Wireless-Aufzeichnungssystem, eine zuverlässige drahtlose Verbindung und Elektroden Betrieb zu gewährleisten.
  7. Schalten Sie alle LED Arena Komponenten: Geregelte Gleichstromversorgung und Mikrocontroller. Der Mikrocontroller kann die Umdrehungen pro Minute der zyklischen Lichtmuster einstellen und kann auch die Richtung des Lichtdreh steuern.
  8. Langsam Gleichgewicht der Schwebeplattform in der Arena. Ausrichten des Rahmens über der Mitte des Schwebebasis sorgfältig, da sonst der Rahmen wird schnell auf den Boden gezogen werden, möglicherweise Verletzungen des Insekts.
  9. Starten Sie die Videoaufzeichnungssystem.
  10. Wählen Sie die entsprechende Registerkarte Aufnahme der SoftwareSchnittstelle. Bestimmen Sie die Aufnahmezeit und Dateispeicherziel. Wählen Sie die entsprechenden Ausgabe-Einstellungen, um die Daten zu speichern. Klicken Sie auf die Start-Taste, um eine Aufnahme-Session in der Software initiieren. So sparen Sie die Datendatei, die in numerische Rechenumgebungen importiert werden kann.
  11. Beobachten, wie das Insekt fliegt in der Richtung, die mit der Bewegung der LEDs entspricht. Kehren Sie die Richtung der LEDs und bestätigen, dass die Insekten die Richtung umkehrt. Führen Sie dies so oft wie gewünscht.

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Representative Results

Eine schematische Darstellung der Gesamt EMIT-Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt, welche die Hauptphasen des hawkmoth der metamorphen Zyklus und den entsprechenden Elektrodeneinführungsschritte. Das Einsetzen der Elektrode sollte in den späten Puppenstadium 4 bis 7 Tage vor dem Schlüpfen durchgeführt werden. Dadurch können die Muskelfasern um die Elektroden zu entwickeln und zu sichern, das Implantat im Insekt.

Das typische Ergebnis einer abgeschlossenen spät Einsetzen Puppen wo die beiden aktiven Elektroden und die Masseelektroden eingefügt wurden, ist in Fig. 2 gezeigt.

Das typische Ergebnis einer abgeschlossenen erwachsenen Stadium Einsetzen in denen die beiden aktiven Elektroden und der Masseelektrode eingesetzt wurden, ist in Fig. 3 gezeigt.

Die LED-Arena verwendet werden, um zu induzieren Drehen während des Fluges für die Manduca sexta ist in Abbildung 4 dargestellt. Ein Mikrocontroller wso programmiert ist, um die Kontrolle über die Drehgeschwindigkeit der LED-Anordnung vertikale Muster ermöglichen. Die Winkelgeschwindigkeit der LED-Muster wurde auf 7,3 Grad pro Sekunde eingestellt. Magnetschwebeplattform in der Mitte des LED-Arena, damit das Insekt frei in Reaktion auf das LED-Array angeordnet drehen.

Figur 5 zeigt die Muskelpotential-Signal vor und nach dem Flügelschlagen der dorsoventralen Muskeln mit dem Oszilloskop erfasst. Das Signal mit 100 mal Verstärkung und ein Hochpassfilter von 1 Hz und einem Tiefpassfilter von 20 kHz verarbeitet. In der Ruheperiode, werden keine Muskelpotentiale beobachtet. Die Muskelpotentiale beim Flügelschlagen treten bei ca. 15 Hz-20Hz.

Figur 6 zeigt die Muskelpotential-Signal vor und nach der Flügelschlagen der drahtlosen Instrumentierung erfasst. In der Ruheperiode, werden keine Muskelpotentiale beobachtet. Die Muskelpotentiale durten Flügelschlagen treten bei ca. 15 Hz-20 Hz.

Figur 1
Fig. 1 ist. EMIT Verfahren. Ein schematisches Diagramm des Verfahrens EMIT auf Manduca sexta ausgeführt, wie in dem Protokoll beschrieben.

Figur 2
Abbildung 2. Pupa Insertion. Fotografie einer späten Phase unmittelbar nach der Puppe die Aufzeichnungselektroden wurden mit EMIT eingefügt.

Fig. 3
Abbildung 3. Moth Entstehung. Fotografie eines erwachsenen Falter mit implantierten Elektroden eine AufnahmeN ach dem Schlüpfen.

Fig. 4
Abbildung 4. Recording Setup. Die Magnetschwebeplattform und LED-Arena verwendet werden, um EMG-Signale von Manduca sexta Flugmuskeln aufzeichnen. Hier eine Manduca sexta führt eine Giermanövers in Reaktion auf die umlauf LE Muster.

Figur 5
Abbildung 5. Oszilloskop EMG. Ein 2,5 sec EMG Aufzeichnung einer dorsoventralen Muskeln mit der Benutzung einen Verstärker und ein Oszilloskop.

Fig. 6
Abbildung 6. Wireless-EMG. 1,9sec EMG Aufzeichnung der Muskel dorsoventraler über die drahtlose headsAufzeichnungsEinheit und Datenerfassungssoftware.

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Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der chirurgischen Insertion der Aufzeichnungselektroden, die die Fähigkeit, Daten in den späteren Schritten des Protokolls aufzunehmen beeinflussen. Die Aufzeichnungselektroden sollten in der Puppe einen Tag nach der ausstellenden Flügel Flecken auf seiner dorsalen Seite eingefügt werden. Wenn das Einsetzen von zwei oder mehr Tage nach diesem Zeitpunkt durchgeführt wird, wird das Insekt die Gewebe nicht genug Zeit, um sich zu entwickeln und stabilisieren die Elektroden eingesetzt. Dies könnte zu einer Bewegung der implantierten Elektroden und unzuverlässig Aufnahmen im erwachsenen Stadium führen.

Es ist wichtig, die Aufzeichnungselektroden in die Puppenflugmuskeln in einer Tiefe von mehr als 5 mm einzusetzen. Andernfalls wird die Hämolymphe Einstichstellen verlassen und führen in der Entwicklung der schwächeren Flugmuskeln. Wenn Hämolymphe nicht auftauchen, stoppen Sie den Vorgang und lassen die Puppe 24 Stunden, bevor Sie versuchen, die Elektroden wieder einfügen zu erholen. Die Einstichstelle sollte th gereinigt werdenoroughly aller Flügel Haare vor die Elektroden in der Puppe eingeführt wird. Dies verhindert das Eindringen von Haaren die Einführungslöcher und Störung der Elektrodengewebeoberfläche.

Um eine optimale Gesundheit Flügel in der erwachsenen Falter zu gewährleisten, sollte die Einstichstelle der Flügel Haare am Tag vor dem Schlüpfen mit einer Pinzette wieder gereinigt werden. Darüber hinaus ist es empfehlenswert, Pinzette, um die Kanten der Kutikula Fenster, die mit der Injektionsnadel eingeschnitten wurde, um das Schlüpfen am folgenden Tag auftritt unterstützen lösen. Wenn ein Klebstoff oder Hämolymphe wurde in der Nähe der Ränder der Nagelhaut Fenster getrocknet, werden die Motte nicht in der Lage, seine Flügel nach dem Schlüpfen aufzublasen und dieses Exemplar nicht nützlich für Experimente sein.

Obwohl die Einführungszeiten in Tagen angegeben, können diese leicht variieren, wie die Zeitleiste der metamorphen Entwicklung ist eine Funktion der Temperaturen für die Aufzucht poikilotherms. Die Tage sind vorgesehen für Insekten in RT aufgezogen. Wenn ein Standard-25 °, C Insektarium Inkubator verwendet wird, wird die Entwicklung in etwa 10-20% schneller sein, und die Einfügung Zeiten müssen entsprechend angepasst werden.

Eine Einschränkung dieser Studie würde die Rotationsträgheit auf das Setup durch die schnelle Prototyp ABS-Kunststoff Schweberahmen eingeführt werden. Die Masse des Rahmens bis zu 200 g betragen, während die Masse eine Motte etwa 4 Gramm. Der Vorteil der Verwendung eines elektromagnetisch levitierten Rahmens ist der Verlust der Reibungskontakt zwischen dem Rahmen und einer Tragkonstruktion. Jedoch verursacht die Verwendung eines relativ schweren Rahmen das Insekt, mehr Energie zu verbrauchen, um Giermanöver in Abhängigkeit von der umlaufenden LED-Muster zu vervollständigen. Eine Änderung der Anbindung Rahmen in dieser Studie verwendet könnte die Verwendung eines weniger dichten Material und / oder den Aufbau einer dünner Rahmen, um die Trägheitsbelastung zu reduzieren.

Die entwicklungsbedingten Veränderungen während der Metamorphose mit neuen Funktionen auf neuronale Engineering-Methoden zu lernen, wie Insekten fliegen.Es ist eine bemerkenswerte Beobachtung, dass das Einsetzen der Elektrode in den Puppenstadien ergibt gelindert Gewebereaktionen bezüglich der erwachsenen Stadium Insertionen. Deshalb emittieren basierend Insertionen gewährleisten mechanische Befestigung von Kunststoffsystemen in oder auf ein Insekt, während die Realisierung einer vorhersehbaren neuromuskuläre Schnittstelle mit minimalem kurzfristige Wirkung auf Insekten Bewegungsverhalten. In den letzten zwei Jahrzehnten haben robotists Arbeit an sehr kleinen Maßstab unbemannte Luftfahrzeuge durch Insektenflug inspiriert. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige elektrophysiologische Technik ermöglicht EMIT Verfahren auch bei Insekten-Maschine-Schnittstellen (IMI), die den Zugang für neuronale Ingenieure zu den elektrisch erregbaren Zellen des Insekten seine sensorischen und Verhaltensphysiologie 8 steuern kann. Dies hat das Potenzial, "biobotically" zähmen und steuern Insektenfortbewegung. Daher ist die spezifische Methode in diesem Artikel nicht nur nützlich für die Untersuchung der Fluginsekten, sondern auch fürdomestizieren Insekten als Hybridzentimeterbereich Flug BioBots 18. Eine Anwendung einer solchen Hybrid-Plattform ist, um Insekten in mobile Umweltsensorsysteme konvertieren. Diese Arbeits Tiere können möglicherweise helfen Menschen bei der Überwachung der gemeinsamen Zusammenarbeit Ökosysteme durch das Sammeln und Speichern von Umweltinformationen.

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Acknowledgements

AB dankt der National Science Foundation für die Förderung im Rahmen der Cyber-Physical Systems Programm (1239243) und Division of Undergraduate Education (1245680); und der Defense Advanced Research Project Agency (DARPA) für die Unterstützung der frühen Phasen dieser Arbeit. Die früheren Stadien dieser Arbeit wurde von Prof. AB in Amit Lal Labor an der Cornell University durchgeführt. Dank AB Ayesa Sinha und Prof. Lal für experimentelle Beratung und Ideenfindung in diesem Stadium. Manduca sexta (Linnaeus 1763) wurden aus einer Kolonie von der Abteilung für Biologie an der Duke University, Durham, NC, USA gepflegt erhalten. Motten wurden innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen verwendet. Wir möchten Triangle Biosystems International, vor allem David Juranas und Katy Millay für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung und Nutzung ihrer Neuroware System danken. Wir möchten auch an Will Caffey für seine Hilfe während der Experimente danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated stainless steel wire A-M Systems 791900 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire Litz or inductor wire can be used. 
Surface-mount FFC connector Hirose Connector FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers Grobet USA Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes Kimberly-Clark Worldwide 34155 Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape 5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle Becton Dickinson & Co. 30511 20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer Advanced Meditech International CH-HI CT2103 (tip) Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.

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References

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